新型多肽類生物殺蟲劑GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 的研究開發(fā)與應(yīng)用進(jìn)展

譚海軍，童益利

(1.蘇州艾科爾化工科技有限公司，江蘇昆山 215300；2.江蘇龍燈化學(xué)有限公司，江蘇昆山 215300)

世界人口快速增長給糧食供應(yīng)和分配帶來巨大挑戰(zhàn)。由于可耕種土地面積有限，糧食生產(chǎn)增加主要通過提高作物產(chǎn)量來實現(xiàn)，因此有效的害蟲治理顯得尤為重要。而蚊蟲等病媒害蟲的防控還可有效阻斷由其介導(dǎo)的瘧疾、絲蟲病、登革熱和黃熱病等疾病傳播。

雖然生物防治、物理防治、農(nóng)業(yè)管理和植物檢疫等措施越來越常見，但化學(xué)防治仍舊是農(nóng)業(yè)和公共衛(wèi)生領(lǐng)域害蟲防治最有效的方法。由于化學(xué)殺蟲劑作用的分子靶標(biāo)[1]相對有限，其大量頻繁、不科學(xué)的使用使多種害蟲的抗藥性不斷出現(xiàn)和發(fā)展。隨著公眾對安全健康和環(huán)境生態(tài)的愈發(fā)關(guān)注，不少高風(fēng)險化學(xué)殺蟲劑在世界范圍內(nèi)先后被限用或禁用。加上新型殺蟲劑研發(fā)上市的成本增加、周期延長、難度加大，市場上實際可用的殺蟲劑有所減少。

近年來，以天然產(chǎn)物為來源開發(fā)高效低風(fēng)險殺蟲劑得到廣泛關(guān)注和快速發(fā)展。放線菌分泌物阿維菌素和多殺菌素，活體微生物蘇云金芽孢桿菌和桿狀病毒，植物提取物土荊芥提取物和楝油，以及源自天然蜘蛛毒肽的GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 等天然源殺蟲劑都得以成功開發(fā)和應(yīng)用。其中，新上市的多肽殺蟲劑GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 整合了化學(xué)殺蟲劑的有效性和生物制品的低風(fēng)險性，有望為農(nóng)業(yè)和公共衛(wèi)生領(lǐng)域害蟲防控提供一種持續(xù)有效的綠色新工具。目前尚未見有關(guān)該新型生物殺蟲劑的系統(tǒng)報道。本文從研發(fā)背景、通用名、序列結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制、生物活性、安全性和應(yīng)用前景等方面對GS-ω/κ-HXTX-Hv1a的研究、開發(fā)和應(yīng)用的進(jìn)展情況進(jìn)行總結(jié)，以期為GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 及同類蜘蛛毒肽品種在害蟲防控上的研究、開發(fā)和應(yīng)用提供參考和支持。

1 研發(fā)背景

早在唐代，《本草拾遺》就記載了人們利用蜘蛛毒液治療鼻衄、金瘡和痔瘡等疾病。隨著分子生物學(xué)及相關(guān)學(xué)科發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到蜘蛛毒液具有多種生理活性，含有多種復(fù)雜化學(xué)成分。其中，富含二硫鍵的小分子多肽以其多樣化作用機(jī)制而成為殺蟲劑領(lǐng)域研究開發(fā)熱點。然而，由于存在半衰期短且易分解、對有害節(jié)肢動物毒性不足、生產(chǎn)成本昂貴以及在植物體內(nèi)表達(dá)或進(jìn)入節(jié)肢動物體后容易喪失毒性等問題，這些多肽一直未能作為農(nóng)藥實現(xiàn)商業(yè)化。

源自天然蜘蛛毒素前肽裂解的系列多肽物質(zhì)中，ω/κ-HXTX-Hv1a 被認(rèn)為具有突出的穩(wěn)定性和害蟲毒性特征。由于在蜘蛛毒液中的含量極低而難以富集提取、且基因重組表達(dá)的效率和產(chǎn)量又不高，ω/κ-HXTX-Hv1a一直未能實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。美國康涅狄格州大學(xué)和澳大利亞悉尼工業(yè)大學(xué)對ω/κ-HXTX-Hv1a 的基因進(jìn)行修飾后重組表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了具有同等高殺蟲活性的多肽GS-ω/κ-HXTX-Hv1a[2]。后來，美國韋斯塔隆公司(Vestaron Corporation)采用基因工程技術(shù)將甘氨酸-絲氨酸二肽的核苷酸密碼子添加至天然蜘蛛毒肽ω/κ-HXTX-Hv1a 的基因序列上，再將其連接至合適的表達(dá)載體并通過化學(xué)方法轉(zhuǎn)化到乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis) YCT306 菌株細(xì)胞，由此得到的酵母轉(zhuǎn)化體在含甘油的培養(yǎng)基中生長而分泌出多肽GS-ω/κ-HXTX-Hv1a[3]。這種方法將甘氨酸-絲氨酸二肽連接至天然蜘蛛毒肽的N-端，在保留原有生物活性的同時使高產(chǎn)多肽酵母轉(zhuǎn)化體的數(shù)量和多肽的產(chǎn)量都增加。加之乳酸克魯維酵母菌株也用于食品添加劑乳糖酶等的生產(chǎn)，可有效解決多肽殺蟲劑生產(chǎn)成本過高問題。

