基于從頭設(shè)計(jì)及ADMET 的木姜子屬中木脂素類化合物5-LOX 抑制劑篩選研究（Ⅱ）

夏侯真如，汪欣怡，潘 捷，楊 平，李碧桃，文政琦，汪云松**，楊靖華**

(1.云南大學(xué) 教育部自然資源藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省天然產(chǎn)物轉(zhuǎn)化與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650091；2.昆明醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；3.昆明醫(yī)科大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650500)

炎癥介質(zhì)在許多炎癥反應(yīng)中都起到復(fù)雜的炎癥級(jí)聯(lián)作用.通過對(duì)炎癥介質(zhì)的影響往往能夠減輕人體炎癥反應(yīng)的癥狀，從而治療如哮喘、痛風(fēng)、支氣管炎等各類炎癥性疾病.白三烯（LTs）是花生四烯酸（AA）經(jīng)5-脂氧合酶（5-LOX）途徑代謝產(chǎn)生的一組炎癥介質(zhì)，在炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，具有重要的研究?jī)r(jià)值和意義.其中，5-LOX 作為白三烯合成的關(guān)鍵酶之一，是炎癥反應(yīng)研究中的重要靶點(diǎn)[1-4].目前針對(duì)5-LOX 靶點(diǎn)的藥物如齊留通（Zileuton）等已展現(xiàn)出良好的臨床效果，但其仍有肝毒性、半衰期短等缺陷[5-6]，所以找尋肝毒性較小的5-LOX 抑制劑具有重要的研究?jī)r(jià)值.

樟科（Lauraceae）木姜子屬（Litsea）植物具有抗炎、抑菌、抗HIV 病毒等多種生物活性[7-8]，其中抗炎活性已有研究[9-11].在前期研究過程中，我們通過分子對(duì)接、藥效團(tuán)模型篩選等的經(jīng)典計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法[12-14]發(fā)現(xiàn)其中的木脂素類分子對(duì)5-LOX 酶具有良好的抑制活性，并且魏江春等[15]和AlSayed E 等[16]分別在筒鞘蛇菰和大果柏中得到的木脂素類分子均檢測(cè)出了良好的抗炎活性，這表明木姜子屬植物中的木脂素類分子具有5-LOX抑制劑開發(fā)潛力.目前通過計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)化合物的毒性已有廣泛的應(yīng)用，如Kumar K L S 等[17]比較了不同軟件預(yù)測(cè)hERG 心臟毒性的性能，Mehta P等[18]和Pinheiro M S 等[19]分別通過ADMET 預(yù)測(cè)了化合物的毒性.因此本文以其為基礎(chǔ)，進(jìn)行從頭設(shè)計(jì)改造以及類藥規(guī)則和ADMET 篩選，以期能夠獲得肝毒性較小且抑制活性較好的潛在5-LOX抑制劑.

1 材料與方法

1.1 平臺(tái)與軟件本研究主要在Microsoft Windows 10 Professional 操作系統(tǒng)中進(jìn)行計(jì)算模擬和數(shù)據(jù)處理，研究軟件主要采用Accelrys 公司的Discovery Studio 2016（DS）.參數(shù)設(shè)置除特殊指明外均為默認(rèn)值.

1.2 受體蛋白及小分子準(zhǔn)備為減少系統(tǒng)誤差，本文采用與前期研究相同的受體蛋白，即來自于RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）的常用于5-LOX抑制劑篩選的人源（Homo sapiens）蛋白結(jié)晶，蛋白編號(hào)3V99，原配體名稱ACD_702[20].并通過Discovery Studio 2016（DS）軟件，對(duì)這一蛋白結(jié)晶進(jìn)行同樣的大分子蛋白準(zhǔn)備和結(jié)構(gòu)處理，即刪除其中水分子、原子名稱標(biāo)準(zhǔn)化、缺失殘基補(bǔ)完及交替構(gòu)象去除等.選用配體擴(kuò)張法，生成球體空腔即活性位點(diǎn)，即表示范圍內(nèi)為活性殘基.本次研究采用的小分子為前期研究所得木姜子屬植物中木脂素類化合物01～35[9]號(hào)，陽性對(duì)照為齊留通和原配體ACD_702.

