壓力旋流噴染技術(shù)在血涂片染色中的研究與應(yīng)用

王國偉 李旺鑫 梅 茜? 董文飛

1(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院(蘇州)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部，合肥 230026)

2(中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，江蘇 蘇州 215163)

3(濟南國科醫(yī)工科技發(fā)展有限公司，濟南 250101)

引言

血涂片的顯微鏡檢查是血液細胞形態(tài)學(xué)分析的金標(biāo)準(zhǔn)，在臨床檢驗中占有重要地位，其制片質(zhì)量也會影響病理診斷結(jié)果[1-3]。 然而長期以來，臨床上小批量的血涂片染色通常是由檢驗醫(yī)師人工滴加染液進行染色[4]，這種染色方法，不僅染液消耗量大，還會由于染液的混合不均勻?qū)е氯旧顪\不一、染料沉積，最終制作的血涂片難以實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。 目前大型醫(yī)院使用的血液分析流水線包含自動化染色模塊，采用豎直式的染色盒和浸染的方式對血涂片進行染色，染液消耗量較大，因為只有染色盒頂部一處開口，染色液的灌入和吸出、以及空氣干燥都只能從染色盒頂部開口處往下進行，而且儀器結(jié)構(gòu)復(fù)雜，價格昂貴，維護成本高，不適用于小批量的血涂片染色場景。 因此，改進血涂片的染色方式，提高小批量血涂片染色的效率與質(zhì)量，具有重要的研究意義。

噴染是一種借助霧化噴頭將染液噴在物體表面的染色方式，具有染色均勻，染色效率高等優(yōu)點[5]。 霧化噴頭作為噴染系統(tǒng)的關(guān)鍵元件之一，種類繁多，用途廣泛[6-9]，而壓力旋流霧化噴頭憑借其結(jié)構(gòu)簡單，維護方便，工作壓力較低[10]等優(yōu)點，被應(yīng)用于各種工業(yè)場景。 國內(nèi)外研究者針對壓力旋流霧化噴頭開展了一系列的理論分析及實驗研究。潘華辰等[11]通過數(shù)值模擬和實驗相結(jié)合的方法分析了切向槽位置和傾斜角對霧化效果的影響規(guī)律；劉趙淼等[12]開發(fā)一種內(nèi)部尺寸參數(shù)較小的壓力旋流霧化噴頭，分析在不同注壓下的錐形液膜流動、破碎及霧化特性，并總結(jié)旋流槽數(shù)目對液膜流速、噴霧錐角、霧滴粒徑及均勻度等參數(shù)的影響；Sun等[13]對一種直葉片壓力旋流霧化噴頭進行內(nèi)部流場數(shù)值模擬和外部霧滴速度場測試，獲得噴頭外流場速度分布隨入口壓力的變化規(guī)律；Amini[14]通過理論計算和實驗驗證噴頭幾何形狀和進口流動條件對噴頭性能的影響；Bang 等[15]建立了不同幾何形狀的收斂噴嘴內(nèi)旋流式厚膜流動的理論模型，分析噴頭結(jié)構(gòu)的變化對霧化參數(shù)的影響；王健等[16]和程衛(wèi)民等[17]分析了壓力霧化噴頭在采礦降塵領(lǐng)域中的應(yīng)用；劉紹彥等[18]對影響壓力旋流霧化噴頭噴霧冷卻的因素進行了研究。 目前大多數(shù)研究主要針對壓力旋流霧化噴頭的結(jié)構(gòu)變化對外部流場參數(shù)的影響分析以及其在工業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用，但還缺少針對血涂片噴染的噴頭設(shè)計及應(yīng)用開發(fā)。

本研究針對噴染血涂片的實際需求，改進并制備一種具有4 個切向注入口的小型低壓旋流霧化噴頭，并開展了模擬仿真和系列實驗驗證。 首先通過建模仿真分析噴頭內(nèi)部的染液流動特性，然后構(gòu)建噴頭外部霧化場測試系統(tǒng)探索適宜的噴染參數(shù)，最終開展血涂片的噴染實驗應(yīng)用，為高效率、高質(zhì)量血涂片染色提供了一種新思路。

1 方法

1.1 噴頭的基本結(jié)構(gòu)