2014年，韋斯塔隆公司最先在美國取得VST-006325 TGAI (30% GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 母液)和Spear T(20 g/L GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 可溶性液劑)的農(nóng)藥登記批準(zhǔn)，但直到與意大利微生物發(fā)酵合同定制研發(fā)生產(chǎn)商卡普阿生物服務(wù)公司(Capua Bioservices)達(dá)成了有關(guān)該多肽殺蟲劑的委外生產(chǎn)協(xié)議后，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 的商業(yè)化開發(fā)和應(yīng)用才得以逐步實現(xiàn)。

2 研發(fā)進(jìn)展

2.1 通用名

GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 曾以VersitudeTMpeptide、GS-ω/κ-Hexatoxin-Hv1a、GS-UACTX-Hv1a-SEQ2、GS-U-ACTX-Hv1a-SEQ2 、 M-ACTX-HV1a+2 、rU-ACTX-Hv1a、U-ACTX-Hv1a (“Hybrid”)+2 和U+2-ACTX-Hv1a 等不同名稱被廣泛研究報道、開發(fā)登記和宣傳推廣。后來，KING G F 等[4]對蜘蛛毒肽及其衍生物的命名進(jìn)行了梳理，提出廣為認(rèn)可的通用名命名規(guī)則并確定了該通用名。根據(jù)命名規(guī)則，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 表明了該多肽殺蟲劑的氨基酸序列特點、作用機(jī)制、天然來源、藥理學(xué)特征和旁系同源物(或亞型)類型(圖1)。

圖1 GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 的通用名釋義

2.2 序列結(jié)構(gòu)

GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 源 自 天 然 蜘 蛛 毒 肽ω/κ-HXTX-Hv1a，含有后者全部的氨基酸序列和藥效基團(tuán)。由于與ω-HXTX-Hv1a 和κ-HXTX-Hv1c 在基因序列上存在進(jìn)化關(guān)系[5]，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 和ω/κ-HXTX-Hv1a 都含有一些來自ω-HXTX-Hv1a 和κ-HXTX-Hv1c 的氨基酸殘基，但整體構(gòu)成上與它們存在較大差異(圖2)，如不存在κ-HXTX-Hv1c 中的相鄰半胱氨酸二硫鍵VII-VIII。GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 與天然蜘蛛毒肽[6]在氨基酸殘基序列等方面的對比見圖2 和表1。值得注意的是，這些小分子多肽的氨基酸殘基數(shù)量都在40 左右，分子量在4 000 上下，大于化學(xué)合成類殺蟲劑的但小于生物殺蟲劑蘇云金芽孢桿菌分泌的毒素蛋白的。

與表 1 中富含二硫鍵天然蜘蛛毒肽相同，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 也屬于異源扭結(jié)多肽，含有多個半胱氨酸殘基和供氫體，具有較高親水性。其中，每2 個相應(yīng)的半胱氨酸殘基通過1 個二硫鍵相連，外圍多個二硫鍵與多肽主鏈中間部分形成大環(huán)，中央一個二硫鍵穿過該環(huán)而形成一個假結(jié)，即抑制劑胱氨酸結(jié)(Inhibitor Cystine Knot，ICK)[8]。目前尚未見GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 空間結(jié)構(gòu)的報道，推測其ICK基序結(jié)構(gòu)應(yīng)與 ω-HXTX-Hv1a[9-10]相似(圖 3 為ω-HXTX-Hv1a 的ICK 基序結(jié)構(gòu))，只是在氨基酸殘基序列(圖2)、ICK 和β-片層的構(gòu)成等方面存在差異。在其多肽ICK 基序三維結(jié)構(gòu)中，扭轉(zhuǎn)后反向平行的相鄰多肽主鏈(即β-鏈)上的氨基酸殘基通過氫鍵形成多個β-橋，后者參與構(gòu)成沿著β-鏈方向呈鋸齒狀折疊延伸而形成β-片。同時，由β-鏈上靠C-端多個半胱氨酸殘基分別引出的二硫鍵緊密地排列在一起，形成了該多肽超穩(wěn)定的致密疏水(親脂)中心。由ICK 穩(wěn)定的β-片層即形成了ICK 基序，它使該多肽具有優(yōu)異的化學(xué)性質(zhì)和穩(wěn)定性，對酶以及pH、溫度、紫外線、有機(jī)溶劑和微生物等特殊環(huán)境表現(xiàn)出較好的適應(yīng)性，在節(jié)肢動物的血淋巴中也較為穩(wěn)定。ICK基序的存在保證了GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 在田間條件下對靶標(biāo)有害節(jié)肢動物防效的穩(wěn)定性。