1.3 分子對(duì)接參數(shù)設(shè)置本次研究中所有分子對(duì)接篩選均采用Discovery Studio 2016（DS）中Dock Ligands模塊下的CDOCKER功能，CDOCKER 是一種CHARMm 立場(chǎng)下基于格點(diǎn)的高精度分子對(duì)接方法，具有較高的精準(zhǔn)性.設(shè)置靶點(diǎn)蛋白3V99結(jié)合空腔坐標(biāo)位置為：X=18.394 1、Y=-78.714 7、Z=-33.902 7，空腔半徑為1.2 nm，Top Hits 參數(shù)中Pose Cluster Radius 為0.5，即將RMSD 閾值設(shè)為0.5 以確保對(duì)接構(gòu)象具有多樣性，其余參數(shù)保持不變[21].

1.4 類藥規(guī)則及ADMET 篩選將前期研究中從木姜子屬植物獲取的35 個(gè)木脂素分子轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Discovery Studio 2016（DS），并編寫相應(yīng)序號(hào)，再加入陽性對(duì)照齊留通組成用于類藥規(guī)則及ADMET 篩選的小分子庫.首先啟動(dòng)Small Molecules 工具欄，并調(diào)用Prepare or Filter Ligands模塊下的Prepare ligands 功能對(duì)其進(jìn)行基本處理.再調(diào)用同模塊下的Filter by Lipinski and Veber Rules功能，選擇Lipinski Rule of Five 和Veber Rule 兩種規(guī)則對(duì)該分子庫進(jìn)行篩選，從而得到符合類藥規(guī)則的木脂素分子.最后調(diào)用Calculate Molecular Properties模塊下的ADMET Descriptors 功能，選擇Aqueous Solubility（25 ℃下水溶解度）、Blood Brain Barrier Penetration（血腦屏障通透性）、CYP2D6 Binding（細(xì)胞色素P450 2D6）、Hepatotoxicity（肝毒性）、Intestinal Absorption（人類腸道吸收性）、Plasma Protein Binding（血漿蛋白結(jié)合率）等6 個(gè)篩選方向，進(jìn)行ADMET 篩選，最終結(jié)果與齊留通進(jìn)行對(duì)比，從而確定篩選結(jié)果[22-23].

1.5 從頭設(shè)計(jì)

1.5.1 基本骨架選定 根據(jù)類藥規(guī)則和ADMET篩選結(jié)果，以篩選所得的木脂素分子為子結(jié)構(gòu)，在Zinc 15 數(shù)據(jù)庫（http://zinc.docking.org/）進(jìn)行分子庫擴(kuò)充，并再次使用類藥規(guī)則和ADMET 規(guī)則進(jìn)行篩選，最后調(diào)用Dock Ligands 模塊下的CDOCKER功能進(jìn)行精準(zhǔn)分子對(duì)接，其中以蛋白結(jié)晶3V99 作為受體蛋白，衍生物小分子為配體分子庫，齊留通與原配體ACD_702 為陽性對(duì)照.對(duì)接結(jié)果依據(jù)-CDOCKER ENERGE 數(shù)值進(jìn)行評(píng)價(jià)，-CDOCKER ENERGE 數(shù)值越大則對(duì)接結(jié)果越好.選取-CDOCKER ENERGE 打分?jǐn)?shù)值排名前五的小分子作為從頭設(shè)計(jì)基本骨架.-CDOCKER ENERGE 的評(píng)價(jià)結(jié)果同時(shí)考慮了內(nèi)部配體應(yīng)變能和受體-配體相互作用能，從而具有更高的可靠性.

1.5.2 De novo evolution 參數(shù)設(shè)定 通過準(zhǔn)備好的蛋白質(zhì)結(jié)晶3V99 分別與打分?jǐn)?shù)值前五的衍生小分子進(jìn)行匹配，調(diào)用Fragment Based Design 模塊下的De novo evolution 功能進(jìn)行從頭設(shè)計(jì)碎片生長(zhǎng)[24-25].從頭設(shè)計(jì)方法采用Ludi 算法，從最初的骨架出發(fā)將碎片分子庫的小片段添加到蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)的支架上，從而在受體結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生完整的分子，并且能夠通過計(jì)算相互作用情況來將片段放置在受體的互補(bǔ)位置，從而產(chǎn)生高評(píng)分的分子集合.本次研究中，設(shè)置DS 默認(rèn)分子庫為碎片分子庫，每個(gè)骨架的最大生成數(shù)量設(shè)置為20，其余參數(shù)保持默認(rèn)值.