由于每張血涂片所需染液較少，且需要染液均勻覆蓋，本研究選用了一種具有4 個切向注入口的小型壓力旋流霧化噴頭，并對噴頭的內(nèi)部尺寸進行了優(yōu)化，如圖1 所示，主要由噴頭芯和噴頭帽兩部分組成，染液入口直徑為3 mm，每個旋流入口截面為0.5 mm×0.3 mm 的矩形，并且與旋流室相切連接，旋流室上部直徑為2 mm，噴頭出口直徑為0.4 mm。噴頭入口壓力范圍為0～0.3 MPa，使用聚丙烯材料注塑加工而成。 其工作機制是染液在壓力的作用下由噴頭入口進入噴頭空腔，然后經(jīng)4 個切向注入口進入旋流室內(nèi)并形成旋流，在離心力作用下沿錐形旋流室內(nèi)壁做高速旋轉(zhuǎn)運動，由于旋流室采用倒錐形結(jié)構(gòu)，當(dāng)染液流動到旋流室末端時將獲得較大的軸向速度和徑向速度，因此染液在噴頭出口處會以錐形液膜的形式噴出。 高速液膜再與空氣相對劇烈運動，撕裂破碎成細小的霧滴[19-20]。 噴頭的核心結(jié)構(gòu)是旋流切向注入口和錐形旋流室，如圖1(c)所示，染液朝著箭頭所指方向流動，4 個染液注入口末端分別與旋流室相切，其直接影響染液噴出時的霧化狀態(tài)。

圖1 壓力旋流噴頭結(jié)構(gòu)。 (a)噴頭模型；(b)噴頭實物圖；(c)旋流室結(jié)構(gòu)和染液流動方向示意Fig.1 Structure diagram of pressure swirl nozzle.(a) Nozzle model； (b) Nozzle picture； (c) The photograph of swirling chamber and the schematic diagram of the staining solution flow direction

1.2 噴頭內(nèi)部結(jié)構(gòu)的仿真分析

噴頭內(nèi)部的染液流動狀態(tài)對噴頭出口的霧化場及霧化特征參數(shù)具有重要影響。 然而噴頭結(jié)構(gòu)緊密，內(nèi)部尺寸參數(shù)較小，染液在噴頭內(nèi)部的流動狀態(tài)不易觀察，通常使用仿真分析的方法研究噴頭內(nèi)部的流動特性。 由于切向注入口和旋流室是噴頭的核心結(jié)構(gòu)，直接影響染液噴出時的霧化狀態(tài)，本研究將主要對噴頭的旋流切向注入口和旋流室進行流體仿真。

染液在旋流室內(nèi)的流動狀態(tài)為湍流流動，且為不可壓縮流體。 在忽略重力、熱量交換等因素影響后其基本控制方程主要包括連續(xù)性方程、動量方程。

連續(xù)性方程為

動量方程為

式中，ρ為流體等效密度，u為場速度矢量，P為作用在流體微元上的壓力，F(xiàn)為作用在流體微元上的體積力，μ為流體等效動力粘度[21]。

采用ANSYS Workbench 軟件對噴頭結(jié)構(gòu)內(nèi)部流道建立流體力學(xué)模型進行仿真。 首先將模型導(dǎo)入ANSYS 的前處理軟件Meshing 中進行網(wǎng)格劃分和邊界條件界定，然后選用FLUENT 軟件進行雙精度模擬分析，其中湍流模型選用帶旋流修正的Realizablek-ε 模型[22-23]，流道內(nèi)瑞氏－姬姆薩染液的物理參數(shù)按照表1 進行初始設(shè)置，入口邊界為4個旋流切向注入口，設(shè)置為壓力，噴頭出口邊界條件設(shè)置為一個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓。 噴頭固體壁面設(shè)定為無滑移絕熱壁面，近壁區(qū)采用標(biāo)準(zhǔn)壁面函數(shù)法處理。 求解器中壓力與速度的耦合采用SIMPLEC 算法進行求解。

表1 仿真材料參數(shù)Tab.1 Material parameters defined for simulation

1.3 噴頭外部霧化場實驗

1.3.1 構(gòu)建霧化場測試系統(tǒng)

