超聲輔助三相分配法同步提取大蒜中大蒜辣素和多糖的工藝優(yōu)化

史繼童，孫 羽，姜欣洋，劉蘭玲，顏培正，李 佳，蒲高斌，趙東升

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南 250355）

大蒜（Allium sativumL.）為蔥科或廣義百合科蔥屬草本植物[1]，地下鱗莖為藥食兩用資源，性溫，味辛，富含大蒜辣素、多糖、蒜氨酸等多種活性成分[2-3]，大蒜辣素是大蒜中最主要的活性成分，多糖含量最大，約占鮮蒜質(zhì)量的26%～30%，二者具有高效的抗菌、抗癌、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性等藥理作用[4-6]。

目前國(guó)內(nèi)外研究多集中對(duì)大蒜中大蒜辣素或多糖的單一成分提取[7-9]，而鮮有同步提取兩種活性成分的工藝研究。若能對(duì)大蒜中大蒜辣素和多糖進(jìn)行同步提取，不僅可以提高大蒜資源的利用率，且降低成本，將產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效益。三相分配體系（threephase partitioning，TPP）是一種簡(jiǎn)易的新型分離技術(shù)，可以將從動(dòng)植物中提取的組分分配在三相中實(shí)現(xiàn)選擇性分離，即上相（油脂及脂溶性物）、中相（蛋白質(zhì)）和下相（多糖類等水溶性物質(zhì)）[10]，已有學(xué)者利用三相分配體系提取多糖、蛋白質(zhì)、油脂等天然活性成分[11-14]。大部分TPP 體系由叔丁醇、硫酸銨和粗水提取液（或懸浮液）組成。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）為水溶性非離子聚合物，與叔丁醇相比具有無(wú)毒性、生物相容性等優(yōu)點(diǎn)[15]，已被廣泛應(yīng)用于新型TPP 體系中，并有研究報(bào)道稱聚乙二醇可以大大提高大蒜中蒜酶催化反應(yīng)中的穩(wěn)定性[16]。

因此，本研究以聚乙二醇為有機(jī)相，硫酸銨為水相，采用超聲輔助三相分配法同步提取大蒜中大蒜辣素和多糖，通過(guò)單因?qū)嶒?yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，并對(duì)上相大蒜辣素提取液的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，為大蒜資源的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)和綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大蒜 山東省濟(jì)南市長(zhǎng)清區(qū)當(dāng)?shù)爻?，? ℃冰箱保存?zhèn)溆?；L-半胱氨酸（純度大于99%）、5,5′-二硫代雙（DTNB，純度大于98%）、濃硫酸（純度大于98%）、聚乙二醇4000、硫酸銨、Hepes、苯酚 上海麥克林生化科技有限公司。

KQ-500GVDV 雙頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；ST 16R 高速離心機(jī) 賽默飛世爾科技有限公司；UV 9100 B 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大蒜辣素和多糖的同步提取

1.2.1.1 樣品預(yù)處理 參考關(guān)明等報(bào)道方法[17]，取適量新鮮大蒜，去皮，用蒸餾水洗凈，晾干鱗莖，用組織搗碎機(jī)搗碎成蒜漿，置40 ℃水浴10 min。

1.2.1.2 三相分配法提取大蒜辣素和多糖 參照Yan 等[11]報(bào)道并稍做修改。將聚乙二醇和硫酸銨按一定質(zhì)量比例置于離心管中，加入蒜漿5.0 g，固定體系質(zhì)量為25 g，剩余質(zhì)量用蒸餾水補(bǔ)足。在一定條件超聲提取，過(guò)濾，6000 r/min 離心10 min，得到TTP 體系。分別取上、下相提取液以蒸餾水稀釋并定容至25 mL 容量瓶，用于測(cè)定大蒜辣素和多糖提取量。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 為了確定超聲輔助三相分配法同步提取大蒜中大蒜辣素和多糖的工藝優(yōu)化參數(shù)范圍，在前期預(yù)試驗(yàn)和文獻(xiàn)報(bào)道[18]的基礎(chǔ)上，固定超聲頻率45 kHz 和功率350 W，選取PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲時(shí)間為主要工藝參數(shù)進(jìn)行研究。

1.2.2.1 不同硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)大蒜辣素和多糖提取量的影響 稱取5.0 g 蒜漿5 份，設(shè)置硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12%、15%、18%、21%、24%，在PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%、超聲時(shí)間為40 min、超聲溫度為30 ℃條件下提取，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值計(jì)算大蒜辣素和多糖提取量。