1.5.3 結(jié)果處理 De novo evolution 完成后，將從頭設(shè)計(jì)獲取的小分子組成分子庫，分別與靶點(diǎn)蛋白3V99 進(jìn)行匹配，通過CDOCKER 功能進(jìn)行分子對(duì)接，從而篩選出打分?jǐn)?shù)值較高的小分子.對(duì)接結(jié)果依據(jù)-CDOCKER ENERGE 進(jìn)行評(píng)價(jià)，取每個(gè)分子構(gòu)象排名前三位的打分情況，將其平均值作為最終得分以提高評(píng)價(jià)結(jié)果的可靠性，最后再通過類藥規(guī)則和ADMET 的篩選，從而獲取肝毒性較小且打分?jǐn)?shù)值較高的從頭設(shè)計(jì)碎片生長(zhǎng)小分子，并通過二維相互作用圖對(duì)其進(jìn)行一定的分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 類藥規(guī)則及ADMET 篩選將前期研究中從木姜子屬植物獲取的35 個(gè)木脂素分子，以及陽性對(duì)照齊留通，導(dǎo)入DS 2016 進(jìn)行類藥規(guī)則和ADMET篩選.通過類藥規(guī)則篩選的化合物其ADMET 篩選情況如表1 所示，僅顯示肝毒性較小的篩選結(jié)果.最終得到6 個(gè)肝毒性較小的篩選結(jié)果，其結(jié)構(gòu)如圖1 所示.從表1 中可以看出，肝毒性較小的木脂素分子，其人體腸道吸收性、水溶性（25 ℃）和血腦屏障通透性都較好，但細(xì)胞色素P450 2D6 抑制性整體較弱，且具有較高的血漿蛋白結(jié)合率，與上市藥物齊留通的ADMET 結(jié)果較為相似，具有進(jìn)一步研究的可能性.

圖1 類藥規(guī)則及ADMET 篩選結(jié)果化合物結(jié)構(gòu)Fig.1 The compounds structures of drug-like rules and ADMET screening results

表1 ADMET 篩選結(jié)果（Ⅰ）＊Tab.1 ADMET screen results（Ⅰ）

2.2 從頭設(shè)計(jì)

2.2.1 基本骨架確定 在本研究中，從頭設(shè)計(jì)基本骨架的確定基于木姜子屬木脂素類化合物的類藥規(guī)則和ADMET 篩選結(jié)果，并通過Zinc 15 數(shù)據(jù)庫的分子擴(kuò)充，最終得到310 個(gè)相應(yīng)的衍生小分子，分別采用Zinc 15 數(shù)據(jù)庫ID 命名，并再次進(jìn)行類藥規(guī)則和ADMET 的篩選，篩選結(jié)果如表2 所示.篩選所得共29 個(gè)化合物Z01～Z29符合肝毒性較小的篩選條件.調(diào)用Dock Ligands 模塊下的CDOCKER功能進(jìn)行精準(zhǔn)分子對(duì)接，其中以蛋白結(jié)晶3V99 作為受體蛋白，29 個(gè)衍生小分子為配體分子庫，齊留通與原配體ACD_702 為陽性對(duì)照，對(duì)接得分結(jié)果如表3 所示，選取-CDOCKER ENERGE 數(shù)值排名前五的衍生小分子作為從頭設(shè)計(jì)基本骨架，其結(jié)構(gòu)如圖2 所示.本次篩選所得到的5 個(gè)衍生小分子的ADMET 結(jié)果均與齊留通類似，并具有肝毒性較小，血漿蛋白結(jié)合率較低的特性，且其打分?jǐn)?shù)值與齊留通相對(duì)接近，因此具有進(jìn)一步提高其優(yōu)勢(shì)的必要性.

表2 ADMET 篩選結(jié)果（Ⅱ）＊Tab.2 ADMET screen results（Ⅱ）

表3 對(duì)接得分結(jié)果Tab.3 Docking score results

圖2 排名前五的衍生物小分子結(jié)構(gòu)Fig.2 The structures of top five derived small molecules