針對染液從噴頭出口噴出后的霧化特性，圖2所示為用于確定噴染霧化參數(shù)的噴頭外部霧化場測試系統(tǒng)示意。 系統(tǒng)主要由染液輸出裝置、粒徑分析裝置及霧化角拍攝裝置等三部分組成。 染液瓶中的瑞氏－姬姆薩染液通過3 mm 內(nèi)徑軟管流經(jīng)過濾器、微型隔膜泵(DL200EEDC，武漢優(yōu)利可科技公司，中國)、穩(wěn)壓閥、壓力表(YN60BF，上海笠聚)，最后經(jīng)霧化噴頭噴出。 此微型隔膜泵結(jié)構(gòu)緊湊、脈沖較小、功耗低且有自吸功能，可以滿足實驗需求。壓力表測量染液注入噴頭時的壓力，壓力表量程在0～0.4 MPa。

圖2 霧化實驗系統(tǒng)示意Fig.2 Schematic illustration of experimental platform for performance measurement of atomization

首先使用坐標(biāo)控制器調(diào)節(jié)坐標(biāo)架進而改變噴頭的高度，然后利用噴霧激光粒度儀測量霧化區(qū)域不同位置的霧滴粒徑。 本實驗系統(tǒng)使用的是成都精新的JL－3000A 型噴霧激光粒度儀，其工作原理基于全量程米氏散射理論[24]。 650 nm 發(fā)射波長激光經(jīng)過霧化區(qū)域時，不同直徑的霧滴散射光的強度不同，接收端經(jīng)過數(shù)據(jù)處理與分析反推會得到不同直徑的霧滴的分布參數(shù)，由激光粒度儀將霧滴分布信息傳輸給計算機專用軟件，得到直觀的霧滴分布數(shù)據(jù)。 同時，此粒度儀有128 級多元探測器，粒徑分檔多，級差小，散射信號檢測精細且具有較高的分辨率，測量范圍在0.1～3 000 μm。 在暗室通過相機結(jié)合LED 光源對霧化區(qū)域進行拍攝，可采集噴頭外部霧化場的霧化角圖像。

1.3.2 測量染液噴出霧化角

霧化角與霧化場的空間區(qū)域以及霧滴的分布直接相關(guān)，染液從噴頭出口噴出后擴散成近似錐形的霧化形態(tài)，通過測量霧化場兩條外邊緣切線的夾角，可以測得霧化角θ，如圖3 所示，已知霧化角θ，血涂片需要染色的噴射寬度范圍L＝55 mm，則利用式(3)確定噴染過程中需要完全覆蓋血涂片待染色區(qū)域時，血涂片與噴頭的最小距離參數(shù)h。

圖3 染液覆蓋區(qū)域示意Fig.3 Schematic diagram of the stain-covered area

為分析噴頭入口壓力變化對霧化角的影響，確定不同噴頭入口壓力下的最小距離參數(shù)h，在暗室里將光源布置在離心噴嘴正下方，通過相機拍攝噴頭噴出的霧化角圖像。 根據(jù)噴頭入口壓力范圍選取實驗壓力分別為0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.22、0.24 MPa，采集相應(yīng)的霧化角圖像，并測量對應(yīng)霧化角，為減少測量誤差，準(zhǔn)確評估霧化角大小，每個實驗壓力下分別拍攝5 張圖像進行測量，并取平均值。

1.3.3 測量染液噴出粒徑參數(shù)

噴頭霧化區(qū)域的霧滴通過液膜撕裂破碎而成，雖然霧滴顆粒的形狀不盡相同，但可以通過霧滴粒徑大小及分布情況分析霧化過程及霧滴分布規(guī)律。常用的方法是假設(shè)霧滴形狀都近似為球形，使用統(tǒng)計學(xué)方法定義平均霧滴粒徑，通過平均粒徑來描述噴霧的霧滴粒徑特性。 目前常用的評估參數(shù)是霧滴體積中徑和粒度分布跨度S。 霧滴體積中徑用Dv50表示直徑小于Dv50的霧滴占全部霧滴體積的50%，以表征該區(qū)域內(nèi)霧滴的直徑大小。 在相同染液體積下，Dv50數(shù)值越小，說明霧滴的數(shù)目越多，霧化質(zhì)量也更高。 同理Dv90和Dv10分別表示該粒徑及以下的霧滴體積占測試區(qū)域內(nèi)霧滴體積的90%和10%。 粒度分布跨度的計算如下:

