肉雞屠宰環(huán)節(jié)中金黃色葡萄球菌的流行及分子特征和耐藥性

張鵬飛，徐 旭，王 婷，楊雪微，張 萌，寇明瑩，阮傅倩，萬陽麗，吳 倩，王 新,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.綿陽師范學(xué)院，四川 綿陽 621000）

金黃色葡萄球菌是一種常見的人畜共患病原微生物，常存在于人和動(dòng)物的皮膚和黏膜。它也是葡萄球菌屬中致病性較強(qiáng)的菌種之一，可引發(fā)多種禽類疾病，包括關(guān)節(jié)炎、葡萄球菌敗血癥、滑膜炎、臍炎和卵黃囊感染。由于金黃色葡萄球菌是人類和家畜共生菌群的一部分，被金黃色葡萄球菌定植的雞常常沒有任何癥狀而在市場流通。這表示定植金黃色葡萄球菌的雞在屠宰和售賣過程中不僅有污染其他產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)，也可能通過食品鏈傳播給人類。人們通常食用加熱后的食物，高溫雖然可以殺死病原微生物，金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的毒素如腸毒素，在100 ℃處理30 min后，仍具有生物活性。當(dāng)食用20～100 ng的腸毒素即可引發(fā)食物中毒。目前已有27 種腸毒素被發(fā)現(xiàn)，包括5 種經(jīng)典腸毒素（～）和22 種新型腸毒素（～）。

近些年動(dòng)物飼養(yǎng)過程中抗生素的使用已受到嚴(yán)格的控制，但耐藥菌引發(fā)的感染一直在穩(wěn)步上升。動(dòng)物被認(rèn)為是耐藥細(xì)菌的儲(chǔ)庫，與動(dòng)物密切接觸的獸醫(yī)、屠夫、家畜養(yǎng)殖戶等也常常檢測到相關(guān)耐藥細(xì)菌。無癥狀攜帶耐藥金黃色葡萄球菌的家畜，不僅增加了病原菌通過動(dòng)物到人傳播的風(fēng)險(xiǎn)，也可能造成食品污染。此外，較差的屠宰場環(huán)境及加工人員的個(gè)人衛(wèi)生，也可加重肉類的污染，并沿著生產(chǎn)鏈條進(jìn)一步傳播。研究表明屠宰場中的金黃色葡萄球菌流行率明顯高于在農(nóng)場的流行率。耐藥細(xì)菌沿農(nóng)場、加工環(huán)節(jié)到食物鏈，對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成間接風(fēng)險(xiǎn)。因此，對(duì)屠宰環(huán)節(jié)食源性致病菌的耐藥性監(jiān)測具有重要意義。

分子分型技術(shù)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)院、社區(qū)、動(dòng)物和食品的金黃色葡萄球菌流行病學(xué)分析。分子分型能較好地解釋金黃色葡萄球菌分離株的遺傳多樣性和菌株間的關(guān)系。目前，一些分型基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）快速、簡便的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于分離菌株的鑒定，包括葡萄球菌蛋白A（staphylococcal protein A，SPA）分型、多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）和腸桿菌科基因間重復(fù)序列PCR（enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR，ERIC-PCR）分型等。其中SPA和MLST分型重復(fù)性高、國際標(biāo)準(zhǔn)命名等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛使用，適用于長期追蹤菌株間遺傳關(guān)系。通過對(duì)世界各地不同來源克隆類型的比較，可以了解疾病和特定克隆之間的相關(guān)性及親緣關(guān)系，也有助于確定克隆起源和找到特定克隆的獨(dú)特特征。例如，歐美地區(qū)生豬主要流行的分子型為ST398，而亞洲包括中國在內(nèi)主要分子型ST9。此外，有報(bào)道稱特定的分子類型與SEs之間具有高度的相關(guān)性。ST5型菌株與基因簇（、、、、和），ST6-t701型菌株與和ST59型菌株與-有高度相關(guān)性。另外，ERIC-PCR分型基于重復(fù)的DNA序列被一個(gè)引物擴(kuò)增，產(chǎn)生多條DNA圖譜，適用于各實(shí)驗(yàn)室快速準(zhǔn)確追蹤某些菌株的傳播，加快傳播分析和方便感染控制。通過不同方法分型，可以了解菌株的毒力、傳播能力變化，進(jìn)而推導(dǎo)出菌株的致病性特點(diǎn)，提早預(yù)防菌株對(duì)人類造成的危害。

