10個(gè)馬鈴薯新育成品種的SSR分析

張海龍， 于 卓， 祁 娜， 于肖夏， 李景偉， 岳 東

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 呼和浩特 010019)

SSR(Simple Sequence Repeat)標(biāo)記呈共顯性，具有多態(tài)性位點(diǎn)豐富、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)[1]，因其操作簡單、成本低，在作物種質(zhì)資源評價(jià)、分子標(biāo)記輔助育種、遺傳圖譜構(gòu)建和遺傳關(guān)系分析等方面已得到廣泛應(yīng)用[2]。吳立萍等[3]用14對多態(tài)性高的SSR引物對54份馬鈴薯品種遺傳關(guān)系進(jìn)行分析，共擴(kuò)增出多態(tài)性條帶229個(gè)，從DNA分子水平上揭示了供試品種間的親緣關(guān)系。本試驗(yàn)擬對10個(gè)馬鈴薯新品種的基因組DNA進(jìn)行SSR分析，在分子水平上，明確10個(gè)馬鈴薯新品種的遺傳差異性，為下一步作為馬鈴薯親本進(jìn)行雜交改良和新品種保護(hù)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為內(nèi)農(nóng)薯1號(hào)(NNS-1)、內(nèi)農(nóng)薯2號(hào)(NNS-2)、內(nèi)農(nóng)薯3號(hào)(NNS-3)、內(nèi)農(nóng)薯4號(hào)(NNS-4)、內(nèi)農(nóng)薯5號(hào)(NNS-5)、內(nèi)農(nóng)薯6號(hào)(NNS-6)、紅彩5號(hào)(HC-5)、紫彩1號(hào)(ZC-1)、紫彩2號(hào)(ZC-2)和紫彩3號(hào)(ZC-3)，均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)于卓教授帶領(lǐng)的馬鈴薯育種團(tuán)隊(duì)新近育成品種(系)。

1.2 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)材料于2020年5月在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地進(jìn)行種植，該試驗(yàn)地位于111°45′ E～45°50′ N，海拔1 069 m，年降水量350～400 mm，無霜期約145 d。土質(zhì)為沙壤質(zhì)土，pH值在7.8～8.2之間，土壤肥力中等，具有灌溉條件。每種材料單行種植50株，株距25 cm，行距75 cm，播種深度約12 cm，種子級(jí)別為原種。

1.3 測定方法

1.3.1DNA提取與檢測

在馬鈴薯苗期，隨機(jī)取各材料頂端新鮮葉片，用北京天根公司生產(chǎn)的DNA試劑盒提取基因組DNA。取各材料DNA原液5 μL，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對各材料進(jìn)行純度檢測，將達(dá)到試驗(yàn)要求的DNA稀釋至50 ng/μL，置于-40 ℃冰柜中留存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2SSR引物來源及篩選

試驗(yàn)所用引物均從NCBI網(wǎng)站上公布的馬鈴薯SSR特異性引物中篩選獲得，由上海生物工程有限公司負(fù)責(zé)合成。將各試驗(yàn)材料基因組DNA作為模板，對80對SSR適宜引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳，從中選出多態(tài)性高、位點(diǎn)穩(wěn)定、明亮的SSR引物10對(表1)，用于后續(xù)SSR分析。

表1 篩選出的10對SSR適宜引物及序列Table 1 10 pairs of SSR-appropriate primers and sequences screened

1.3.3SSR-PCR擴(kuò)增體系及程序

SSR-PCR擴(kuò)增體系：體系總體積20 μL，含樣品DNA(50 ng/μL)2.0 μL，1.4 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，10×PCR Buffer(Mg2+)2.1 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，上游和下游引物各0.6 μL，ddH2O 13.1 μL。

擴(kuò)增程序：在Bio-Rad Mycycler Thermal Cycler上進(jìn)行擴(kuò)增，程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)5次；94 ℃變性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min；4 ℃下終止反應(yīng)。