以上數(shù)值均通過激光粒度儀檢測輸出，然后再進行計算得出粒度分布跨度值，其可以直觀反應(yīng)出霧滴的均勻性，值越小，其均勻性越好，霧化效果越好。

通過測量不同噴頭入口壓力下距離噴頭不同位置的Dv50，分析霧化空間區(qū)域內(nèi)液膜破碎過程及霧滴的變化規(guī)律，尋找穩(wěn)定狀態(tài)下的噴染界面。 根據(jù)現(xiàn)有的血涂片的制作方式，前期工作表明鋪展在載玻片上的細胞主要分為頭端，體端，尾端等3 個區(qū)域，而位于血涂片中間位置的體端和尾端交界區(qū)域，其細胞鋪展均勻，單個分散不重疊，后續(xù)顯微鏡檢查也主要選取此位置進行細胞觀察與分析[25]。并且噴頭中軸線正對體端和尾端交界區(qū)域，該區(qū)域的細胞染色質(zhì)量好壞直接影響后續(xù)的顯微鏡檢查，所以重點分析噴頭中軸線附近區(qū)域的粒徑參數(shù)。如圖4 所示，選取噴頭正下方10 ～50 mm 的霧化區(qū)域，沿軸向每5 mm 取一個測試點，每個測試點的外部入口壓力分別選取0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.22、0.24 MPa，測得霧滴的粒徑分布參數(shù)。

圖4 測試區(qū)域示意Fig.4 Schematic diagram of the test area

1.3.4 測量不同噴頭入口壓力下的噴頭流量

血涂片在染色過程中，需要將瑞氏－姬姆薩染液與緩沖液按一定比例混合，因此需要控制染液的用量。 通過使用流量計，測量噴頭入口壓力從0 增至0.25 MPa 時，噴頭的流量變化。

1.3.5 血涂片噴染實驗驗證

為了驗證該小型壓力旋流霧化噴頭在血涂片染色中的應(yīng)用效果，選用細胞圖像背景的灰度值進行分析。 灰度是指黑白圖像中的顏色深淺，范圍一般為0～255，白色為255，黑色為0，因此灰度值越大，其背景顏色越淺。 同時選用圖像背景顏色的灰度跨度值進行染色均勻性的分析，灰度跨度值等于區(qū)域內(nèi)最大灰度值與最小灰度值的差值與平均灰度值的比值，因此灰度跨度值越小，其染色越均勻。分別對血涂片進行瑞氏－姬姆薩噴染和傳統(tǒng)人工滴液染色，其中噴染的過程是將血涂片放置于噴頭正下方35 mm，噴頭入口壓力為0.20 MPa。 首先噴出瑞氏－姬姆薩染液約0.5 mL 于血涂片上，靜置染色1 min，然后用另一個噴頭噴出磷酸緩沖液1 mL 于血涂片上，待緩沖液和染液充分混合后靜置3 min，最后用去離子水進行充分沖洗，待干燥后置于顯微鏡下對血涂片上的細胞分布圖像進行采集與分析。在相同顯微鏡條件下，噴染和滴染后的血涂片細胞圖像各采集10 張，通過ImageJ 軟件分別測量了人工滴染與噴染后的細胞圖像背景灰度參數(shù)，并對噴染后的細胞圖像平均灰度值、灰度跨度值和滴染后的平均灰度值、灰度跨度值分別進行雙側(cè)t檢驗，P<0.05 為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 噴頭內(nèi)部流場的仿真結(jié)果

噴頭核心結(jié)構(gòu)的物理模型生成如圖5(a)所示的非結(jié)構(gòu)化四面體網(wǎng)格。 當(dāng)切向注入口壓力為0.15 MPa，染液開始進入旋流室直到從出口噴出的填充過程模擬結(jié)果如圖5(b)和(c)所示。 圖5(b)為染液在旋流室內(nèi)的壓力變化過程，由于染液在旋流室內(nèi)有較高的切向速度，高速旋轉(zhuǎn)的染液使得壓力沿著半徑方向由壁面向中心處遞減，因此會在旋流室中心軸線形成空心負壓區(qū)，負壓區(qū)的形成會吸引空氣進入旋流室形成氣核，氣核會擠壓出口處的染液，使其形成高速液膜從出口噴出。 染液在壓力的作用下由4 個切向注入口同時進入旋流室，其速度隨時間的變化如圖5(c)所示，在旋流室內(nèi)，由于越靠近旋流室中心，染液旋流強度越大，切向速度也就越大，因此中心區(qū)域的旋流速度比邊界部分的速度更大。 流體同時具有切向速度和軸向速度，因此染液沿著旋流室內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)的同時朝著出口方向流動，在2.5 ms 內(nèi)就可以實現(xiàn)從噴頭出口高速噴出。

