異源表達(dá)棉花GhPAO3基因?qū)M南芥種子萌發(fā)的影響

成新琪， 龐芳芹， 湯欣欣， 烏 蘭， 胡孝明， 朱華國

(黃岡師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)資源學(xué)院/經(jīng)濟(jì)林種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 黃岡 438000)

多胺(Polyamines，PAs)是含有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基，并存在于生物體內(nèi)具有生物活性的脂肪族含氮堿。植物體多胺主要有腐胺(Putrescine，Put)、亞精胺(Spermindine，Spd)、精胺(Spermine，Spm)和熱精胺(Thermospermine，Tspm)。此外，生物體內(nèi)存在著稀有多胺[1]。研究發(fā)現(xiàn)，多胺在植物生長(zhǎng)和適應(yīng)環(huán)境變化中扮演重要的角色[2-3]，諸如細(xì)胞分裂和分化、胚胎發(fā)生、組織發(fā)生、生物以及非生物脅迫的響應(yīng)等[4-8]。目前，多胺主要的合成和分解代謝途徑已基本被揭示[9]，與植物體多胺合成和代謝有關(guān)的部分基因已被克隆，并獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株[10-11]。

多胺的降解主要是通過二胺氧化酶(DAO)和多胺氧化酶(PAO)催化來實(shí)現(xiàn)，二胺氧化酶氧化腐胺和尸胺，產(chǎn)物包括4-氨基正丁醛、氨和H2O2。多胺氧化酶有多個(gè)同源基因[10-11]，其代謝途徑分為兩類，一類是催化Spm和Spd生成1,3-丙二胺(Dap)、H2O2和3-氨丙基-4-氨基正丁醛或4-氨基正丁醛；另一類是催化Spm生成Spd，再生成Put，同時(shí)生成3-氨基正丁醛和H2O2[4-6]。多胺氧化產(chǎn)生H2O2可以作為一種信號(hào)分子參與植物體內(nèi)細(xì)胞的程序性死亡、細(xì)胞的防御性反應(yīng)、細(xì)胞質(zhì)木質(zhì)素合成和生物與非生物脅迫等過程[12]。

H2O2是生物體細(xì)胞在代謝中產(chǎn)生的一種活性氧(ROS)，正常生長(zhǎng)情況下，植物體內(nèi)的ROS清除系統(tǒng)能使H2O2的含量保持一定的水平，使植物體免受傷害，但在逆境脅迫條件下，活性氧的產(chǎn)生超出系統(tǒng)清除能力范圍時(shí)，對(duì)植物體造成氧化損傷[13]。對(duì)H2O2深入的研究，認(rèn)識(shí)到H2O2對(duì)植物生長(zhǎng)和代謝的影響，H2O2參與了植物種子萌發(fā)和根的生長(zhǎng)等過程，尤其是當(dāng)植物受到脅迫時(shí)，H2O2的作用已成為了脅迫研究的熱門課題[14]。ROS對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育也有重要作用，能對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生一定程度的損害，但適宜濃度的ROS對(duì)激活植物應(yīng)對(duì)脅迫的防衛(wèi)有重要作用[15-18]。本研究以野生型(WT)和過表達(dá)GhPAO3轉(zhuǎn)基因擬南芥為材料，研究不同濃度NaCl對(duì)擬南芥種子萌發(fā)的影響，揭示外源多胺對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥種子子葉變綠的影響，為研究多胺響應(yīng)鹽脅迫的生理機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料處理

選取WT和3個(gè)純合轉(zhuǎn)GhPAO3基因株系(3-5、3-15和3-19)的擬南芥種子為實(shí)驗(yàn)材料，用15%次氯酸鈉消毒20 min，不斷振蕩，在超凈臺(tái)中用無菌水沖洗3～4次，播種于1/2 MS固體培養(yǎng)基上，低溫(4 ℃)春化2 d，轉(zhuǎn)移至22 ℃人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株鹽處理

以轉(zhuǎn)基因株系3-15為實(shí)驗(yàn)材料，種植于0、50、100、150、200 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上，統(tǒng)計(jì)其發(fā)芽率和子葉變綠的百分率。

1.3 外源多胺處理

不同濃度(0.2、1、2 mmol/L)的Put、Spd、Spm、D-Arg 和1,8-DO處理，調(diào)查統(tǒng)計(jì)WT和轉(zhuǎn)基因擬南芥子葉變綠的百分率。