1.2.2.2 不同PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)大蒜辣素和多糖提取量的影響 稱取5.0 g 蒜漿5 份，設(shè)置PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為14%、19%、24%、29%、31%，在硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%、超聲時(shí)間為40 min、超聲溫度為30 ℃條件下提取，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值計(jì)算大蒜辣素和多糖提取量。

1.2.2.3 不同超聲溫度對(duì)大蒜辣素和多糖提取量的影響 稱取5.0 g 蒜漿5 份，設(shè)置超聲溫度分別為10、30、50、70、80 ℃，在PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，超聲時(shí)間為40 min 條件下提取，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值計(jì)算大蒜辣素和多糖提取量。

1.2.2.4 不同超聲時(shí)間對(duì)大蒜辣素和多糖提取量的影響 稱取5.0 g 蒜漿5 份，設(shè)置超聲時(shí)間為10、40、70、100、130 min，在PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%、超聲溫度為30 ℃條件下提取，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值計(jì)算大蒜辣素和多糖提取量。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)大蒜辣素和多糖提取量影響顯著的三個(gè)因素為Box-Behnken 試驗(yàn)的自變量，以大蒜辣素和多糖提取量為響應(yīng)值，優(yōu)化提取工藝。因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Response surface factor level design

1.2.4 大蒜辣素提取液穩(wěn)定性的考察 由于大蒜辣素化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光、熱分解成各種含硫化合物[19]，因此在Design-Expert 8.0.6 軟件優(yōu)化的最佳工藝條件下，考察大蒜辣素提取液在室溫放置0、2、4、6、8、10 h 后，大蒜辣素提取液的穩(wěn)定性。

1.2.5 大蒜辣素和多糖提取量的測(cè)定 由于生長(zhǎng)環(huán)境、氣候等因素導(dǎo)致不同產(chǎn)地和采收期大蒜含水量差異較大，本研究以干燥品計(jì)算大蒜辣素和多糖的提取量[20]。

1.2.5.1 大蒜辣素提取量的測(cè)定 取5.0 mL Hepes緩沖液（pH7.5）配制的10 mmol/L 半胱氨酸溶液，加入1.0 mL 上相提取液，混合均勻，26 ℃水浴靜置15 min，取1.0 mL 稀釋100 倍；取4.5 mL 稀釋后的反應(yīng)混合液與0.5 mL 用Hepes 緩沖液（pH7.5）配制濃度為1.5 mmol/L 的 DTNB 溶液，混合均勻，26 ℃水浴靜置15 min，在412 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度值（A）[21]。按上述操作步驟加1.0 mL 去離子水測(cè)量半胱氨酸溶液未與上相提取液反應(yīng)的初始吸光度值（A0）。

其計(jì)算公式如下：

式中：c 為大蒜辣素物質(zhì)的量濃度（mmol/mL）；A0為半胱氨酸溶液的初始吸光度值；A 為半胱氨酸溶液與上相提取液反應(yīng)后的吸光度值；β為半胱氨酸溶液的稀釋倍數(shù)；14150 為摩爾消光系數(shù)。

式中：Y1為大蒜辣素提取量（mg/g）；V 為上相提取液總體積（mL）；M 為大蒜辣素的分子量；m 為蒜漿的質(zhì)量（g）。

1.2.5.2 多糖提取量的測(cè)定 多糖的提取量用苯酚-硫酸法測(cè)定[22]。以葡萄糖的濃度C（g/L）和吸光度A 為X、Y 軸，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=89.235C+0.0771（r=0.9989）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多糖在下相中的提取量。

式中：Y2為多糖提取量（mg/g）；C 為按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到的多糖質(zhì)量濃度（g/L）；V 為下相提取液總體積（mL）；N 為下相提取液稀釋倍數(shù)；m 為蒜漿的質(zhì)量（g）；103為單位轉(zhuǎn)換。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次平行測(cè)定的平均值。使用軟件Excel、SPSS 26.0、Design-Expert 8.0.6 分析數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 8 繪圖。在單因素方差分析（ANOVA）之后，進(jìn)行事后Turkey HSD 檢驗(yàn)，方差分析中P＜0.05 表明具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)大蒜辣素提取量和多糖提取量的影響 由圖1可知，在固定相同提取條件下，隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，上相中大蒜辣素的提取量先呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，這與前期報(bào)道現(xiàn)象一致[23]，可能由于體系中硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加時(shí)，會(huì)與PEG 爭(zhēng)奪體系中的水分子，使大蒜辣素在上相的含量減少，導(dǎo)致提取量下降。當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)18%后，提取量顯著下降（P＜0.05）。下相中多糖的提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，由于硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，鹽溶效應(yīng)不斷增強(qiáng)，下相水合能力增強(qiáng)從而吸水能力增強(qiáng)，加強(qiáng)了多糖在下相的析出作用[24]，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，影響多糖結(jié)構(gòu)表面的疏水性，改變了上下兩相體積比和分配系數(shù)，從而使得提取量降低[25]。由于硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%～21%時(shí)多糖提取量變化不顯著（P＞0.05），綜合考慮，選擇硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%作為后續(xù)提取條件。