圖2 GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 與天然蜘蛛毒肽的氨基酸殘基序列

表1 GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 和天然蜘蛛毒肽的比較

圖3 ω-HXTX-Hv1a 的ICK 基序結(jié)構(gòu)示意圖

2.3 作用機(jī)制

2.3.1 對離子通道的作用

注射ω/κ-HXTX-Hv1a 或GS-ω/κ-HXTX-Hv1a后，雙翅目、鱗翅目、鞘翅目、直翅目、蜚蠊目和蜱螨目等多種類別有害節(jié)肢動物都表現(xiàn)出了典型的神經(jīng)中毒癥狀，低劑量處理后這些昆蟲出現(xiàn)四肢不受控地收縮和行動失衡等過度興奮癥狀，接著麻痹和死亡；高劑量處理后快速麻痹和死亡[2,10]。這不同于ω-HXTX-Hv1a 處理后不依賴劑量引起的害蟲痙攣性麻痹和死亡。對美洲大蠊(Periplaneta americana)的研究表明，ω/κ-HXTX-Hv1a 通過對神經(jīng)末梢腹神經(jīng)節(jié)(Terminal Abdominal Ganglion，TAG)上的背側(cè)不成對中間神經(jīng)元(Dorsal Unpaired Median neuron，DUM)的復(fù)雜作用而影響動作電位(Action Potential，AP)的性能[6]，從而影響靶標(biāo)害蟲生存。低劑量處理可增加DUM 自發(fā)激活A(yù)P 的頻率，導(dǎo)致害蟲過度興奮；高劑量處理則相反，通過低激活頻率引起害蟲自發(fā)活動減少甚至麻痹。此外，該多肽殺蟲劑還可削弱后超極化電位(After Hyperpolariztion Potential，AHP)并延長AP 的復(fù)極化，促使神經(jīng)元突觸前膜釋放神經(jīng)遞質(zhì)并產(chǎn)生興奮反應(yīng)。高劑量處理還可使神經(jīng)元細(xì)胞膜去極化并減少AP 的振幅，引起害蟲快速麻痹。

ω/κ-HXTX-Hv1a 對AP 和AHP 性能的影響可能與電壓門控鈣離子(Voltage-gated calcium，Cav)通道[10]和大電導(dǎo)鈣離子激活的鉀離子(Large conductance calcium-activated potassium，BKCa)通道[11-12]分別受到阻塞有關(guān)。全細(xì)胞膜片鉗研究和蜚蠊BKCa基因的異源表達(dá)試驗分別證實了該多肽殺蟲劑對上述2 種離子通道電流的抑制作用[2,10]。不同的ω/κ-HXTX-Hv1a處理劑量對電流的抑制效果不同，從而對DUM 自發(fā)激活A(yù)P 頻率產(chǎn)生多種作用：低劑量處理可阻塞BKCa通道以減少AHP 幅度而使膜更快地去極化達(dá)到AP 閾值，高劑量處理可阻塞Cav通道以減緩膜去極化而降低AP 的頻率。

丙氨酸掃描定點突變研究證實，ω/κ-HXTX-Hv1a的藥效基團(tuán)由Q10 (谷氨酰胺)、P11 (脯氨酸)、N30 (天冬酰胺)、V36 (纈氨酸)和Y37 (酪氨酸)組成[8]，與ω-HXTX-Hv1a 和κ-HXTX-Hv1c 存在重疊(圖2)，同時存在后二者的藥效作用。ω/κ-HXTX-Hv1a 對Cav通道電流的抑制作用與ω-HXTX-Hv1a 大致相當(dāng)，但對BKCa通道電流的抑制作用略低于κ-HXTX-Hv1c，注射家蠅(Musca domestica)和家蟋蟀(Acheta domestica)的生物活性優(yōu)于后兩者(表2)，這說明ω/κ-HXTX-Hv1a對Cav和BKCa2 種離子通道具有協(xié)同增效作用。由于Cav通道和BKCa通道都存在于神經(jīng)元細(xì)胞膜上[13]，經(jīng)過Cav通道的鈣離子流也可激活BKCa通道，因此Cav通道的阻塞也可加強(qiáng)BKCa通道的阻塞。在靶標(biāo)害蟲體內(nèi)，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 對上述2 種離子通道的作用機(jī)制和效果與ω/κ-HXTX-Hv1a 相同或相近。

表2 ω/κ-HXTX-Hv1a 與κ-HXTX-Hv1c 和ω-HXTX-Hv1a的作用效果比較

進(jìn)一步的研究表明[18]，ω-HXTX-Hv1a 在100 nM和1 μM 劑量均可大幅度增加美洲大蠊的興奮性，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 僅在1 μM 劑量時增加了此蟲的興奮性，但都在開始和結(jié)束的時候表現(xiàn)出延遲效果。ω-HXTX-Hv1a 對家蠅和煙蚜夜蛾(Heliothisvirescens)外周神經(jīng)肌肉接頭上Cav通道無生物活性，但可阻滯家蠅、美洲大蠊和黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸的生理活動，在處理后20~30 min 引起這3 種昆蟲不可逆轉(zhuǎn)的痙攣或松弛性麻痹[19]。GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 也作用于同樣部位的突觸而對害蟲造成不可逆轉(zhuǎn)的作用，而根據(jù)其觸殺效果推測還有可能作用于外周神經(jīng)肌肉接頭。此外，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 與ω-HXTX-Hv1a對靶標(biāo)害蟲的延遲作用可能與這些多肽穿過血液-大腦的屏障需要一定時間有關(guān)。