目前，已有對(duì)零售雞肉中金黃色葡萄球菌的相關(guān)報(bào)道。但關(guān)于屠宰環(huán)節(jié)中金黃色葡萄球菌污染的報(bào)道還比較少，尤其是對(duì)不同加工環(huán)節(jié)。因此本研究旨在調(diào)查肉雞屠宰過程中活雞肛拭、浸燙、預(yù)冷、分割和貯存環(huán)節(jié)的金黃色葡萄球菌的污染情況；評(píng)估不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)是否存在交叉污染；了解不同屠宰環(huán)節(jié)分離株分子特征及耐藥性。通過對(duì)不同環(huán)節(jié)的監(jiān)測，識(shí)別加工環(huán)節(jié)污染的關(guān)鍵控制點(diǎn)，可以有效預(yù)防及控制食源性疾病的暴發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

為了解肉雞屠宰場在不同屠宰環(huán)節(jié)中金黃色葡萄球菌的污染情況及菌株的分子特征和耐藥性，本研究于2016年12月—2017年3月對(duì)陜西省某肉雞屠宰場不同屠宰環(huán)節(jié)進(jìn)行4 次樣本的采集。此次，從5 個(gè)屠宰環(huán)節(jié)中，共收集樣本144 份，包括：活雞肛拭子（G）20 份、浸燙褪毛后整雞胴體樣本（J）30 份、預(yù)冷池后整雞胴體樣本（Y）30 份、分割后冷凍前雞胸脯肉樣本（F）32 份和貯存過程雞胸脯肉樣本（P）32 份，具體樣品采樣信息如表1所示。

表1 樣品采集時(shí)間、類型和數(shù)量Table 1 Sample collection times, types and quantities

胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）、甘露醇高鹽瓊脂、Baird-Parker培養(yǎng)基基礎(chǔ)、亞碲酸鹽卵黃增菌液、緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）、7.5%氯化鈉肉湯和Mueller-Hinton瓊脂（mueller-hinton agar，MHA） 青島高科園海博科技生物技術(shù)有限公司；PCR所用試劑 南京諾唯贊生物科技有限公司；藥敏試驗(yàn)16 種待測抗生素 北京索萊寶科技有限公司；引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-221B恒溫培養(yǎng)振蕩搖床 上海智成分析儀器制造有限公司；GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；580BR-7101 PCR儀、GEL DOC XR＋凝膠成像 美國伯樂公司；UPHW-IV-90T超純水機(jī) 四川優(yōu)普超純科技術(shù)有限公司；MDF-U5411高壓滅菌鍋 上海申安高壓儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集

主要針對(duì)活雞肛拭、浸燙、預(yù)冷、分割、貯存環(huán)節(jié)進(jìn)行樣本的收集，每個(gè)環(huán)節(jié)收集（7f2）個(gè)樣本，并將收集的樣本置于無菌Stomacher3500塑料袋（雞胴體或雞胸脯肉）或50 mL無菌離心管（肛拭子），記錄相關(guān)信息后，低溫運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，其間隔不超過4 h。

1.3.2 樣品處理

雞胴體或雞胸脯肉：向采樣袋中加入一定量的無菌BPW（500 mL/kg），充分揉搓肉雞各個(gè)部位4～5 min。

肛拭子：向裝有肛拭子樣本的50 mL離心管中加入20 mL無菌BPW。

1.3.3 菌株的分離鑒定

參照Wang Xin等的方法對(duì)樣本中金黃色葡萄球菌進(jìn)行分離鑒定。首先將處理好的樣本于空氣搖床37 ℃、100～120 r/min培養(yǎng)18～24 h。接著，挑一環(huán)增菌液于Baird-Parker平板37 ℃培養(yǎng)16～18 h。挑取菌落直徑為2～3 mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈的菌落，劃線于甘露醇高鹽瓊脂平板37 ℃培養(yǎng)18～24 h。挑取顏色呈黃色的菌落純化于TSA平板37 ℃培養(yǎng)18～24 h。最后，通過PCR擴(kuò)增金黃色葡萄球菌特異性基因進(jìn)行鑒定。將鑒定為陽性菌株于－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 DNA提取

