蕙蘭E類MADS-box SEP基因的克隆與時空表達特性

田云芳， 梅惠珍， 盧 超， 周明媚， 陳麗培，張耀廣， 劉宇邈， 陳景鮮， 楊玉珍

(1.鄭州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院， 河南 鄭州 450044；2.鄭州市觀賞藥用特色資源植物重點實驗室， 河南 鄭州 450044；3.滎陽索河郊野公園， 河南 鄭州 450100)

開花是高等植物個體生長發(fā)育的中心環(huán)節(jié)，是植物從營養(yǎng)階段向生殖階段的過渡[1]。20世紀(jì)90年代，繼Coen等[2]提出植物ABC花器官形成模型以來，2001年Theiben[3]又在此基礎(chǔ)上將ABC模型擴展為ABCDE花發(fā)育模型，理論上認(rèn)為參與調(diào)控植物花器官組織形成的有A、B、C、D、E五類功能基因。

在擬南芥中，E類基因有4個，SEPALLATA1(SEP1)，SEP2，SEP3，SEP4[3]，它們的基因功能存在極大的冗余性，在花器官的四輪組織中都可以表達，表達模式相近，僅是突變SEP4無明顯或非常微弱的表型改變，若四類基因SEP1、SEP2、SEP3、SEP4均進行突變，四輪花器官組織變成苞片的結(jié)構(gòu)，說明擬南芥的SEP類基因SEP1、SEP2、SEP3、SEP4均和花的發(fā)育有關(guān)。

因此，擬南芥中SEPALLATA類轉(zhuǎn)錄因子與A、B、C類轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成蛋白質(zhì)復(fù)合體一起參與控制花器官的生長發(fā)育。E類蛋白不但可以與A、B、C類同源異型蛋白一起作用，控制萼片、花瓣、雄蕊和心皮的發(fā)育，而且可以和D類同源異型蛋白共同作用，控制決定胚珠的發(fā)育[4-5]。

MADS-box花同源異型基因SEP類基因分屬為E類，在許多經(jīng)濟作物果實的生長發(fā)育中產(chǎn)生不同的調(diào)節(jié)作用[5-6]，在甘菊中，ClSEP1在胚珠中高度表達[7]；在棗中，3個E類基因(ZjSEP1/2、ZjSEP3和ZjSEP4)在棗花和果中均有表達[8]；在小麥中，TaSEP3-A1，TaSEP3-B1和TaSEP3-D1均在花和果實中表達[9]；在鐵皮石斛中，SEP-A基因在合蕊柱與唇瓣中表達，SEP-B基因在唇瓣、花萼和幼葉中表達[10]；在水稻中，SEP基因參與調(diào)控小穗表型、穗花發(fā)育，花器官產(chǎn)生和花分生組織的決定[11-14]。

蕙蘭(Cymbidiumfaberi)為蘭科蘭屬，是地生蘭的重要種之一，是花中珍品。花輪狀結(jié)構(gòu)較為典型，相比雙子葉植物花器官的組成結(jié)構(gòu)較為一致，其唇瓣高度特化。蕙蘭的花器官對于花發(fā)育相關(guān)基因在單子葉植物中的作用研究是非常理想的實驗材料。

本實驗以蕙蘭作試材，通過RT-PCR技術(shù)克隆得到1個與花發(fā)育相關(guān)的SEP基因，并利用實時熒光定量的方法對目的基因進行相對表達分析，為明晰在蕙蘭花發(fā)育進程中E類基因的作用機制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

蕙蘭植株采于河南大別山，后栽植在鄭州師范學(xué)院校園智能玻璃溫室。采用蕙蘭3個生長發(fā)育階段的13種不同器官組織作試材，分別為成苗階段的根與葉片，花蕾階段的根、葉片與花葶，盛花階段的葉片、花葶、子房、合蕊柱、唇瓣、花瓣、萼片等發(fā)育期樣品。所取每種器官或組織樣品分別用液氮速凍30 s，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 方 法

1.2.1RNA提取和cDNA合成

所取蕙蘭不同時期樣品通過TRIzol Reagent (Ambion)試劑盒提取其總RNA，蕙蘭花蕾階段的花蕾總RNA 通過M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)合成cDNA，進行克隆蕙蘭SEP目的基因。RT-qPCR(實時熒光定量)實驗用cDNA模板通過PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)進行合成，10倍體積稀釋后用于RT-qPCR。