電生理學(xué)研究結(jié)果顯示，Cav通道ω-HXTX-Hv1a和BKCa通道調(diào)節(jié)劑κ-HXTX-Hv1c都具有較好的選擇性，對靶標(biāo)有害節(jié)肢動物具有較高活性而對哺乳動物相對安全。ω-HXTX-Hv1a 對蜚蠊Cav通道電流具有較強(qiáng)的抑制作用(IC50=650 nM)[8]，且對中低壓門控Cav通道電流抑制作用大于高壓門控Cav通道[14]，但在濃度高至10 μM 時對哺乳動物的L、N 和P/Q亞型Cav通道電流均無作用[16]。κ-HXTX-Hv1c 對蜚蠊DUM 細(xì)胞膜中的鈉離子電流、鈣離子電流、延遲整流鉀離子電流或類似鉀離子電流均無作用，但對BKCa通道電流具有特異性的抑制作用(IC50=3 nM)[15]。然而，κ-HXTX-Hv1c 對大鼠背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal Root Ganglion，DRG)上的BKCa通道電流則無抑制作用，對異源表達(dá)通道電流的抑制作用比蜚蠊的低50 多倍。由于起源相關(guān)聯(lián)、序列結(jié)構(gòu)相似以及藥效基團(tuán)重疊，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 和ω/κ-HXTX-Hv1a 可視為ω-HXTX-Hv1a 和κ-HXTX-Hv1c 二者作用機(jī)制和效果的加和，也應(yīng)對哺乳動物具有較高選擇安全性。在美國登記的GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 產(chǎn)品安全性數(shù)據(jù)[20-21]及CLOYD R A 等人的研究報道[22]也證實了這一點。

2.3.2 與靶標(biāo)受體的結(jié)合

2018 年11 月，國際殺蟲劑抗性行動委員會將GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 作為第1 個作用于煙堿乙酰膽堿受體(nicotinic AcetylCholine Receptor，nAChR)位點II 的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑列入第32 組[1]，與同靶標(biāo)受體的第4 組nAChR 競爭劑(包括煙堿、吡蟲啉、噻蟲胺、氟吡呋喃酮、氟啶蟲胺腈、三氟苯嘧啶[23]和flupyrimin[24]等殺蟲劑，假定與其具有高親和性的受體亞型為nAChR1)和第5 組作用于nAChR 位點I 的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑(包括多殺菌素和乙基多殺菌素等殺蟲劑，假定與其優(yōu)先結(jié)合的受體亞型為nAChR2)，以及不同靶標(biāo)受體的其他殺蟲劑具有較低的交互抗性風(fēng)險。GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 與環(huán)氧蟲啶等nAChR 拮抗劑[25]的交互抗性情況還有待于進(jìn)一步研究。

通過阻塞軸突髓鞘上Cav通道和BKCa通道而抑制其通道電流，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 可影響神經(jīng)遞質(zhì)從突觸前膜的釋放及在突觸后膜與nAChR 的結(jié)合，使神經(jīng)傳遞受阻而影響靶標(biāo)害蟲的正常生理活動和生存。特異性配體親和性試驗研究表明[18]，ω-HXTX-Hv1a 對nAChR2的選擇性比nAChR1更明顯，而GS-ω/κ-HXTX-Hv1a和κ-HXTX-Hv1c可高親和性地對ω-HXTX-Hv1a 進(jìn)行取代，同時還可增加靶標(biāo)受體對吡蟲啉的親和力。這說明GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 可與神經(jīng)元突觸后膜上的nAChR 結(jié)合并通過正性變構(gòu)調(diào)節(jié)而使害蟲表現(xiàn)出神經(jīng)興奮效應(yīng)。最新的研究表明[26]，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 對脫敏型煙堿乙酰膽堿受體(Desensitizing nicotinic AcetylCholine Receptor，nAChDR)敏感，而對非脫敏型煙堿乙酰膽堿受體(Non-desensitizing nicotinic AcetylCholine Receptor，nAChNR)不敏感，這與nAChR 競爭調(diào)節(jié)劑一致而與作用于nAChR 位點I 的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑相反。同時，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 對nAChDR 相關(guān)通道電流存在復(fù)雜的作用：在亞納摩爾濃度下表現(xiàn)出抑制作用，而在30 nmol/L 及以上濃度時激活和增強(qiáng)煙堿乙酰膽堿誘發(fā)的電流。然而，也有一些細(xì)胞的nAChDR對GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 的作用并沒有響應(yīng)。

2.4 生物活性

室內(nèi)生測和田間藥效試驗結(jié)果表明，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 對捕食性蜘蛛的獵物如鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、半翅目和蜚蠊目等類別的節(jié)肢動物均具有較好生物活性。

2.4.1 室內(nèi)活性

GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 的生物活性與天然蜘蛛毒肽ω/κ-HXTX-Hv1a 相當(dāng)，但不同處理方式和稀釋溶劑會影響其穩(wěn)定性而對其活性產(chǎn)生較大影響。GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 對家蠅的注射LD50為76.8~81.5 pmol/g，與相同條件下ω/κ-HXTX-Hv1a (LD50=77.6 pmol/g)相當(dāng)，但略低于ω-HXTX-Hv1a (LD50=90.2 pmol/g)[3,27-28]。與進(jìn)入蟲體后被代謝分解等因素有關(guān)，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 注射的活性遠(yuǎn)優(yōu)于飼喂和噴灑的活性。100 mg/L 注射家蠅后5 h 的致死率為10%，10 g/L 飼喂南方玉米根蟲(Diabrotica undecimpunctata)幼蟲后4 d 的致死率為22%[29]，8 g/L噴灑處理擬步甲(Alphitobius diaperinus)致死率為74%[30]。ω/κ-HXTX-Hv1a 的乙醇-二甲基亞砜溶液對家蠅進(jìn)行局部處理也具有殺蟲活性，且處理腹側(cè)的殺蟲速度和效果與處理胸背相似或更高，但用水稀釋該溶液則會降低甚至完全抑制其活性[27]。

GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 的殺蟲活性還與有害節(jié)肢動物的齡期和處理時間有關(guān)，一般對低齡蟲比高齡蟲更有效，與蘇云金芽孢桿菌庫斯塔克菌種(Bacillus thuringiensiskurstaki，Btk)等其他作用機(jī)制殺蟲劑混用具有協(xié)同增效作用。室內(nèi)生測結(jié)果表明[30]，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 對 低 齡 甜 菜 夜蛾(Spodoptera exigua)藥后72~96 h 的致死率顯著低于24~48 h，與Btk混用后對甜菜夜蛾、擬步甲、蚊、馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata)和耐蘇云金芽孢桿菌的小菜蛾(Plutella xylostella)等都具有顯著協(xié)同增效作用，可使藥后72~96 h 的致死率優(yōu)于24~48 h 的或增效2.8 倍以上。與Btk相似，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 單獨處理對高齡甜菜夜蛾無效[30]，這可能與高齡害蟲產(chǎn)生復(fù)雜的腸道蛋白酶使其水解有關(guān)。

加入合適助劑或增效劑可以增強(qiáng)GS-ω/κ-HXTXHv1a 對靶標(biāo)害蟲的生物活性，但誘食劑對其活性影響相對有限。由于進(jìn)入害蟲后容易被水解或分解，該多肽殺蟲劑的殺蟲效果不如化學(xué)合成類殺蟲劑。GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 殘留局部處理對日本斑翅果蠅(Drosophila suzukii)成蟲72 h 的致死率僅為17.5%，分別與改性有機(jī)硅聚醚類潤濕劑Silwet L-77 和Leaf Life Widespread、甲基化植物油類增效劑MSO、牛脂胺聚氧乙烯醚類增效劑WaterGuard 及卵磷脂類增效劑LI-700混合后局部處理或殘留局部處理日本斑翅果蠅，或浸果處理對降低害蟲成蟲或其子代存活率具有不同程度增效作用[31-32]。除了助劑或增效劑本身對靶標(biāo)害蟲的毒性等因素，這還與它們可有效地輔助GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 的鋪展、潤濕和滲透害蟲角質(zhì)層而發(fā)揮作用有關(guān)。GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 與助劑LI-700或Silwet L-77 混用對日本斑翅果蠅成蟲及其后代種群的控制作用要優(yōu)于與誘食劑赤蘚糖醇混用，但卻都不如zeta-氯氰菊酯單用的[32]。GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 與蔗糖誘食劑和/或蘇云金芽孢桿菌以色列亞種(Bacillus thuringiensisisroelensis，Bti)混合飼喂日本斑翅果蠅對其成蟲及后代存活的影響也相對有限[31]。

2.4.2 田間藥效

GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 對椿象、大頭蟲和日本斑翅果蠅等害蟲具有較好的田間防效，可與化學(xué)合成類殺蟲劑相媲美。20 g/L GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 可溶性液劑田間藥效試驗結(jié)果顯示：以16.8 L/hm2在豆莢灌漿期施用雖不能阻止綠椿象(Chinavia hilaris)和褐斑椿象(Halyomorpha halys)對日本毛豆豆莢的損害，但可有效減少椿象種群數(shù)量，其防效與氟啶蟲胺腈、氟吡呋喃酮和環(huán)溴蟲酰胺相近，且對作物安全[33]；以28.1 L/hm2施用對日本毛豆田間的大頭蟲(Alydus eurinus)成蟲也有較好防效[34]；以27.6 L/hm2施用可有效減少高叢越橘田間的日本斑翅果蠅數(shù)量，其防效與亞胺硫磷相當(dāng)[31]；以28.6 L/hm2施用雖不能殺死藍(lán)莓的日本斑翅果蠅成蟲，但可有效減少成蟲羽化[35]。然而，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 與含誘食劑的粉色SPLAT 助劑(ACTTRA SWD TD)混合施用反而使日本斑翅果蠅成蟲的羽化率超過了對照[32]。

不同作用機(jī)制殺蟲劑交替使用可減少害蟲對特定作用機(jī)制殺蟲劑的依賴。然而，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a與多殺菌素類殺蟲劑交替施用時，即使加入玉米糖漿也不能有效地控制日本斑翅果蠅[36]；與zeta-氯氰菊酯按7 d 輪換施用對藍(lán)莓的日本斑翅果蠅的防效與常規(guī)的相近，同時對作物無藥害，但7 d 后防效不顯著[37]。根據(jù)相關(guān)產(chǎn)品在美國環(huán)保署(USEPA)的登記標(biāo)簽說明，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 制劑的藥液配制、施用方式和時間等多種因素對其田間防效至關(guān)重要。為獲得最佳防治效果，應(yīng)將GS-ω/κ-HXTX-Hv1a藥液即配即用，于害蟲侵染早期或幼蟲孵化初期對作物進(jìn)行全覆蓋的均勻噴霧。