挑單克隆于無菌TSB肉湯中220 r/min，37 ℃振蕩培養(yǎng)12～16 h，取1 mL細(xì)菌培養(yǎng)液于無菌EP管內(nèi)，12 000 r/min離心2 min，棄上清液，余下操作嚴(yán)格按Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。最后將提取的DNA模板至于－20 ℃冰箱保存。

1.3.5 毒素編碼基因及耐藥基因檢測

運(yùn)用PCR技術(shù)對(duì)分離的菌株進(jìn)行23 種毒素編碼基因和27 種耐藥基因檢測。其中23 種毒素編碼基因包括：21 種腸毒素編碼基因（、、、、、、、、、、、、、、、、、、、和）、中毒休克綜合征毒素編碼基因（）和殺白細(xì)胞毒素編碼基因（）；27 種耐藥基因包括：大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因（、、、、和）、四環(huán)素耐藥基因（、、和）、氨基糖苷類耐藥基因（’/’’、’和’）、氯霉素耐藥基因（、、、和）、甲氧芐啶耐藥基因（、、和()）、-內(nèi)酰胺類耐藥基因（和）和糖肽類耐藥基因（、和/）。

參照Li Guanghui等描述引物序列進(jìn)行引物合成。擴(kuò)增反應(yīng)的最終體積為25 μL，其中引物F/R（100 mmol/L）各1 μL、GreenMix 12.5 μL、模板DNA 5 μL和雙蒸餾水5.5 μL。PCR條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。最后PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%（g/100 mL）瓊脂糖在0.5hTris-Borate-EDTA緩沖液中進(jìn)行電泳，并在凝膠成像儀上拍照觀察。

1.3.6 耐藥性檢測

參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的瓊脂稀釋法對(duì)32 株分離株菌株進(jìn)行16 種常用抗生素耐藥性實(shí)驗(yàn)。具體使用藥物及最小抑制濃度（minimum inhibitory concentrations，MICs）見表2。此外，藥敏實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 29213和大腸桿菌ATCC 25922，均由實(shí)驗(yàn)室保存。

表2 藥敏測定用抗生素及MICsTable 2 MICs of antibiotics tested for susceptibility

1.3.7 分子分型

所有金黃色葡萄球菌分離株均進(jìn)行SPA、MLST和ERIC-PCR分型。MLST分型：通過對(duì)7 個(gè)管家基因（、、、、、和）進(jìn)行擴(kuò)增和測序，對(duì)測序結(jié)果通過金黃色葡萄球菌MLST數(shù)據(jù)庫（http://saureus.mlst.net/）比對(duì)獲得ST型。SPA分型：通過擴(kuò)增基因并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，將序列通過金黃色葡萄球菌SPA數(shù)據(jù)庫（https://www.spaserver.ridom.de/）比對(duì)分析，獲得SPA分型。ERIC-PCR分型：通過對(duì)基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后獲得電泳圖譜。ERIC-PCR圖譜使用Bionumerics 3.0軟件的UPGMA和Dice參數(shù)進(jìn)行聚類分析，確定不同屠宰環(huán)節(jié)金黃色葡萄球菌分離株親緣關(guān)系。DNA Marker 2000作為參考條帶。ERIC-PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min和72 ℃延伸4 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Minitab16.2.3對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用檢驗(yàn)對(duì)不同環(huán)節(jié)金黃色葡萄球菌陽性樣本數(shù)、毒素編碼基因、耐藥基因和耐藥分離株陽性數(shù)進(jìn)行差異分析，并對(duì)分離株常見分子分型與毒素編碼基因之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌檢出情況

由表3可知，對(duì)收集到的144 份樣品進(jìn)行選擇培養(yǎng)和基因鑒定，共有32 份樣品被金黃色葡萄球菌污染，污染率為22.2%（32/144）。除肛拭樣本未有金黃色葡萄球菌檢出外，其余環(huán)節(jié)均有檢出。其中浸燙環(huán)節(jié)（40.0%，12/30）檢出率最高，其次為分割環(huán)節(jié)（26.7%，8/30）、預(yù)冷環(huán)節(jié)（21.9%，7/32）和配送貯存環(huán)節(jié)（15.6%，5/32）。不同屠宰環(huán)節(jié)中，金黃色葡萄球菌陽性樣本數(shù)差異顯著（＜0.05），包括浸燙環(huán)節(jié)樣本金黃色葡萄球菌檢出明顯高于肛拭和配送環(huán)節(jié)樣本，預(yù)冷和分割樣本高于肛拭樣本。