1.3.4擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

將5 μL變性劑加入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，在94 ℃下變性5 min，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱備用。每種材料吸取變性后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL點(diǎn)樣，用100 bp的DNA Marker作對照，電泳恒定功率70 W，電泳時(shí)間75 min。電泳結(jié)束后，將電泳膠板取下，于固定液內(nèi)固定16 min；固定結(jié)束后用蒸餾水漂洗2～3 min，于2.0%的硝酸銀溶液中染色15 min，再用蒸餾水速漂4～6 s；置顯影液中進(jìn)行顯色，待DNA條帶顯色清晰為止。晾干膠板，觀察記錄條帶位點(diǎn)和標(biāo)記數(shù)目、照相[4-5]。

1.3.5數(shù)據(jù)處理

利用0/1賦值法[13]統(tǒng)計(jì)電泳膠板上擴(kuò)增出的SSR多態(tài)性位點(diǎn)，用“1”表示條帶清晰，“0”表示沒有條帶，“-”表示缺失的條帶，最終生成“1”/“0”的原始二元數(shù)據(jù)矩陣，不統(tǒng)計(jì)沒有多態(tài)性的位點(diǎn)，多態(tài)性條帶位點(diǎn)百分率(P)計(jì)算公式為：

P(%)=(K/N)×100%

式中：K為多態(tài)性條帶位點(diǎn)總數(shù)，N為條帶位點(diǎn)總數(shù)[14]。用DPS(Data Processing System)軟件中的類平均聚類法(UPGMA)計(jì)算各品種間的遺傳距離，并對各品種進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料基因組DNA純度檢測

由圖1可見，各材料基因組DNA電泳條帶清晰、明亮、無拖尾和降解現(xiàn)象，表明各試驗(yàn)材料的DNA純度高，完全達(dá)到SSR-PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的要求。

注：M為DL 2000；1為NNS-1；2為NNS-2；3為NNS-3；4為NNS-4；5為NNS-5；6為NNS-6；7為HC-5；8為ZC-1；9為ZC-2；10為ZC-3。下同。 圖1 馬鈴薯新品種基因組DNA電泳檢測結(jié)果Fig.1 Results of DNA electrophoresis testing for genome of new potato varieties

2.2 馬鈴薯新品種基因組DNA的SSR擴(kuò)增

利用篩選出的10對SSR適宜引物對各試驗(yàn)材料基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳并統(tǒng)計(jì)其多態(tài)性位點(diǎn)條帶，結(jié)果(表2、圖2和圖3)表明，共有139個(gè)條帶穩(wěn)定、清晰的SSR標(biāo)記位點(diǎn)，其中含有SSR多態(tài)性位點(diǎn)條帶117個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)占總標(biāo)記位點(diǎn)的84.17%，平均每對引物擴(kuò)增出11.7個(gè)多態(tài)性條帶位點(diǎn)。引物S 189和S 25能很好地將10個(gè)馬鈴薯新品種清晰區(qū)分開，并分別構(gòu)建了SSR指紋圖，為新品種的鑒定和登記利用提供了分子依據(jù)。

圖2 引物S 189對10個(gè)馬鈴薯材料基因組DNA擴(kuò)增的SSR指紋特征Fig.2 SSR fingerprint characteristics of genomic DNA amplification of 10 new varieties with primer S 189

圖3 引物S 25對10個(gè)馬鈴薯材料基因組DNA擴(kuò)增的SSR指紋特征Fig.3 SSR fingerprint characteristics of genomic DNA amplification of 10 new varieties with primer S 25