2.5 安全性

GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 及其主要生產(chǎn)原料具有較高安全性，對哺乳動物和生態(tài)環(huán)境具有較低的毒性或風(fēng)險。生產(chǎn)發(fā)酵用的乳酸克魯維酵母菌株廣泛用于食品添加輔料的生產(chǎn)，其本身無致病性和毒性，副產(chǎn)物也不會造成風(fēng)險，細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)酵對哺乳動物也沒有影響。急性毒性試驗結(jié)果[20-21]表明，GS -ω/κ-HXTX-Hv1a在最高施用劑量下對哺乳動物、鳥、魚和水生生物無致死作用，對蜜蜂也無顯著影響和半致死作用，在濃度1 000 mg/L和100 mg/L時分別對鱒魚和大型溞無毒性作用，在劑量高至896.7 g/hm2也未觀察到對植物出苗和營養(yǎng)活力的毒害作用。同時，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a對西花薊馬(Frankliniella occidentalis)的天敵小花蝽(Orius insidiosus)成蟲的存活力和捕食能力無不利影響，對隱翅蟲(Dalotia coriaria)也無直接毒害作用[22]。

由于缺乏毒性作用而對脊椎動物實際無毒，USEPA 豁免了登記該多肽殺蟲劑所需要提交的致癌、生殖、發(fā)育和免疫毒性，對內(nèi)分泌功能和水生生物的影響，以及環(huán)境歸宿和轉(zhuǎn)移等方面的測試數(shù)據(jù)。USEPA 估算GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 在田間條件下半衰期為4 d[20-21]，鑒于多肽和蛋白質(zhì)的生物活性與特定的結(jié)構(gòu)和構(gòu)型相關(guān)，該多肽殺蟲劑在進(jìn)入環(huán)境后很可能會受水溶液和pH 等因素影響而快速喪失活性。20 g/L GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 可溶性液劑的登記要求該產(chǎn)品須在稀釋后24 h 內(nèi)施用，也說明該多肽殺蟲劑遇水后不會長時間有效。USEPA 規(guī)定該制劑最高年施用量不超過2.8 L，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)池2.0×107L 容積計算所得的預(yù)期環(huán)境濃度(Expected Environmental Concentration，EEC) 0.002 8 mg/L 遠(yuǎn)低于毒性測試值[20]。加上田間暴露半衰期很短，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 在環(huán)境中快速降解而不會達(dá)到對非靶標(biāo)生物產(chǎn)生風(fēng)險的濃度。

3 應(yīng)用進(jìn)展與前景

生物殺蟲劑具有殺蟲譜廣、環(huán)境相容性好、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，可廣泛應(yīng)用于害蟲綜合治理和抗性管理。作為一種新型的多肽類生物殺蟲劑，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 生產(chǎn)成本經(jīng)濟(jì)，且具有獨特的ICK 基序穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、協(xié)同的雙重作用機(jī)制、全新的靶標(biāo)作用位點、優(yōu)異的非靶標(biāo)安全性和環(huán)境相容性等特征，在害蟲綠色防控、昆蟲病原體改良、轉(zhuǎn)基因作物開發(fā)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。同時，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 的研究應(yīng)用還可為蜘蛛毒肽類農(nóng)藥的創(chuàng)制開發(fā)提供指導(dǎo)和支持。

3.1 害蟲綠色防控

作為為數(shù)不多的作用機(jī)制明確的生物殺蟲劑，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 具有雙重的作用機(jī)制和全新的靶標(biāo)作用位點，與現(xiàn)有殺蟲劑無交互抗性，加之其廣譜的殺蟲活性，有望成為一種重要的害蟲綜合治理和抗性防治新工具?；诨钚猿煞諫S-ω/κ-HXTX-Hv1a，韋斯塔隆公司已相繼開發(fā)出了3 個Spear ?系列產(chǎn)品[7]。其中，單劑Spear ?-T 以觸殺作用為主，主要用于溫室薊馬和粉虱的防控；與Btk的復(fù)配Spear ?-C以胃毒作用為主，主要用于毛毛蟲的防控；與蘇云金芽孢桿菌粉甲亞種(Bacillus thuringiensis tenebrionis，Btt)的復(fù)配SPEAR?-P 兼具觸殺和胃毒作用，主要用于馬鈴薯甲蟲的防控。由于對包含作物在內(nèi)的非靶標(biāo)生物安全，施用后的限制進(jìn)入時間間隔(Re-Entry Interval，REI)和安全間隔期(Plant Harvest Interval，PHI)分別僅為4 h 和0 d，Spear ?-T在食品中的最大殘留限量(Maximum Residues Limit，MRL)得到了USEPA 的豁免，并在2016 年通過了荷蘭國際園藝行業(yè)的“更有利可持續(xù)性(More Profitable Sutainability，MPS)”認(rèn)證，在2020年還獲得USEPA 評選的“綠色化學(xué)挑戰(zhàn)獎(Green Chemistry Challenge Awards)”。2017 年，韋斯塔隆公司在美國又登記了 VST-006330 EP (20%GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 可溶性液劑)和VST-006335 MP(30 g/L GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 可溶性液劑)等制劑產(chǎn)品，用于溫室薊馬、粉虱和二點斑葉螨等頑固性害蟲的綠色防控。由于同時兼顧了藥效、安全性(特別是對蜜蜂等傳粉昆蟲的低毒性)與可持續(xù)性，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 單用或者與新煙堿類殺蟲劑等殺蟲劑混用可用于鱗翅目、半翅目、鱗翅目、鞘翅目和蜱螨目等多種類別害蟲的綠色防控，其研究和應(yīng)用開發(fā)前景廣闊。