1.2.2蕙蘭SEP目的基因的獲得

依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中同源SEP基因序列(建蘭JQ 326258.1、文心蘭HM 140844.1小蘭嶼蝴蝶蘭KF 673857.1、木石斛DQ 119842.1 )設(shè)計上下游簡并引物，進行目的基因中間片段的克隆，預(yù)期長度為383 bp，PCR反應(yīng)體系是25 μL：10×buffer 2.5 μL，dNTP 600 μmol/L，cDNA 1 000～2 000 ng，上下游引物各0.5 μmol/L，TaqDNA聚合酶1 U，其余用ddH2O補齊。反應(yīng)程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，設(shè)循環(huán)數(shù)為35；72 ℃延伸10 min。獲得目的片段后進行凝膠回收，再連接到載體pMD 19-T，熱激轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH 5 α，涂布于含有Amp、IPTG和X-cal的固體LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置暗培養(yǎng)14 h，篩選、PCR檢測、擴搖、測序。引物合成和測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.3蕙蘭SEP基因的表達分析

根據(jù)所獲得蕙蘭SEP基因序列設(shè)計1對特異引物(SEP-QF和SEP-QR)，以蕙蘭ACT(JN 177718)和UBQ3(KC 794503)作內(nèi)參照基因，通過SYBR Premix ExTaqTMⅡ kit(TaKaRa)進行RT-qPCR實驗，擴增體系為25 μL，擴增條件如下設(shè)置：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，58 ℃復(fù)性15 s，72 ℃延伸15 s(共設(shè)循環(huán)數(shù)為40)。反應(yīng)在熒光定量PCR儀(realplex2，德國Eppendorf)上進行。利用熔解曲線和測序來驗證分析引物特異性，PCR反應(yīng)結(jié)束后表達相對豐度計算方法為：Rel.Exp=2-ΔΔCt。

2 結(jié)果與分析

2.1 SEP基因cDNA的同源克隆

以蕙蘭花蕾總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄，再以其反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合同源序列設(shè)計的上下游簡并引物，進行RT-PCR擴增，得到目標(biāo)擴增產(chǎn)物后，對其切膠回收、熱激轉(zhuǎn)化、篩到陽性克隆后進行核苷酸序列測序。測序鑒定后得到核苷酸序列長度為373 bp(圖1)，將該核苷酸序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫檢索其與其他物種的同源性，依BLASTN顯示，與春蘭KF 924272.1的SEP基因同源性達到98%，與建蘭JQ 326258.1、文心蘭HM 140844.1 小蘭嶼蝴蝶蘭KF 673857.1、木石斛DQ 119842.1的SEP基因同源性分別為97%、92%、88%、82%。

表1 擴增SEP基因cDNA序列所用的引物及引物之間在各擴增反應(yīng)中的組合Table 1 PCR primers for amplification of cDNA sequence of SEP gene and combination of primers in amplification reaction

2.2 蕙蘭SEP氨基酸序列分析

NCBI數(shù)據(jù)庫中Blastp搜索該基因氨基酸序列顯示，所克隆基因包含典型的MADS功能域(圖2)，屬于SEPALLATA1-likeMADS-box亞家族，進一步分析發(fā)現(xiàn)，CfSEP1基因所編碼的蛋白也有一個K盒結(jié)構(gòu)域(圖2)，GenBank中登錄號為：MW 654191。該基因編碼的蛋白與春蘭AXY 87448.1和建蘭AFH 66785.1的同源性達98%，與木石斛AAZ 95252.1、小蘭嶼蝴蝶蘭AHW 52536.1、文心蘭ADJ 67238.1的同源性均可達到90%。

圖2 CfSEP 1蛋白保守功能域Fig.2 Conservative functional domain of CfSEP 1 protein

2.3 CfSEP1在蕙蘭各組織器官中的表達

從圖3可以看出，CfSEP1在蕙蘭各組織器官中的相對表達豐度順次為：花瓣(Ⅲ)>萼片(Ⅲ)>唇瓣(Ⅲ)>花蕾(Ⅱ)>合蕊柱(Ⅲ)>子房(Ⅲ)>花葶(Ⅱ)>花葶(Ⅲ)，在花器官中高豐度表達，尤其是花被片；在營養(yǎng)生長期、花蕾期、盛花期的根、葉中幾乎未檢測到熒光信號。很明顯，CfSEP1只在蕙蘭的生殖器官中表達，而在營養(yǎng)器官中均不表達。對于3個生長時期，CfSEP1在蕙蘭器官組織中的表達量逐漸升高，說明CfSEP1主要調(diào)控蕙蘭的生殖器官的生長發(fā)育，促進蕙蘭的生殖生長。