圖1 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)大蒜辣素和多糖提取量的影響Fig.1 Effects of ammonium sulfate concentration on extraction efficiency of allicin and polysaccharides

2.1.2 不同PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)大蒜辣素和多糖提取量的影響 由圖2可知，在固定相同提取條件下，隨著PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，上相中大蒜辣素的提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且在PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%時(shí)達(dá)到最大，且與其它PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在顯著性差異（P＜0.05）。下相中多糖的提取量呈下降的趨勢(shì)。由于PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不斷增加，TPP 體系的黏度增加，成相物質(zhì)分子之間空間位阻增大[26]，導(dǎo)致大蒜辣素和多糖在TPP 體系中分配減少，TTP 體系溶液黏度的增加不利于蒜漿的過(guò)濾分離，更不便于工業(yè)化生產(chǎn)。綜合考慮，選擇PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%作為后續(xù)提取條件。

圖2 PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)大蒜辣素和多糖提取量的影響Fig.2 Effects of PEG concentration on extraction efficiency of allicin and garlic polysaccharides

2.1.3 超聲溫度對(duì)大蒜辣素和多糖提取量的影響由圖3可知，在固定相同提取條件下，隨著超聲溫度的增大，上相、下相中大蒜辣素、多糖的提取量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。大蒜辣素和多糖的提取量分別在30 和70 ℃時(shí)達(dá)到最大。由于大蒜辣素在高溫下不穩(wěn)定，易分解，提取溫度在30 ℃之后，上相中大蒜辣素提取量顯著降低（P＜0.05）。同時(shí)隨著體系溫度過(guò)高，硫酸銨的水解程度越大，不利于大蒜辣素和多糖的提取。綜合考慮，選擇超聲溫度30 ℃作為后續(xù)提取條件。

圖3 超聲溫度對(duì)大蒜辣素和多糖提取量的影響Fig.3 Effects of sonication temperatures on extraction efficiency of allicin and polysaccharides

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)大蒜辣素和多糖提取量的影響由圖4可知，在固定相同提取條件下，隨著超聲時(shí)間的增大，上相、下相中大蒜辣素、多糖的提取量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。大蒜辣素和多糖的提取量分別在40 和70 min 時(shí)達(dá)到最大。隨著超聲時(shí)間的增加，大蒜辣素由于發(fā)生分解，而多糖由于長(zhǎng)時(shí)間處理破壞結(jié)構(gòu)導(dǎo)致提取量顯著降低（P＜0.05）[27]。綜合考慮，選擇超聲時(shí)間為40 min 作為后續(xù)提取條件。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)大蒜辣素和多糖提取量的影響Fig.4 Effects of sonication times on extraction efficiency of allicin and garlic polysaccharides

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸模型建立與方差分析 選用超聲時(shí)間（A）、超聲溫度（B）、聚乙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）為自變量，大蒜辣素提取量（Y1）和多糖提取量（Y2）為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2）。運(yùn)用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行擬合分析，結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

表2 響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis

由表3可知：回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），表明回歸方程模擬可靠，不存在失擬因素。大蒜辣素提取量與各因素的擬合方程為：Y1（大蒜辣素提取量）=3.55+0.25A+0.019B-0.018C-0.31AB-0.30AC+0.36BC-0.69A2-0.64B2-0.96C2。R2=0.9897，說(shuō)明該模型擬合度較好，數(shù)學(xué)模型穩(wěn)定，可以對(duì)不同提取條件下大蒜辣素提取量結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)。對(duì)各因素的P值和F值進(jìn)行綜合分析，A、AB、AC、BC、A2、B2和C2對(duì)大蒜辣素提取量的影響極具顯著性。影響主次因素為超聲時(shí)間（A）＞超聲溫度（B）＞聚乙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）。各交互因素中對(duì)大蒜辣素提取量影響程度最大的為BC，影響程度最小的為AC。