1.4 H2O2含量測(cè)定

取WT和轉(zhuǎn)基因株系相同部位葉片(0.2～1.0 g)，放入含有液氮研缽中充分研磨，將粉末移至2 mL離心管中，按重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例往離心管中加入0.86%的生理鹽水，充分混勻，4 ℃，200 r/min離心10 min，取上清液于干凈離心管進(jìn)行H2O2含量測(cè)定，采用南京建成科技有限公司H2O2測(cè)定試劑盒。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

發(fā)芽率(%)=(第n天發(fā)芽的種子數(shù)/所用種子總數(shù))×100%；

子葉變綠百分率(%)=(第n天子葉變綠的數(shù)量/所用種子總數(shù))×100%，

式中，n為種子發(fā)芽的天數(shù)，子葉變綠數(shù)量指擬南芥發(fā)芽時(shí)葉片變?yōu)榫G色的數(shù)量，發(fā)芽在22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行，含水量恒定，每天記錄發(fā)芽種子數(shù)和子葉變綠的數(shù)量，實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl處理下轉(zhuǎn)GhPAO3擬南芥種子萌發(fā)情況

不同濃度NaCl條件下WT和轉(zhuǎn)GhPAO3擬南

芥種子萌發(fā)的結(jié)果表明，在0(圖1 A)和50 mmol/L NaCl(圖1 B)處理中，WT和轉(zhuǎn)基因種子發(fā)芽率無明顯差異；100 mmol/L NaCl處理轉(zhuǎn)基因擬南芥發(fā)芽率略低于WT(圖1 C)；150 mmol/L NaCl處理后推遲1 d發(fā)芽(圖1 D)，且轉(zhuǎn)基因株系發(fā)芽率低于WT；200 mmol/L NaCl處理下則推遲至第4天發(fā)芽(圖1 E)，WT和轉(zhuǎn)基因的發(fā)芽率都顯著下降，第7天的發(fā)芽率分別為54%和49%。隨著NaCl濃度的提高，擬南芥種子的萌發(fā)抑制更加明顯，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子對(duì)NaCl更加敏感。

注：A～E分別表示0、50、100、150、200 mmoL NaCl處理下WT和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子發(fā)芽率；圖片上方是對(duì)應(yīng)處理?xiàng)l件下種子的發(fā)芽率。圖1 NaCl脅迫下WT和GhPAO3擬南芥種子的發(fā)芽率Fig.1 Germination rate of WT and GhPAO3 seeds under NaCl stress in Arabidopsis

2.2 NaCl處理下外源多胺和多胺抑制劑對(duì)擬南芥子葉的影響

種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，100 mmol/L NaCl處理下WT和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子發(fā)芽率開始出現(xiàn)差異，且子葉變綠情況差異明顯。WT在第3天出現(xiàn)綠色子葉，而轉(zhuǎn)基因株系在第4天出現(xiàn)綠色子葉，且轉(zhuǎn)基因擬南芥子葉變綠的數(shù)量明顯低于WT(圖2 A)。為揭示轉(zhuǎn)基因株系在100 mmol/L NaCl處理下出現(xiàn)子葉變綠差異的原因，在100 mmol/L NaCl條件下分別添加不同濃度(0.2、1、2 mmol/L)外源多胺(Put、Spd、Spm)、多胺抑制劑(D-Arg)和多胺氧化酶(PAO) 抑制劑(1,8-DO)研究對(duì)子葉變綠的影響。結(jié)果表明，Put(2 mmol/L)、Spd(2 mmol/L)、Spm(2 mmol/L)處理時(shí)，WT與轉(zhuǎn)基因株系子葉變綠存在差異。加入Put時(shí)，WT和轉(zhuǎn)基因株系子葉變綠數(shù)量均有所提高，且轉(zhuǎn)基因株系子葉變綠提前(圖2 B)，而加入Spd和Spm后，WT和轉(zhuǎn)基因株系子葉變綠都推遲1 d(圖2 C和圖2 D)，加入不同多胺處理時(shí)轉(zhuǎn)基因子葉變綠百分率均低于WT(圖2 A-圖2 D)，但在第7天對(duì)照(圖2 A和圖3 A)和Put處理(圖2 B和圖3 B)子葉變綠百分率均達(dá)到100%；加入Spd和Spm，第7天仍存在差異(圖2 C和圖3 C；圖2 D和圖3 D)。而當(dāng)加入D-Arg(1 mmol/L)和1,8-DO(1 mmol/L)后，第7天也未出現(xiàn)子葉變綠的現(xiàn)象(圖2 E和圖3 E；圖2 F和圖3 F)。因此，推測(cè)NaCl處理和過表達(dá)GhPAO3基因可能通過改變H2O2含量影響擬南芥子葉變綠。

