果汁中乙醇質(zhì)量濃度的抗干擾檢測方法

王丙蓮，馬耀宏，公維麗，楊艷，鄭嵐，劉慶艾，孟慶軍

(齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 山東省科學院生物研究所，山東 濟南 250103)

乙醇質(zhì)量濃度是檢驗果汁質(zhì)量的重要指標，目前國內(nèi)主要采用國標法測定，即重鉻酸鉀氧化-硫酸亞鐵銨滴定法[1]。該方法耗時較長、操作復(fù)雜、條件難控制，所以在實際應(yīng)用中存在一定弊端。對于乙醇質(zhì)量濃度的檢測還有很多其他方法，如蒸餾法、分光光度法、氣相色譜法(gas chromatography, GC)[2]、氣質(zhì)聯(lián)用法(gas chromatograohy-mass spectrometry ,GCMS)[3]、光譜分析法[4]、生物傳感器法[5]等，其中傳統(tǒng)的蒸餾法、分光光度法測定精確度低，測定誤差大；GC法、GCMS法、光譜分析法等所需設(shè)備昂貴、對操作人員要求高、耗時長，不適于實際生產(chǎn)應(yīng)用。生物傳感器法因其靈敏度高、操作簡單，近年來發(fā)展較快，主要是固定化乙醇氧化酶或乙醇脫氫酶，制成酶電極生物傳感器[6-7]，通過其電化學性能變化達到乙醇檢測的目的。因為酶催化反應(yīng)專一性較強，所以酶電極生物傳感器用于底物質(zhì)量濃度測定時，專一性亦較強。但果汁成分復(fù)雜，不僅含糖類、脂類、烴類、金屬元素，還含電化學活性物質(zhì)，如維生素C、過氧化氫酶等。這些物質(zhì)能夠誘導底物反應(yīng)之外的氧化還原反應(yīng)及電子轉(zhuǎn)移[8-9]，從而導致反應(yīng)系統(tǒng)出現(xiàn)與待測底物無關(guān)的電信號干擾，引起電極信號檢測的誤差，所以乙醇酶電極生物傳感器直接用于果汁乙醇測定時，受電活性干擾物影響較大。本文構(gòu)建了一種新型不受氧化還原性干擾物影響的乙醇電極檢測系統(tǒng)，并與GC法、國家標準法進行了對比實驗。結(jié)果表明，該方法準確度高、抗干擾性強；回收率、重現(xiàn)性好,更適合低成本要求的檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

乙醇氧化酶(Sigma公司進口分裝，250U)；氧化石墨烯(實驗室自制)；牛血清蛋白(阿拉丁試劑有限公司)；殼聚糖(阿拉丁試劑有限公司)；甘油、戊二醛(國藥集團化學試劑有限公司，質(zhì)量分數(shù)25%)，所有化學試劑均為分析純。

SBA-40E型生物反應(yīng)系統(tǒng)(山東省科學院生物研究所)；5804R型低速冷凍離心機(德國艾本德公司)；IKA VORTEX 3型漩渦混勻器(德國艾卡公司)；UC型超聲波精密噴涂設(shè)備(東方金榮超聲電氣有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 基礎(chǔ)電極探頭的制備及處理

根據(jù)文獻[10]將鉑絲、銀片、熱敏電阻、屏蔽電阻等集成一體，制備基礎(chǔ)電極探頭。晾干后，在電極探頭超聲霧化滴涂包覆納米氧化石墨烯層，后室溫真空干燥，得到石墨烯均勻修飾的基礎(chǔ)電極探頭，晾干備用。

1.2.2 工作酶電極的制備

將制備的基礎(chǔ)電極探頭置于超凈臺，按本實驗室酶固定化技術(shù)，將5 U乙醇氧化酶、血清蛋白、甘油、戊二醛進行有序混合，混合液均勻涂布于基礎(chǔ)電極探頭表面，室溫固化干燥，乙醇氧化酶經(jīng)戊二醛交聯(lián)劑固定于基礎(chǔ)電極探頭表面。取質(zhì)量分數(shù)1%殼聚糖水凝膠溶液，滴涂在乙醇氧化酶固定化的電極表面，冷凍干燥，制成乙醇工作酶電極。

1.2.3 輔助酶電極的制備

另取一支基礎(chǔ)電極探頭，將乙醇氧化酶在80 ℃下加熱滅活，將滅活的乙醇氧化酶按照步驟1.2.2固定于基礎(chǔ)電極表面，制得乙醇輔助酶電極。

1.3 測定步驟

1.3.1 抗干擾性能檢測

將工作酶電極、輔助酶電極作為電極系統(tǒng)，同時安裝于SBA-40E生物反應(yīng)系統(tǒng)，啟動儀器，運行系統(tǒng)檢測程序。以1 %亞鐵氰化鉀(K4Fe(CN)6)作為抗干擾性能檢測的基礎(chǔ)物質(zhì)，準確進樣25 μL，反應(yīng)20 s。記錄各電極相對電信號，其中輔助酶電極相對電信號記為A0、工作酶電極相對電信號記為A1，連續(xù)測定3次。計算并比較連續(xù)測定時A1/A0，根據(jù)A1/A0變化值Δ(A1/A0)，判斷整套系統(tǒng)的抗干擾性能。