表3 不同屠宰環(huán)節(jié)中金黃色葡萄球菌的流行情況Table 3 Prevalence of S.aureus in different slaughtering stages

2.2 毒素編碼基因檢出情況

由表4可知，23 種被檢毒素編碼基因中16 種毒素編碼基因被檢出，其中基因檢出率最高，為53.1%（17/32），其次為（43.8%，14/32），、i、、和（34.4%，11/32），（31.3%，10/32），、和（18.8%，6/32）和、、、和（3.1%，1/32）。7 種毒素編碼基因、、、、、和未被檢出。此外，96.9%（31/32）的菌株至少攜帶1 種毒素編碼基因，共有7 種毒素編碼基因譜。其中頻繁檢出的毒素編碼基因譜為（25.0%，8/32）、-----（21.9%，7/32）、（18.8%，6/32）、---（15.6%，5/32）和------（15.6%，5/32）。不同環(huán)節(jié)樣本分離株毒素編碼基因攜帶情況，無顯著差異（＞0.05）。

表4 不同屠宰環(huán)節(jié)中金黃色葡萄球菌毒素編碼基因攜帶率Table 4 Carrying rates of virulence genes in S.aureus at different slaughtering stages

2.3 耐藥情況

由表5可知，27 個(gè)所測耐藥基因中，僅有4 個(gè)耐藥基因被檢出。其中檢出最高87.5%（28/32），其次為81.3%（26/32）、和’/’’56.3%（18/32）。此外，32 株分離株共有4 種耐藥基因譜，其中，最常檢出的耐藥基因譜為---’/’’（50.0%，16/32），其次為-（31.3%，10/32）和--’/’’（6.3%，2/32）。不同環(huán)節(jié)樣本分離株耐藥基因攜帶情況，無顯著差異（＞0.05）。

表5 不同屠宰環(huán)節(jié)中金黃色葡萄球菌的耐藥基因攜帶率Table 5 Carrying rates of drug resistance genes in S.aureus at different slaughtering stages

由表6可知，所有菌株對(duì)所測抗生素均表現(xiàn)出不同程度的耐受，都至少耐受4 種抗生素。其中對(duì)T/S耐藥最為普遍（100.0%，32/32），其次為AMP和PEN（96.9%，31/32）、TET（78.1%，25/32）、ERY（62.5%，20/32）、GEN（31.3%，10/32）、CIP（28.1%，9/32）、FOX和FOP（3.1%，1/32）。所有菌株對(duì)OXA、CHL、RIF、VAN、A/C、AMK和LZD等抗生素敏感。此外，32 株分離株共有8 種耐藥譜，其中，最常檢出的耐藥譜為AMP-TET-T/S-PEN（34.4%，11/32），其次為AMP-ERY-TET-CIP-T/S-PEN（28.1%，9/32）、AMPERY-T/S-PEN-GEN（18.8%，6/32）、AMP-ERY-TETT/S-PEN-GEN（6.3%，2/32）、AMP-ERY-T/S-PEN、AMP-ERY-TET-T/S-PEN、ERY-TET-T/S-PEN和AMPTET-FOX-FOP-T/S-PEN-GEN（3.1%，1/32）。不同環(huán)節(jié)樣本分離株耐藥情況無顯著性差異（＞0.05）。

表6 不同屠宰環(huán)節(jié)中金黃色葡萄球菌耐藥率Table 6 Drug resistance rates of S.aureus at different slaughtering stages