注：A為100 mmol/L NaCl處理下WT和轉(zhuǎn)GhPAO3擬南芥子葉變綠的百分率；B、C、D、E、F分別為100 mmol/L NaCl和多胺(Put、Spd、Spm、D-Arg和1,8-DO)處理下轉(zhuǎn)GhPAO3和擬南芥子葉變綠的百分率。圖2 NaCl處理和外施多胺條件下WT和GhPAO3擬南芥種子的子葉變綠的百分率Fig.2 Percentage of greenish cotyledons of WT and GhPAO3 seeds under NaCl treatment and external application of polyamines in Arabidopsis

注：A為100 mmoL NaCl處理下GhPAO3和擬南芥第7天子葉變綠的差異；B、C、D、E、F分別為多胺(Put、Spd、Spm、D-Arg和1,8-DO)處理下WT和轉(zhuǎn)基因GhPAO3擬南芥第7天子葉變綠的差異。圖3 NaCl處理和外施多胺條件下WT和轉(zhuǎn)基因GhPAO3擬南芥第7天子葉變綠的百分率 Fig.3 Percentage of cotyledons turning green on the 7th day of WT and GhPAO3 under NaCl treatment and external application of polyamines in Arabidopsis

2.3 外施多胺、D-Arg、1,8-DO對(duì)擬南芥子葉的影響

為進(jìn)一步研究子葉變綠差異，在1/2 MS培養(yǎng)基上分別加入外源Put、Spd、Spm、D-Arg和1,8-DO統(tǒng)計(jì)子葉變綠情況(圖4和圖5)。結(jié)果顯示，1/2 MS培養(yǎng)基上WT和轉(zhuǎn)基因株系子葉變綠沒有差異，第3天出現(xiàn)子葉變綠，第6天達(dá)到100%(圖4 A和圖5 A)。添加外源1,8-DO處理后WT和轉(zhuǎn)基因株系的子葉變綠的百分率均有所提高，其中加入Put、Spm、1,8-DO后，子葉變綠提前出現(xiàn)，即第2天出現(xiàn)綠色子葉(圖4 B、D、F)；加入Spd，第3天出現(xiàn)綠色子葉(圖4 C)；而加入多胺抑制劑D-Arg時(shí)，綠色子葉推遲至第5天出現(xiàn)(圖4 E)。此外，加入外源多胺(Put、Spd、Spm)后，WT子葉變綠的百分率高于轉(zhuǎn)基因株系；而加入D-Arg后，轉(zhuǎn)基因子葉變綠百分率高于WT；加入1,8-DO后，WT和轉(zhuǎn)基因子葉變綠百分率基本一致。因此，加入外源多胺時(shí)，對(duì)擬南芥子葉變綠具有促進(jìn)作用，但與WT相比，轉(zhuǎn)基因株系的子葉變綠的百分率有所降低，可能是過表達(dá)株系產(chǎn)生更多的H2O2，對(duì)子葉變綠具有一定抑制作用。

注：A為1/2 MS培養(yǎng)基WT和轉(zhuǎn)GhPAO3擬南芥子葉變綠百分率差異；B、C、D、E、F分別加入多胺(Put、Spd、Spm、D-Arg和1,8-DO)處理下轉(zhuǎn)GhPAO3和擬南芥子葉變綠百分率差異。圖4 外施多胺條件下WT和轉(zhuǎn)GhPAO3擬南芥種子子葉變綠百分率Fig.4 Rate of green cotyledons of WT and GhPAO3 seeds under external application of polyamines in Arabidopsis

注：A為1/2 MS培養(yǎng)基WT和轉(zhuǎn)GhPAO3擬南芥第7天子葉變綠差異；B、C、D、E、F分別為多胺(Put、Spd、Spm、D-Arg和1,8-DO)處理下WT和轉(zhuǎn)基因GhPAO3擬南芥第7天子葉變綠差異。圖5 外施多胺條件下WT和轉(zhuǎn)GhPAO3擬南芥第7天子葉變綠情況 Fig.5 Green cotyledon of WT and GhPAO3 transgenic on the 7th day under the condition of external application of polyamines in Arabidopsis

2.4 外施多胺和多胺抑制劑對(duì)擬南芥H2O2含量的影響

外施多胺和多胺抑制劑條件下WT和轉(zhuǎn)基因株系H2O2含量分析顯示，當(dāng)加入Put、Spm或1,8-DO后，與WT相比，轉(zhuǎn)基因株系產(chǎn)生H2O2的量明顯升高，差異達(dá)極顯著水平；加入Spd后，轉(zhuǎn)基因株系產(chǎn)生H2O2的量升高，差異達(dá)顯著水平；當(dāng)加入D-Arg后，轉(zhuǎn)基因株系產(chǎn)生H2O2的量明顯降低，差異達(dá)極顯著水平(圖6)。