2.2.2 De novo evolution 篩選結(jié)果 將打分?jǐn)?shù)值前五的衍生小分子分別與受體蛋白結(jié)晶3V99 進(jìn)行匹配，調(diào)用de novo evolution 功能進(jìn)行從頭設(shè)計(jì)碎片生長(zhǎng)，共生成100 個(gè)碎片生長(zhǎng)小分子.再通過CDOCKER 功能進(jìn)行精準(zhǔn)分子對(duì)接，打分結(jié)果同樣依據(jù)-CDOCKER ENERGE 數(shù)值判定，篩選結(jié)果如表4 所示，再次通過類藥規(guī)則和ADMET 的篩選，篩選結(jié)果如表5 所示，僅展示肝毒性較小的篩選結(jié)果.從中獲取肝毒性較小且打分值較高的從頭設(shè)計(jì)碎片生長(zhǎng)小分子共11 個(gè)，分別屬于Z21、Z20、Z10三個(gè)系列，其中Z21、Z20系列各有1 個(gè)，Z10系列有9 個(gè)，其分子結(jié)構(gòu)如圖3 所示.分別研究11個(gè)小分子與受體蛋白3V99 的殘基相互作用模式，主要相關(guān)殘基情況如表6 所示，結(jié)果僅展示與齊留通和原配體相似的殘基連接.按系列分別選取打分排名較高的小分子Z21-02、Z20-14、Z10-02展示其二維相互作用圖（圖4），并與齊留通和原配體進(jìn)行比較分析.本次de novo evolution 篩選結(jié)果中打分?jǐn)?shù)值優(yōu)于原配體的共5 個(gè)，優(yōu)于齊留通的共17 個(gè)，且整體打分?jǐn)?shù)值均較高，因此本次De Novo Evolution 從頭設(shè)計(jì)碎片生長(zhǎng)整體較為成功.在后續(xù)的類藥規(guī)則和ADMET 篩選中，成功獲取了21 個(gè)具有肝毒性較小，血漿蛋白結(jié)合率較低的特性的小分子，且其中11 個(gè)打分?jǐn)?shù)值接近或更優(yōu)于齊留通.并且通過殘基 相互作用模式的分析，可發(fā)現(xiàn)這11個(gè)小分子或與受體蛋白3V99 中的活性殘基ALA672 可以形成靜電相互作用和氫鍵相互作用，或與活性殘基HIS372、HIS367 可以形成疏水作用和氫鍵相互作用，或與活性殘基VAL671 可以形成氫鍵相互作用，這與齊留通和原配體的殘基相互作用模式相似，因此其有一定的潛在5-LOX 抑制性.進(jìn)一步分析二維相互作用圖，可發(fā)現(xiàn)活性殘基GLN363、ASN554、GLN557、ALA410、PHE177 等均在結(jié)合中起到了有利作用，因此這將是提升5-LOX 抑制性的可能方向.

圖3 肝毒性小且打分值高的分子結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Molecular structures diagram with low hepatotoxicity and high score

圖4 Z21-02、Z20-14、Z10-02、齊留通、原配體與3V99 相互作用2D 圖Fig.4 3V99 2D interactions with Z21-02,Z20-14、Z10-02、zileuton and protoligand

表4 De novo evolution 篩選結(jié)果Tab.4 Screening results from de novo evolution

表5 ADMET 篩選結(jié)果（Ⅲ）＊Tab.5 ADMET screen results（Ⅲ）

表6 主要?dú)埢饔们闆r表＊Tab.6 Action table of main residues

3 結(jié)論

傳統(tǒng)藥物研究開發(fā)中，藥物藥效好和毒副作用低往往難以兼顧，而現(xiàn)代計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)中類藥規(guī)則、ADMET 篩選、從頭設(shè)計(jì)等等方法的應(yīng)用極大地節(jié)約了優(yōu)良藥物的開發(fā)時(shí)間.本文通過綜合使用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)中類藥規(guī)則、ADMET 篩選、從頭設(shè)計(jì)等技術(shù)，對(duì)木姜子屬植物中的木脂素類化合物進(jìn)行了一定的改造和篩選，獲取了一系列的潛在5-LOX 抑制劑，并最終獲取了11 個(gè)小分子，其分子對(duì)接打分值較高，且殘基結(jié)合模式與齊留通較為類似，并具有肝毒性較小，血漿蛋白結(jié)合率較低的優(yōu)勢(shì)特性，因此可能具有更為優(yōu)秀的5-LOX抑制作用和更低的毒副作用.此外，通過對(duì)打分值較高的小分子的殘基相互作用進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GLN363、ASN554、GLN557、ALA410、PHE177等活性殘基的有利結(jié)合作用，為后續(xù)研究提供了一定的方向參考.