2.4 分子分型

對(duì)所有的分離株進(jìn)行SPA、MLST和ERIC-PCR分型，結(jié)果如圖1所示。32 株分離株共有5 種SPA分型、3 種ST型和4 種ERIC-PCR分型。對(duì)于SPA分型，主導(dǎo)分子型為t091（14/32，43.8%），其次為t010（31.3%，10/32）、t437（18.8%，6/32），t002和t441（3.1%，1/32）。對(duì)于ST分型，主導(dǎo)分子型為ST7（43.8%，14/32），其次為ST5（34.4%，11/32）和ST59（21.9%，7/32）。對(duì)于ERIC分型，32 株分離株ERIC-PCR圖譜擴(kuò)增條帶清晰，條帶大小在100～2 000 bp之間，擴(kuò)增條帶數(shù)介于4～6 條。采用Bionumerics分析軟件對(duì)ERICPCR圖譜進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示32 株分離株共分為4 個(gè)簇。其中I3簇分離株最多占所有分離株的46.9%（15/32），其次為I4簇（21.9%，7/32），I1簇和I2簇（15.6%，5/32）。此外，4 個(gè)簇中均存在不同屠宰環(huán)節(jié)樣本分離株（I1～I(xiàn)4）。

圖132 株金黃色葡萄球菌ERIC-PCR、SPA、ST分型、毒力編碼基因譜、耐藥基因譜和耐藥譜的聚類圖Fig.1 Dendrogram showing ERIC-PCR, SPA, ST typing, virulence gene profiles, resistance gene profiles and antimicrobial resistance profiles of 32 S.aureus isolates

2.5 分子型與毒素編碼基因相關(guān)性分析

由表7可知，對(duì)不同分型與攜帶腸毒素編碼基因之間的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果表明金黃色葡萄球菌的主要分子型與腸毒素編碼基因之間關(guān)聯(lián)性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。ST7-t091、ST5-t010和ST59-t437分別攜帶、-----和--基因譜。

表7 分離株分子型與毒素基因相關(guān)性分析Table 7 Correlation analysis between molecular types and virulence genes of isolates

3 討 論

在中國，雞肉是僅次于豬肉的第2大肉類消費(fèi)品。隨著雞肉消費(fèi)量的增多，雞肉安全就顯得尤為重要。目前，屠宰加工環(huán)節(jié)被認(rèn)為是食物污染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。而金黃色葡萄球菌作為人類共生菌定植在人皮膚和黏膜，在食品加工過程中很可能造成食物污染。此外，金黃色葡萄球菌也常常定植在加工設(shè)備，在食物加工過程中存在安全隱患。

本研究對(duì)陜西省某肉雞屠宰場不同屠宰加工環(huán)節(jié)進(jìn)行金黃色葡萄球菌污染監(jiān)測，144 份樣本中32 份（22.2%）檢測到金黃色葡萄球菌。謝建華和王琳等分別對(duì)重慶和山東不同屠宰環(huán)節(jié)監(jiān)測中，均發(fā)現(xiàn)肉雞樣本中存在金黃色葡萄球菌污染。Sadiq等報(bào)道巴基斯坦屠宰場也有金黃色葡萄球菌檢出，且耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢出率達(dá)39.3%（118/300）。由此說明，國內(nèi)外雞屠宰環(huán)節(jié)中普遍存在金黃色葡萄球菌的污染。此外，有研究報(bào)道稱屠宰環(huán)節(jié)金黃色葡萄球菌的檢出率與季節(jié)存在明顯的聯(lián)系。夏秋兩季屠宰環(huán)節(jié)金黃色葡萄球菌的檢出率要高于春季和冬季。本研究屠宰環(huán)節(jié)金黃色葡萄球菌的檢出率明顯低于謝建華等報(bào)道夏秋兩季59.25%。這可能由于春節(jié)前后溫度較低，不利于微生物生長。