圖5 噴頭內(nèi)部流場仿真結(jié)果。 (a)內(nèi)部流道的仿真模型；(b)旋流生成過程中的壓力變化；(c)旋流生成過程中的速度變化；(d)不同注入壓力下噴頭出口速度矢量圖Fig.5 The simulation results of flow field in the nozzle.(a) Simulation model of the internal flow channel；(b) Pressure changes with the swirling formation；(c) Changing of velocity during the swirling formation；(d) Vector diagram of nozzle outlet velocity at different injection pressures

切向注入口壓力的變化直接影響染液噴出的速度，在噴頭壓力范圍內(nèi)當(dāng)入口壓力分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 MPa 時，其出口速度矢量圖變化如圖5(d)所示。 噴頭出口的速度隨著注入壓力的增大而逐漸增大，這是因為壓力的增大導(dǎo)致噴頭內(nèi)染液的旋流強度增加，最終轉(zhuǎn)化為染液噴出時的動能。

2.2 染液噴出霧化角

不同噴頭入口壓力下的霧化圖像及霧化場外邊緣切線如圖6 所示，通過ImageJ 軟件進行了角度測量。 當(dāng)噴頭入口壓力從0.1 MPa 逐漸增大到0.24 MPa 時，噴頭的噴霧角從56.72°增大到了77.17°。 當(dāng)噴頭入口壓力達到0.20 MPa 后，霧化角最終穩(wěn)定于76°～78°之間。 噴頭的霧化角的變化規(guī)律及對應(yīng)的距離參數(shù)h變化由表2 所示。 結(jié)合對噴頭內(nèi)部流場的模擬分析可知染液在噴頭內(nèi)部的旋流強度會隨著噴頭入口壓力的增大而增大，并且由于噴頭出口處的軸向速度增大速率小于切向速度的增大速率，使得噴出染液的液膜拉伸范圍變大，所以霧化角也隨之增大。 但隨著壓力的增大到0.20 MPa 后，由于噴頭內(nèi)部摩擦損失增大，使得切向速度的增大速率變緩，因此隨著壓力的增大霧化角不再產(chǎn)生較大變化，并且趨于穩(wěn)定，通過以上數(shù)據(jù)可知在選擇的壓力范圍內(nèi)血涂片與噴頭的最小距離參數(shù)在34～51 mm 之間。

圖6 不同噴頭入口壓力下的霧化角Fig.6 Images of spray angle at different nozzle inlet pressures

表2 不同噴頭入口壓力下所需要的最小距離Tab.2 Minimum distance at different nozzle inlet pressures

2.3 染液噴出粒徑參數(shù)

在不同的噴頭入口壓力下，距離噴頭不同位置的霧滴體積中徑Dv50的變化如圖7 所示，當(dāng)壓力一定時，測試區(qū)域內(nèi)霧滴粒徑隨著與噴頭的距離增大而呈減小趨勢，并且最終趨于穩(wěn)定，這是因為剛開始液膜從噴頭出口噴出時首先要經(jīng)歷破碎階段，此時測得的霧滴粒徑較大，但隨著液膜受到表面張力和離心力的不斷作用，其逐漸破碎成更小的霧滴，最終達到穩(wěn)定的狀態(tài)。 隨著壓力的增大，液膜受到的作用力也會隨之增大，因此液膜破碎達到穩(wěn)定狀態(tài)所需要的距離也在不斷減小。 當(dāng)噴頭入口壓力為0.10 和0.12 MPa 時，注入壓力較小，使液膜破碎的作用力也較小，導(dǎo)致在選取的范圍內(nèi)錐形液膜不能有效破裂，所以霧滴粒徑還在上下波動，未達到穩(wěn)定的狀態(tài)。 當(dāng)噴頭入口壓力為0.14 和0.16 MPa時，霧滴粒徑在距離噴頭40 mm 處開始趨于穩(wěn)定，Dv50分別穩(wěn)定在98～100 μm，78～80 μm 之間。 當(dāng)噴頭入口壓力為0.18 和0.20 MPa 時，霧滴粒徑在距離噴頭35 mm 處開始趨于穩(wěn)定，Dv50穩(wěn)定在74～77 μm 之間。 當(dāng)噴頭入口壓力為0.22 和0.24 MPa時，在距離噴頭30 mm 處，霧滴粒徑已開始趨于穩(wěn)定。 當(dāng)噴頭入口壓力為0.16、0.18、0.20、0.22、0.24 MPa 時，穩(wěn)定狀態(tài)下的Dv50明顯比噴頭入口壓力為0.14 MPa 時的Dv50小，染液的霧化質(zhì)量也更高。