表2 各新品種的SSR擴(kuò)增結(jié)果Table 2 SSR amplification results for each new variety

2.3 馬鈴薯新品種的遺傳距離和聚類分析

由表3和圖4可以看出，10個(gè)馬鈴薯新品種間的遺傳距離(GD)變幅為0.126 4～0.714 3，平均遺傳距離為0.555 4，材料NNS-4和ZC-1之間的遺傳距離最大，為0.714 3，其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；材料ZC-2和ZC-3之間的遺傳距離最小，為0.126 4，說明這兩個(gè)新品種間的親緣關(guān)系較近。以GD值0.55為基準(zhǔn)，將10個(gè)馬鈴薯品種分為四類：NNS-1、NNS-2和HC-5為第一類；NNS-3、NNS-4和NNS-5為第二類；ZC-1、ZC-2和ZC-3為第三類；NNS-6為第四類。

表3 各品種(材料)的遺傳距離矩陣Table 3 Genetic distance matrix for each new varieties

圖4 10個(gè)馬鈴薯材料的SSR聚類結(jié)果 Fig.4 SSR clustering results for 10 new potato varieties

3 討論與結(jié)論

SSR分子標(biāo)記也被稱為微衛(wèi)星DNA，即簡單重復(fù)序列。SSR分子標(biāo)記技術(shù)主要包含PCR擴(kuò)增反應(yīng)和聚丙烯酰胺凝膠電泳兩個(gè)關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)步驟，具有重復(fù)性好、操作簡單，可在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量的SSR多態(tài)性位點(diǎn)，明顯提高了SSR引物的利用效率[2]。在SSR標(biāo)記分析過程中，所選引物和供試材料是分子標(biāo)記擴(kuò)增位點(diǎn)多態(tài)性高低的關(guān)鍵因素，可明確顯示出作物個(gè)體之間的遺傳差異性，標(biāo)記多態(tài)性越高，說明個(gè)體間的遺傳差異越大[10]。近年來，SSR標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用在作物的遺傳多樣性分析等研究中。李靚等[11]利用篩選出的10對SSR適宜引物，對7個(gè)馬鈴薯供試材料的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)對試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，共獲得多態(tài)性條帶82個(gè)，多態(tài)性比率占78.10%；宋崢等[12]利用篩選的10對適宜性引物，對44份馬鈴薯種質(zhì)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共獲得108個(gè)SSR多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性比率88.5%。劉宇飛等[13]利用篩選出的10對SSR特異性引物，對5個(gè)馬鈴薯新品系基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其中SSR多態(tài)性位點(diǎn)有94個(gè)，多態(tài)性比率為72.23%。

本實(shí)驗(yàn)以雜交選育的10個(gè)馬鈴薯新品種內(nèi)農(nóng)薯1號(hào)、內(nèi)農(nóng)薯2號(hào)、內(nèi)農(nóng)薯3號(hào)、內(nèi)農(nóng)薯4號(hào)、內(nèi)農(nóng)薯5號(hào)、內(nèi)農(nóng)薯6號(hào)、紅彩5號(hào)、紫彩1號(hào)、紫彩2號(hào)和紫彩3號(hào)的基因組DNA為材料，利用篩選出的10對SSR適宜引物對各供試材料基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)分析聚丙烯凝膠電泳數(shù)據(jù)顯示，本實(shí)驗(yàn)共獲取117個(gè)SSR多態(tài)性條帶位點(diǎn)，多態(tài)性比率為84.17%，結(jié)果表明，在DNA分子水平上，10個(gè)馬鈴薯新品種之間存在顯著差異，同時(shí)利用特異性引物S 189和S 25構(gòu)建了2張能明確區(qū)分各供試材料的SSR指紋圖。聚類分析顯示，10個(gè)馬鈴薯新品種的GD值變幅為0.126 4～0.714 3，以GD值0.55為基準(zhǔn)，將10個(gè)馬鈴薯試驗(yàn)材料劃分為四類：第一類為NNS-1、NNS-2和HC-5；第二類為NNS-3、NNS-4和NNS-5；第三類為ZC-1、ZC-2和ZC-3； NNS-6為第四類。本研究再次證明SSR技術(shù)用于馬鈴薯品種間遺傳差異分析是可行的。