對(duì)活雞肛拭、浸燙、預(yù)冷、分割和貯存5 個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)除活雞肛拭樣本無檢出外，其余樣本均有檢出。王會(huì)生等對(duì)甘肅省兩個(gè)城鎮(zhèn)5 個(gè)養(yǎng)雞場的研究中，肛拭子樣本也無金黃色葡萄球菌檢出。這一結(jié)果表明活雞金黃色葡萄球菌的攜帶率較低，后期屠宰加工環(huán)節(jié)是造成雞胴體污染的主要原因。在屠宰環(huán)節(jié)中，浸燙環(huán)節(jié)被認(rèn)為是污染的主要環(huán)節(jié)，本研究浸燙褪毛后雞胴體金黃色葡萄球菌的檢出高于與其他環(huán)節(jié)。這可能是因?yàn)楦街谟鹈?、皮膚、鼻腔等外表皮的金黃色葡萄球菌，在褪毛時(shí)沾染在加工設(shè)備表面，造成雞胴體污染。且褪燙環(huán)節(jié)褪毛不徹底時(shí)，需增加人工作業(yè)，人工攜帶病原體或人工沾染病原體后繼續(xù)工作均會(huì)造成重復(fù)污染。預(yù)冷環(huán)節(jié)中消毒劑可以殺死雞胴體表面的金黃色葡萄球菌。本研究預(yù)冷環(huán)節(jié)雞胴體金黃色葡萄球菌的檢出率明顯低于浸燙褪毛環(huán)節(jié)，但仍有21.9%的樣本被污染，這可能與消毒池內(nèi)消毒劑的濃度有關(guān)。王琳等也在預(yù)冷環(huán)節(jié)雞胴體中檢測到了金黃色葡萄球菌。因此，實(shí)時(shí)監(jiān)測預(yù)冷池中消毒劑的有效濃度是很有必要的。分割環(huán)節(jié)中金黃色葡萄球菌檢出率又有所升高，這一結(jié)果與謝建華等的報(bào)道一致。王琳等對(duì)屠宰環(huán)節(jié)金黃色定量評(píng)估研究中指出，工人手部和刀具等環(huán)境因素中的金黃色葡萄球菌都會(huì)額外增加生產(chǎn)線上雞肉的污染風(fēng)險(xiǎn)。此外，貯存環(huán)節(jié)15.6%樣本檢測為金黃色葡萄球菌陽性，提示需加強(qiáng)對(duì)屠宰加工環(huán)節(jié)的關(guān)鍵污染點(diǎn)進(jìn)行預(yù)防和控制，防止致病菌進(jìn)入食物鏈，對(duì)人體健康造成威脅。

近年來，耐多藥金黃色葡萄球菌在食物中檢出的報(bào)道越來越多，尤其是動(dòng)物源食品。這是一個(gè)由眾多因素造成的全球性問題，特別是抗生素的濫用和誤用。在美國、埃及、中國等國家零售雞肉中耐多藥金黃色葡萄球菌已有報(bào)道。本研究，所有菌株至少同時(shí)對(duì)4 種所測抗生素耐受，60%以上菌株分別對(duì)氨芐西林、青霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素和紅霉素耐藥和30%左右菌株分別對(duì)慶大霉素和環(huán)丙沙星耐藥。已有研究報(bào)道，來自家禽養(yǎng)殖、加工和貯存環(huán)境分離株普遍耐受四環(huán)素。這與四環(huán)素便宜、副作用小等特點(diǎn)，普遍在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用于家禽養(yǎng)殖有關(guān)。且家禽金黃色葡萄球菌分離株編碼四環(huán)素耐藥表型的基因常為，也與本研究一致。此外，分離株對(duì)紅霉素抗生素耐藥也很普遍，不同的是其他研究報(bào)道中最常檢出編碼基因?yàn)?，而本研究僅有基因被檢出。這一結(jié)果表明具有相同耐藥表型的金黃色葡萄球菌株可能攜帶不同的耐藥基因。此外，Ogundipe等對(duì)尼日利亞西南部家禽養(yǎng)殖場和活禽市場中的人、雞、雞肉和環(huán)境樣本中進(jìn)行耐藥性檢測，發(fā)現(xiàn)雞肉分離株主要對(duì)四環(huán)素和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑耐藥，而人源分離株主要對(duì)紅霉素和慶大霉素耐藥。考慮到紅霉素常用于人類被細(xì)菌感染時(shí)的治療，因此，推測在加工過程中定植于人類的致病菌可能通過加工環(huán)節(jié)污染雞胴體及其制品。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氨芐西林、紅霉素、四環(huán)素和慶大霉素耐藥菌株的表型和基因型并不總一致。菌株對(duì)抗生素耐受是一個(gè)復(fù)雜的過程，可能還存在其他因素介導(dǎo)菌株耐藥。