圖7 不同噴頭入口壓力下測試點的Dv 50Fig.7 Droplet volume median diameter at different nozzle inlet pressures

如表3 所示，結(jié)合2.2 節(jié)對不同噴頭入口壓力下所需最小距離參數(shù)h的分析，分別測量了壓力為0.16、0.18、0.20、0.22、0.24 MPa 時穩(wěn)定界面的粒徑參數(shù)，且計算了粒度分布跨度S。 對比分析5 種情況下的粒度分布跨度，當(dāng)噴頭入口壓力為0.2 MPa，與噴頭的距離h為35 mm 處的噴染界面測得的粒度分布跨度最小，霧滴分布最均勻，霧化效果較好。 因此選取此參數(shù)條件對血涂片進行染色。

表3 5 個穩(wěn)定界面的粒徑參數(shù)Tab.3 Particle size parameters of five stable interfaces

2.4 注入壓力對噴頭流量的影響結(jié)果

如圖8 所示，當(dāng)噴頭的入口壓力從0 增加到0.25 MPa時，由于壓力的增大導(dǎo)致染液的旋流強度和速度也都隨之增大，使得噴頭的流量逐漸增至103 mL/min，當(dāng)壓力逐漸升高到一定值時，染液在噴頭內(nèi)部的損失變大使得出口速度增大速率下降，并且由于噴頭的出口孔徑固定不變，噴頭流量隨壓力增大而增大的趨勢放緩。 根據(jù)噴頭流量隨噴頭入口壓力的變化情況，可以控制每張血涂片的染液使用及混合情況，從而提高血涂片的染色質(zhì)量。

圖8 不同噴頭入口壓力下的染液流量Fig.8 Flow rate of staining solution at the various nozzle inlet pressures

2.5 血涂片噴染實驗結(jié)果

經(jīng)過噴染、沖洗、干燥等操作后的血細胞在顯微鏡下觀察和采集圖像(見圖9)，染色后有核細胞為白細胞，細胞核呈紫紅色，無核細胞為紅細胞，呈粉色。 如表4 所示，分別隨機選取10 張人工滴染和噴染后的細胞圖像，人工滴染后的細胞圖像的平均灰度值為237.70±2.74，而噴染后的平均灰度值為245.02±3.75，噴染和滴染后的細胞圖像平均灰度值存在顯著性差異(P<0.01)，噴染后的細胞圖像背景更趨向于白色。 此外，人工滴染后的血涂片細胞圖像的灰度跨度的均值為0.172±0.062，而噴頭噴染后的灰度跨度為0.035±0.010，噴染和滴染后的細胞圖像灰度跨度值存在顯著性差異(P<0.01)，噴染后的細胞圖像背景灰度顯著降低。 綜上分析，噴染后的血涂片背景色更淺、染色更均勻，有利于后續(xù)的鑒別、分類、計數(shù)等操作。

圖9 染色后的血細胞圖像。 (a)噴染后的血細胞；(b)滴染后的血細胞Fig.9 Image of stained blood cells.(a) Blood cells after spray staining； ( b ) Blood cells after drip staining

表4 細胞背景圖像灰度參數(shù)Tab.4 Background gray parameters of cell image

3 討論

血涂片染色作為血涂片制作過程中重要的一個環(huán)節(jié)，目前主要通過自動化設(shè)備浸染和人工滴染兩種方式進行。 市場上現(xiàn)有的自動化設(shè)備主要是通過染色架使血涂片依次通過不同的試劑槽，實現(xiàn)對載玻片的染色，比如德國徠卡公司研制的HistoCore SPECTRA ST 染色機，能夠同時對上百張載玻片進行染色，工作效率高。 但是試劑長時間暴露在空氣中會出現(xiàn)染液變性，隨著染色批次的增加，染色質(zhì)量會下降等問題[26]；并且浸染設(shè)備結(jié)構(gòu)復(fù)雜，體積龐大、價格昂貴、維護成本高[4]，所以主要應(yīng)用于大型三甲醫(yī)院，并不適用于小型社區(qū)醫(yī)院和科研機構(gòu)等場所。 目前小批量的血涂片染色仍以人工操作為主，缺乏合適的自動化染色方案。 本研究提出了基于霧化噴頭的血涂片噴染方法用于血涂片小批量染色。