3.2 昆蟲病原體改良

通過基因重組表達(dá)將含有GS-ω/κ-HXTX-Hv1a的害蟲特異性多肽編碼基因引入昆蟲病原真菌和桿狀病毒等特異性寄主體內(nèi)，可顯著降低生防制劑施用劑量，提升對靶標(biāo)害蟲的作用速度和防治效果，避免對非靶標(biāo)生物不利影響。將GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 的編碼基因插入蝗蟲綠僵菌(Metarhizium acridum)可使后者對蝗蟲的致死劑量降低、殺滅時間縮短，蝗蟲對作物的取食消耗也相應(yīng)減少[38]。而將該編碼基因植入平沙綠僵菌(M. pingshaense)則可使后者對敏感系和抗性系的非洲瘧疾媒介岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)和科魯茲按蚊(A. coluzzii)的致死率和擊倒時間得到顯著改善，瘧蚊飛行能力減弱，采血行為減少，疾病傳播能力降低，同時結(jié)合氯菊酯等現(xiàn)有殺蟲劑施用對蚊蟲控制還具有顯著增效作用[39-40]。將GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 與鈉離子通道阻滯劑黃肥尾蝎(Androctonus australis)毒素AaIT1 共同進(jìn)行重組后于病原真菌中表達(dá)可顯著增強(qiáng)其生物活性[38-39]：重組基因在蝗蟲綠僵菌體內(nèi)表達(dá)可使生防真菌對蝗蟲的LC50、LT50和作物消耗分別降低11.5倍、43%和78%，在平沙綠僵菌體內(nèi)表達(dá)可將殺滅一半瘧蚊所需的孢子劑量減少45% (5 d)?？赡苁芴禺愋栽诳臻g和時間上與轉(zhuǎn)基因表達(dá)分離的表皮層反應(yīng)不同[41]等因素的影響，綠僵菌等昆蟲病原體的寄生特異性在重組表達(dá)后也得以保留[38]。這就使得靶標(biāo)害蟲的范圍由昆蟲病原體而不是由多肽決定，從而避免了對非靶標(biāo)生物的致病性。換言之，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 編碼基因插入昆蟲病原體在改良后者毒性效應(yīng)的同時，也賦予了自身更好的選擇性和更廣泛的用途。

隨著GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 編碼基因單獨植入或與其他基因共同植入蝗蟲綠僵菌和平沙綠僵菌并用于農(nóng)業(yè)害蟲和衛(wèi)生蟲媒防控取得成功，其在桿狀病毒等其他昆蟲病原體上的研究和應(yīng)用也值得期待。

3.3 轉(zhuǎn)基因作物開發(fā)

GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 編碼基因序列插入農(nóng)作物，有望設(shè)計出類似蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白(cry)的轉(zhuǎn)基因作物，從而賦予農(nóng)作物更好的抗蟲耐受力，使害蟲生長和活動受到抑制并引起其死亡，或減少害蟲危害而最終實現(xiàn)作物增產(chǎn)。GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 殺蟲譜廣、作用機(jī)制和靶標(biāo)位點與現(xiàn)有殺蟲劑不同，其轉(zhuǎn)基因作物對蘇云金芽孢桿菌等殺蟲劑敏感和耐受的害蟲均有效。GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 為多肽物質(zhì)，在哺乳動物體內(nèi)容易被相關(guān)酶所分解，在環(huán)境中也會受到pH、溫度、紫外線和微生物等影響而被降解，使得該類轉(zhuǎn)基因作物具有較高的安全性。雖然目前尚未見GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 編碼基因序列農(nóng)作物的研究報道，可以預(yù)見該多肽殺蟲劑作為轉(zhuǎn)基因作物研究開發(fā)具有巨大潛力。

3.4 新農(nóng)藥創(chuàng)制

作為一種全新的生物殺蟲劑，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a的成功開發(fā)為新農(nóng)藥創(chuàng)制提供了新的思路和指導(dǎo)，對GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 進(jìn)行化學(xué)修飾或生物融合有望加強(qiáng)其效能，促進(jìn)同類殺蟲劑研究開發(fā)。一方面，對GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 進(jìn)行化學(xué)修飾或改性可提高其生物活性和藥效穩(wěn)定性，如溫度和pH 變化引起的GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 脫水和/或脫氨，以及進(jìn)一步的肼解，可增強(qiáng)或提高其親脂性和殺蟲活性。研究表明[26]，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 脫水產(chǎn)物內(nèi)酯(圖4 化合物II) 10 g/L 對南方玉米根蟲飼喂后4 d 的致死率比GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 增加4 倍多，進(jìn)一步肼解產(chǎn)物酰肼(圖4 化合物III) 100 mg/L 對家蠅注射后5 h的致死率也比GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 增加8 倍左右。

圖4 GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 的脫水和肼解

另一方面，與其他多肽或蛋白融合可提高GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 穿過有害節(jié)肢動物腸道上皮細(xì)胞進(jìn)入血淋巴、到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用位點的效率，在不影響其對非靶標(biāo)生物安全性的同時增加對靶標(biāo)害蟲的生物活性。將天然蜘蛛毒素ω-HXTX-Hv1a或地窖蛛(Segestria florentina)毒素SFI1 融合至運(yùn)載蛋白雪花蓮凝集素(Galanthus nivalisagglutinin，GNA)可有效提高對靶標(biāo)害蟲甘藍(lán)夜蛾(Mamestra brassicae)、水稻褐飛虱(Nilaparvata lugens)和桃蚜(Myzus persicae)的急性經(jīng)口毒性，并引發(fā)發(fā)育延緩、繁殖能力降低等半致死效應(yīng)[42-43]，同時對傳粉昆蟲蜜蜂的存活、嗅覺學(xué)習(xí)和記憶能力等無不利影響[44]。作為上述2種毒素多肽的類似物，將GS-ω/κ-HXTX-Hv1a融合至GNA 等功能性蛋白有望實現(xiàn)相似的作用效果，從而實現(xiàn)對靶標(biāo)害蟲更有效的控制。