本研究中除一株不攜帶任何毒素編碼基因外，其余均至少攜帶一種毒素編碼基因。其中96.9%（31/32）的菌株攜帶新型腸毒素編碼基因。美國俄克拉荷馬州和土耳其國家對(duì)雞源金黃色葡萄球菌的研究中，也檢測到了新型腸毒素編碼基因，國內(nèi)陳瑤、徐本錦等檢出新型腸毒素編碼基因且占比靠前。盡管，經(jīng)典腸毒素是引發(fā)食物中毒的主要原因，新型腸毒素編碼基因近些年在不同食物中的頻繁檢出，不應(yīng)忽視。已有報(bào)道食用新型腸毒素污染的食物引發(fā)人食物中毒。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)分子型與毒素編碼基因顯著相關(guān)（＜0.05）。攜帶基因的菌株，分子型均為ST7-t091。與之相似的，ST5-t010/t002分子型菌株均攜帶完整基因簇基因（-----）和ST59-t437型菌株均攜帶--基因譜。由于大部分腸毒素編碼基因位于可移動(dòng)的遺傳元件上，不同遺傳譜系攜帶特定腸毒素編碼基因。不同毒力基因或毒力基因的組合也賦予了該類型菌株獨(dú)特的致病性和感染力。Yang Xiaomei等報(bào)道，ST7-t091是我國食物中毒分離株優(yōu)勢分子型，且該分型分離株普遍攜帶基因。與本研究不同的是ST7-t091僅攜帶基因，與擁有相近的序列且均位于φSa3致病島，導(dǎo)致食物中毒的危害不容忽視?；虼鼗蛭挥趘Saβ致病島，被報(bào)道與中毒性休克綜合征、猩紅熱和人類特應(yīng)性濕疹有關(guān)。Gu Feifei等報(bào)道，在上海某醫(yī)院中ST5型菌株已經(jīng)超越ST239成為主要分子型菌株。被報(bào)道可以加重鼻黏膜屏障的破壞和肺炎感染，與和同位于SaPI3致病島上，且常常發(fā)現(xiàn)于亞洲社區(qū)感染的主要克隆系ST59-t437菌株中。

32 株分離株共鑒定出5 種分子型，ST7-t091、ST5-t010/t002和ST59-t437/t441。其中ST7-t091檢出最高，這與Krupa等的研究中雞源金黃色葡萄球菌的優(yōu)勢分型一致。Ayeni等在尼日利亞南部的家禽樣本中也發(fā)現(xiàn)t091型菌株。由此推測，ST7-t091可能是禽肉中的優(yōu)勢分子型。另一種家禽常見的分型為ST5，在褪毛、預(yù)冷、分割和貯存環(huán)節(jié)樣品中均有檢出。與本研究不同的是，ST5型菌株常被檢出的SPA型為t002，而本研究中11 株ST5型菌株僅有1 株為t002，其余均為t010。此外，在本研究還發(fā)現(xiàn)了與社區(qū)感染相關(guān)的分子型ST59-t437，ST59-t437分型菌株的檢出也提示在動(dòng)物屠宰過程也會(huì)受到外源性病原體的污染。ST7-t091、ST5-t010和ST59-t437分型菌株均在浸燙褪毛環(huán)節(jié)開始出現(xiàn)，在后續(xù)環(huán)節(jié)中幾乎連續(xù)檢出，這說明浸燙褪毛環(huán)節(jié)是金黃色葡萄球菌污染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。不同采樣批次且不同屠宰環(huán)節(jié)樣本分離株存在相同ERIC-PCR圖譜、分子型、耐藥譜、毒素和耐藥基因，由此推斷雞肉屠宰加工中存在交叉污染的可能性。

4 結(jié) 論

肉雞屠宰過程中普遍存在金黃色葡萄球菌污染，且不同屠宰環(huán)節(jié)存在交叉污染，其中浸燙褪毛環(huán)節(jié)被認(rèn)為是污染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。禽肉中優(yōu)勢分子型ST7-t701和ST5-t002/t010在本研究中也有較高檢出率。此外，社區(qū)型ST59-t437菌株的檢出，提示人們在屠宰加工環(huán)節(jié)中存在外源病原體的入侵。因此，保持屠宰衛(wèi)生，定期對(duì)胴體進(jìn)行微生物監(jiān)測，實(shí)施良好生產(chǎn)規(guī)范，以及建立一個(gè)食品安全體系，如HACCP體系，是將對(duì)消費(fèi)者的風(fēng)險(xiǎn)降到最低的必要措施。