注：“*”表示差異顯著(p<0.05)；“**”表示差異極顯著(p<0.01)。圖6 不同處理?xiàng)l件下WT和轉(zhuǎn)GhPAO3擬南芥H2O2含量Fig.6 Detection of H2O2 content in WT and GhPAO3 transgenic Arabidopsis under different treatments

3 結(jié)論與討論

種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中的重要階段，受溫度、水分和氧氣等影響，同時(shí)也受植物體內(nèi)激素和多胺等的調(diào)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)，添加外源多胺可以促進(jìn)萵苣種子[19]或抑制水稻種子[20]的萌發(fā)。越來越多的研究表明，多胺參與植物抗鹽方面的重要作用[2]，PAO催化多胺產(chǎn)生H2O2，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫[10]。

NaCl處理(圖2 B)和正常(圖4 B)條件下，加入外源Put均促進(jìn)子葉變綠的產(chǎn)生。Afzal等[21]和Verma、Mishra[22]研究發(fā)現(xiàn)，外源Put能促進(jìn)鹽處理下種子的萌發(fā)，提高種子和葉片的抗氧化能力，減少脂膜過氧化的程度[7]，有利于種子萌發(fā)和植株生長(zhǎng)發(fā)育，與本研究結(jié)果相似。同時(shí)，NaCl處理?xiàng)l件下，外源Spd(圖2 C)和Spm(圖2 D)處理下擬南芥子葉變綠的百分率降低，并且所有處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因株系子葉變綠的百分率低于WT，同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系較WT積累更多H2O2[11]，推測(cè)NaCl處理和外源多胺處理下，Spd和Spm大量進(jìn)入擬南芥體內(nèi)，之后被 PAO分解，產(chǎn)生更多的H2O2對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生傷害作用，并且過表達(dá)株系促進(jìn)植物體內(nèi)多胺降解產(chǎn)生H2O2，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因株系子葉變綠百分率低于WT，本研究結(jié)果與Wang等[23]研究的結(jié)果一致。正常條件下，外源Put(圖4 B)、Spd(圖4 C)、Spm(圖4 D)和1,8-DO(圖4 F)處理擬南芥種子，其子葉變綠百分率均有所提高，但轉(zhuǎn)基因株系子葉變綠百分率低于WT(圖4)，H2O2測(cè)定顯示，轉(zhuǎn)基因株系中H2O2含量高于WT(圖6)，與圖4結(jié)果一致，是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因株系過表達(dá)氧化多胺產(chǎn)生更多H2O2，但是沒有NaCl處理?xiàng)l件下H2O2含量積累明顯[11]。因此，與對(duì)照相比，外源多胺對(duì)擬南芥有一定的促進(jìn)作用，與張鳳芝等[24]研究萵苣種子萌發(fā)結(jié)果一致。

植物體H2O2的產(chǎn)生和清除保持著動(dòng)態(tài)平衡，細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量較低時(shí)，活性氧有一定的生理功能，使植物的傷害降到最低。脅迫條件下，H2O2等活性氧產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡被打破，生長(zhǎng)量高于清除量，使植物體內(nèi)H2O2等ROS含量積累。因此，H2O2在植物體內(nèi)扮演雙重角色，低濃度的H2O2可以作為信號(hào)分子參與逆境脅迫，促進(jìn)植物生長(zhǎng)和提高抗逆性，而高濃度的H2O2對(duì)細(xì)胞膜的破壞和氧化脅迫的加劇，甚至加速植物細(xì)胞程序性死亡的進(jìn)程[2,10]。研究發(fā)現(xiàn)，H2O2等ROS的含量過量會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的生物大分子氧化損害，高含量的H2O2使蛋白分子內(nèi)或分子間的二硫鍵產(chǎn)生交聯(lián)，使含有巰基的酶活性降低甚至失活，同時(shí)，H2O2還可以激活蛋白水解酶等的活性，加快植物蛋白的降解，最終使植物體內(nèi)的生理反應(yīng)受到抑制[25]。因此， NaCl處理過表達(dá)GhPAO3擬南芥時(shí)，擬南芥體內(nèi)通過NaCl脅迫和PAO氧化多胺同時(shí)產(chǎn)生H2O2，產(chǎn)生的H2O2含量超過植物體承受的閾值，對(duì)植物產(chǎn)生危害，從而表現(xiàn)對(duì)NaCl脅迫更敏感。關(guān)于擬南芥過表達(dá)GhPAO3在NaCl脅迫產(chǎn)生H2O2的閾值是后期研究工作的重點(diǎn)。