本研究首先改進并制備了一種針對血涂片染色的小型壓力旋流霧化噴頭，并對噴頭的旋流室、切向注入口等核心部件進行仿真模擬，通過改變?nèi)疽旱乃俣群蛪毫Ψ治隽巳疽涸趪婎^內(nèi)的流動狀態(tài)，染液在噴頭內(nèi)獲得切向速度和軸向速度，然后在出口處形成高速液膜，為霧化場的形成奠定基礎(chǔ)[27]。接著本研究構(gòu)建了一套噴頭外部霧化場測試系統(tǒng)探索噴頭外部霧化場的最佳性能參數(shù)，通過相機拍攝不同噴頭入口壓力下的霧化圖像，并測量其霧化角，分析了不同噴頭入口壓力下的噴頭霧化角及覆蓋整個血涂片所需要的最小距離。 使用激光粒度儀分析了不同壓力下，距離噴頭出口不同高度的霧滴體積中徑Dv50和粒度分布跨度S，發(fā)現(xiàn)壓力越小，染液從出口噴出到穩(wěn)定狀態(tài)所需要的距離越遠，并且壓力過小會導(dǎo)致染液不能有效破碎且達不到穩(wěn)定的狀態(tài)[12]。 對不同注入壓力下所需最小距離參數(shù)的計算，對比了五個穩(wěn)定界面的粒度分布跨度確定了最佳的噴染參數(shù)。 最后通過對比表明噴染和滴染后的細胞圖像背景灰度參數(shù)存在顯著性差異(P<0.01)，噴染后的細胞圖像背景灰度顯著降低。證明了壓力旋流霧化噴頭可以應(yīng)用于血涂片染色，并且具備較好的染色效果。

血涂片染色所使用的瑞氏－姬姆薩染液主要是由瑞氏色素和姬姆薩色素充分溶解在甲醇中配制而成，經(jīng)檢測該溶液是一種低粘度的溶液。 同樣用于血涂片染色的瑞氏染液和姬姆薩染液也是由甲醇分別溶解色素配置而成，經(jīng)過實驗，該噴頭可以滿足以甲醇為主要溶劑的血涂片染液的霧化需求，并且制備噴頭所使用的聚丙烯材料對甲醇具有很好的耐腐蝕性。 同時生物醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域中常用的蘇木素伊紅染色，革蘭氏染色[28]使用的試劑也是一些低粘度的溶液，在后續(xù)的研究中可以擴展該霧化噴頭的應(yīng)用范圍與使用場景。

由于染液在霧化后會產(chǎn)生一些懸浮在空中的細小霧滴，并且在噴染時會產(chǎn)生廢液，在接下來搭建自動化噴染儀器時要特別注意染色空間的密封性，并且增加活性炭等吸附裝置。 在后續(xù)研究中將進一步優(yōu)化噴頭的流量，降低染液的消耗。

4 結(jié)論

本研究提出了一種基于壓力旋流式霧化噴頭的血涂片染色方法，通過對噴頭內(nèi)部結(jié)構(gòu)的流體仿真以及對噴頭外部霧化場的實驗分析，確定了當(dāng)噴頭的外部入口壓力為0.20 MPa，噴染界面位于噴頭正下方35 mm 時，具備最優(yōu)的霧化質(zhì)量。 并且與人工滴染后的細胞圖像對比發(fā)現(xiàn)，噴染和滴染后的細胞圖像背景灰度參數(shù)存在顯著性差異(P<0.01)，噴染后的細胞圖像背景灰度顯著降低，染色更均勻，表明該噴頭噴染血涂片取得了較好的染色效果，為血涂片染色提供了新的方案。 后續(xù)將圍繞該壓力旋流霧化噴頭搭建封閉式噴染儀器，實現(xiàn)對血涂片的全自動批量噴染，提高血涂片的染色效率和染色質(zhì)量。