注：G0為苗期根，Y0為苗期葉，G1為花蕾期根，Y1為花蕾期葉，T1為花蕾期花葶，L1為花蕾期花蕾，Y2為盛花期葉，E2為盛花期花萼，B2為盛花期花瓣，C2為盛花期唇瓣，R2為盛花期合蕊柱，F(xiàn)2為盛花期子房，T2為盛花期花葶。Ⅰ為成苗期；Ⅱ為花蕾期；Ⅲ為盛花期。 圖3 CfSEP1在蕙蘭各組織器官中的表達Fig.3 Expression of CfSEP1 in the tissues of Cymbidium faberi

3 討論與結(jié)論

本研究中CfSEP1與春蘭SEP基因表達特性相似[15]，CgSEP3在春蘭花器官中均有檢測到，其中表達量較高的組織是萼片、側(cè)瓣和唇瓣，表達量較低的是子房和蕊柱。CgSEP3可能在春蘭花瓣和萼片的形成過程中具有重要作用。本研究中CfSEP1基因核苷酸序列和所編碼的氨基酸序列與CgSEP3基因核苷酸序列(KF 924272.1)和所編碼的氨基酸序列(AXY 87448.1)的同源性均可以達到98%。CgSEP3屬于AP1/AGL9亞族的SEP分支。與芒果MiSEP3基因的表達特性也相似[16]，葉中表達量較低在花中達到表達高峰。蓮NnSEP3也主要在花中表達[17]。

小麥(Triticumaestivum)WSEP(wheatSEPALLATA)[18]、加利福尼亞罌粟(Eschscholziacalifornica)EscaAGL9(AGAMOUSlike9)[6]、矮牽牛(Petuniahybrid)FBP2(floralbindingprotein2)[19]、西紅柿(Solanumlycopersicum)TM5(tomotoMADSboxgeneno.5)[20]等僅在花器官內(nèi)三輪組織(花瓣、雄蕊和雌蕊)表達，而萼片部分未有表達。CfSEP1相對表達分析表明，CfSEP1在花被片花萼、花瓣中均見表達，其表達特征顯然異于矮牽牛、西紅柿等的SEP3類基因，但相似于文心蘭(OncidiumGower Ramsey)SEP3類基因OMADS6和百合(Liliumlongiflorum)SEP3類基因LMADS3[21-22]，蝴蝶蘭(Phalaenopsisamabilis)PeSEP3也參與控制花萼與花瓣的形成[23]，這極可能是由于在擬南芥、矮牽牛等植物中，花萼花瓣形態(tài)完全相異，因此SEP3類基因在花萼中未檢測到，但在文心蘭、百合和蝴蝶蘭中花萼與花瓣形態(tài)極其類似，所以，參與調(diào)控花瓣形成的SEP3基因也會于花萼中表達，這表示SEP3基因在植物花萼花瓣的形成分化中可能起著非常重要的作用。

因此，本研究中CfSEP1基因被推斷為SEPALLATA3(SEP3)，SEP3與同源基因均屬于E類MADS-box基因的AP1/AGL9組。

SEPMADS-box基因與A、B 和C類MADS-box基因協(xié)同調(diào)控花器官組織特性[24-26]，于被子植物花起始與花發(fā)育中起著重要作用[5,27]。本研究中，CfSEP1表達較高的組織是花萼、花瓣與唇瓣，推斷CfSEP1的作用可能是與AP1和PI及其他A、B類基因共同控制蕙蘭花萼花瓣的發(fā)育形成。CfSEP1于子房和蕊柱檢測到的表達量少，這和擬南芥、矮牽牛等植物中SEP3類基因的表達特點相似，推斷CfSEP1可能與AG等C類基因共同調(diào)控蕙蘭子房與合蕊柱的發(fā)育形成。CfSEP1于蕙蘭怎樣發(fā)揮其復(fù)雜的功能需要進一步分析明確。