4 總結(jié)與展望

含有ICK 基序的蜘蛛毒肽及其衍生物是一種相對穩(wěn)定的多肽或微型蛋白質(zhì)，通過作用于神經(jīng)元離子通道和靶標(biāo)受體使有害節(jié)肢動物快速表現(xiàn)出神經(jīng)中毒癥狀，并逐步喪失活動能力直至最終死亡。它們不僅具有潛在經(jīng)口毒性，還可在霧化后透過體表從氣孔進(jìn)入害蟲體內(nèi)而發(fā)揮觸殺作用，可作為殺蟲劑單獨施用。源自澳大利亞漏斗網(wǎng)蜘蛛的新型多肽殺蟲劑GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 的成功開發(fā)，有力證實多肽可直接作為生物農(nóng)藥進(jìn)行商業(yè)化開發(fā)和應(yīng)用。

作為天然蜘蛛毒肽ω/κ-HXTX-Hv1a 的一種重要衍生物，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 在工業(yè)上可由其編碼基因修飾后的酵母轉(zhuǎn)化體分泌生產(chǎn)獲得。用GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 替代ω/κ-HXTX-Hv1a 進(jìn)行開發(fā)，不僅保持了天然毒肽的殺蟲活性，還顯著地提高了發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)量，生產(chǎn)成本更經(jīng)濟(jì)，但GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 的含量和產(chǎn)量還有進(jìn)一步提升的空間。有關(guān)該多肽殺蟲劑規(guī)?；a(chǎn)的基因重組與表達(dá)、純化與分離制備等還鮮見報道，如何進(jìn)一步提高其產(chǎn)量品質(zhì)并降低生產(chǎn)成本值得深入研究。

GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 對靶標(biāo)害蟲的神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元Cav和BKCa2 種離子通道具有協(xié)同的雙重作用機(jī)制，對靶標(biāo)受體及其位點也與現(xiàn)有的殺蟲劑不同，對非靶標(biāo)生物也具有較高的安全性，在農(nóng)業(yè)和公共衛(wèi)生領(lǐng)域的害蟲防控上具有廣闊的應(yīng)用前景。從GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 的室內(nèi)生測和田間試驗結(jié)果來看，無論是單獨處理還是與助劑或其他殺蟲劑混合或輪換施用，其藥效、穩(wěn)定性都還有待于進(jìn)一步提高、改善。該產(chǎn)品在非農(nóng)領(lǐng)域的用途也有待開拓，建議從以下幾個方面促進(jìn)或加強(qiáng)GS-ω/κ-HXTX-Hv1a的研究和應(yīng)用開發(fā)：

⑴ 篩選具有分散、潤濕、滲透和穩(wěn)定等作用的功能性助劑及其混用配比，促進(jìn)GS-ω/κ-HXTX-Hv1a透過害蟲表皮進(jìn)入體內(nèi)與靶標(biāo)位點結(jié)合，增強(qiáng)藥劑的耐雨水沖刷和抗紫外線等性能，提升藥效穩(wěn)定性。GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 水中穩(wěn)定性較低，通過改進(jìn)劑型以提高其藥效穩(wěn)定性也具有重要意義。

⑵ 開發(fā)與其他作用機(jī)制生物農(nóng)藥或化學(xué)農(nóng)藥的復(fù)配，通過不同作用機(jī)制協(xié)同發(fā)揮增效作用、擴(kuò)大殺蟲譜和延緩害蟲抗藥性。如與Btk或Btt復(fù)配對GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 穿過腸道可起到促進(jìn)作用，而多重的作用機(jī)制和作用位點又使其藥效得以疊加增強(qiáng)，殺蟲譜得以擴(kuò)大。

⑶ 開發(fā)與GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 特點相適應(yīng)的使用技術(shù)和生產(chǎn)實踐，選擇合適的施用方法、時間和輪換策略，結(jié)合多種防治措施對多種害蟲進(jìn)行綜合治理和抗性管理，延長產(chǎn)品的生命周期。

作為一種農(nóng)藥新競品，需要具備更經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)成本、更短的環(huán)境持久性、更高的經(jīng)口/接觸生物利用度和效能、更高的田間穩(wěn)定性、更便捷的施用方法，以及更低的非靶標(biāo)生物毒性和非致死作用[45]等優(yōu)勢。為了成為實際可用的害蟲治理新工具并在市場上占有一席之地，加強(qiáng)、深化并拓展 GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 在生產(chǎn)研發(fā)、害蟲綠色防控、昆蟲病原體改良、轉(zhuǎn)基因作物開發(fā)和新農(nóng)藥創(chuàng)制等研究和應(yīng)用方面的創(chuàng)新性開發(fā)就顯得尤為重要。隨著公眾對安全健康和環(huán)境生態(tài)的關(guān)注、農(nóng)藥減量增效和保護(hù)生物多樣性等行動的開展以及生物農(nóng)藥的迅猛發(fā)展，GS-ω/κ-HXTX-Hv1a 及同類蜘蛛毒肽類生物農(nóng)藥的未來發(fā)展可期。