表3 大蒜辣素提取量回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model for allicin extraction

由表4可知：回歸模型顯著（P＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），表明回歸方程模擬可靠，不存在失擬因素。多糖提取量與各因素的擬合方程為：Y2（多糖提取量）=40.20+4.66A+2.39B-0.53C+2.64AB-0.26AC-0.17BC-4.16A2-1.11B2-0.87C2。R2= 0.8653，說(shuō)明該模型擬合度良好，數(shù)學(xué)模型穩(wěn)定，可以對(duì)不同提取條件下多糖提取量結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)。對(duì)各因素的P值和F值進(jìn)行綜合分析，A 和A2對(duì)多糖提取量的影響極具顯著性，B 的影響顯著。而各因素交互作用AB、AC、BC 的影響均不具有顯著性（P＞0.05）。影響主次因素為超聲時(shí)間（A）＞超聲溫度（B）＞聚乙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）。

表4 多糖提取量回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model for polysaccharide extraction

2.2.2 響應(yīng)曲面圖分析 根據(jù)多元回歸方程獲得不同處理因素影響大蒜辣素提取量的等高線圖（圖5）。等高線密集，形狀趨于橢圓且對(duì)應(yīng)的響應(yīng)曲面走勢(shì)陡峭，表明交互作用的響應(yīng)值的影響顯著。由此可知，超聲時(shí)間與超聲溫度、超聲時(shí)間與聚乙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和超聲溫度與聚乙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)大蒜辣素提取量的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

圖5 不同處理因素交互作用對(duì)大蒜辣素提取量的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour plots showing the interactive effects on extraction efficiency of allicin

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)Design-Expert 8.0.6 軟件分析優(yōu)化，預(yù)測(cè)在穩(wěn)定狀態(tài)下從大蒜中提取大蒜辣素、多糖最佳工藝條件為：PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23.7%，超聲溫度為34.7 ℃，超聲時(shí)間為51.2 min。此條件下大蒜辣素、多糖的提取量理論上可達(dá)3.489、42.132 mg/g。結(jié)合實(shí)際情況，將上述工藝條件修正為：PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%，超聲溫度為34 ℃，超聲時(shí)間為50 min。并以此條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，大蒜辣素、多糖提取量分別為3.564 mg/g（RSD=0.38%）、43.86 mg/g（RSD=0.57%），實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值十分接近，表明該模型有效可行，適用于大蒜辣素、多糖的同步提取。這與前期從大蒜中單獨(dú)提取大蒜辣素或多糖工藝研究[9,18,23]相比，TPP 法同步提取大大提高了提取效率，更能充分利用大蒜資源，具有極大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

2.3 大蒜辣素提取液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，大蒜辣素溶液在室溫放置下隨時(shí)間的延長(zhǎng)而提取量降低，大蒜辣素溶液在4 h 內(nèi)較為穩(wěn)定，無(wú)顯著性差異（P＞0.05），在4 h 后顯著降低（P＜0.05）。因此，用此種方法提取后需要在4 h 內(nèi)對(duì)大蒜辣素進(jìn)行測(cè)定或冷凍干燥處理保存。

表5 大蒜辣素提取液穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 5 Stability test of allicin capsaicin extract

3 結(jié)論

本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化三相分配體系同步提取大蒜中大蒜辣素和多糖，獲得的最佳提取工藝條件為：聚乙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)24%，超聲溫度34 ℃，超聲時(shí)間50 min，此條件下按干燥品計(jì)算大蒜辣素和多糖的提取量可達(dá)3.564、43.86 mg/g。三相分配體系與其他提取方法相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)，提取條件溫和，操作簡(jiǎn)便高效，不僅極大地保護(hù)了大蒜辣素的生物活性，又將多糖與蛋白質(zhì)分開(kāi)，獲得較高純度的多糖提取液，具有經(jīng)濟(jì)和綠色雙重效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)得到的最佳提取參數(shù)穩(wěn)定可行，為后續(xù)進(jìn)一步從大蒜中快速、廉價(jià)的提取、回收活性成分提供一定的指導(dǎo)作用。此外，還可將三相分配體系與酶輔助、高壓均質(zhì)預(yù)處理、微波輔助等輔助工藝相結(jié)合，提高TPP 法的效率，發(fā)展更方便、快捷的三相分配體系。三相分配法在大蒜活性成分提取這一領(lǐng)域的應(yīng)用有待于更加深入的研究。