1.3.2 抗干擾系數(shù)計算

通常，欠缺結(jié)婚形式要件的法律后果是婚姻不成立，而不是婚姻無效。中俄婚姻法都持此見解，故在婚姻無效的事由中并無欠缺形式要件這一項。

1.3.3 系統(tǒng)定標

再次提示進樣時，準確吸取1 mg/mL乙醇標準液，注射入反應(yīng)池，分別記錄工作酶電極和輔助酶電極電信號值，按照公式(1)計算工作酶電極酶活性I，按照公式(2)計算第n次和第n+1次測定的工作酶電極酶活性差值ΔI，n為大于等于1的正整數(shù)。

(1)

ΔI=I(n+1)-In

(2)

1.3.4 樣品測定

當系統(tǒng)定標通過后，運行樣品檢測程序。儀器提示進樣時，準確吸取25 μL果汁樣品注入反應(yīng)池，按照公式(3)計算果汁中乙醇的質(zhì)量濃度：

(3)

2 結(jié)果與討論

2.1 抗干擾性能檢測結(jié)果

K4Fe(CN)6是電化學實驗中常被用于研判電極表面的電子活性的氧化還原反應(yīng)標記物，此處用作基礎(chǔ)電化學活性物質(zhì)，檢測電極系統(tǒng)抗干擾性能的穩(wěn)定性。根據(jù)步驟1.3.1，得到表1。結(jié)果表明，連續(xù)測定3次，A1/A0值保持穩(wěn)定，變化率(Δ(A1/A0))<1%，即重復(fù)測定誤差<1%，整套系統(tǒng)抗干擾性能穩(wěn)定，可用于進一步測定。

表1 抗干擾性能參數(shù)Table 1 Anti-interference parameters

2.2 抗干擾系數(shù)的確定

(4)

2.3 系統(tǒng)定標結(jié)果

以1 mg/ mL乙醇溶液為標準液，根據(jù)操作步驟1.3.3，記錄工作酶電極和輔助酶電極相對電信號值，并計算各酶電極酶活性，結(jié)果見表2。

表2 系統(tǒng)定標數(shù)據(jù)Table 2 System calibration data

由表2求得乙醇質(zhì)量濃度計算公式：

(5)

表2表明，底物單一的情況下，輔助酶電極的信號增減情況與工作酶電極一致，且其變化更為劇烈。但兩者協(xié)同工作時，工作酶電極的酶活能夠快速穩(wěn)定下來，連續(xù)測定2次，酶活變化率為0.92%，系統(tǒng)達到定標通過狀態(tài)。分析其原因，可能輔助酶電極不僅能消除人為進樣的誤差，而且能夠靈敏檢測系統(tǒng)的信號波動，通過其與工作酶電極的協(xié)同比對，消除不平穩(wěn)的系統(tǒng)信號，使電極系統(tǒng)更快穩(wěn)定下來。

2.4 樣品測定穩(wěn)定性檢驗

根據(jù)操作步驟1.3.4，系統(tǒng)提示進樣時，準確進樣稀釋為原質(zhì)量濃度1/20的乙醇樣品25 μL，測定其中乙醇質(zhì)量濃度，每個測定重復(fù)5次。依據(jù)2.3實驗得到的乙醇質(zhì)量濃度計算公式(5)，求得乙醇質(zhì)量濃度，見表3。

表3 果汁中乙醇質(zhì)量濃度測定結(jié)果Table 3 Determination of ethanol concentration in juices

由表3可知，工作酶電極電信號值相對標準偏差為2.18 %，輔助酶電極電信號相對標準偏差為31.82%，但工作酶電極與輔助酶電極協(xié)同作用時，乙醇質(zhì)量濃度測定結(jié)果相對標準偏差為0.80 %，表明通過引入輔助酶電極及系統(tǒng)抗干擾系數(shù)K(0.895)，進一步提高了檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性和重復(fù)性，排除電極信號本身不穩(wěn)定對乙醇測定的干擾，達到準確、穩(wěn)定測定的目的。

2.5 回收率檢驗

取市售果汁樣品，3 000 r/min離心5 min，上清液分成等體積的兩份。一份加入等體積、質(zhì)量濃度為10 mg/mL的乙醇溶液，制成加標樣品。另一份加入等體積蒸餾水作為對照樣品。加標樣品和對照樣品均稀釋10倍，后依據(jù)步驟1.3.4和2.3分別測定并計算加標樣品和對照樣品中乙醇質(zhì)量濃度，每個測定重復(fù)4次。結(jié)果表明(表4)，該方法測定果汁中乙醇質(zhì)量濃度的回收率為99.10%～101.10 %，可初步認為測定結(jié)果準確、可靠。

表4 乙醇檢測系統(tǒng)的回收率實驗Table 4 Recovery test of ethanol detection system

2.6 抗干擾性檢驗

果汁成分復(fù)雜，含有較多干擾物，如維生素、果酸、葡萄糖、蔗糖，少量脂類、芳香烴、過氧化氫酶，以及鈣、鐵等元素。1 mg/mL乙醇溶液中分別加入維生素C、葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、Ca2+、過氧化氫酶等物質(zhì)，調(diào)整干擾物濃度為2 mg/mL，其中，過氧化氫酶活性單位為0.01 U/mL。乙醇檢測系統(tǒng)測定乙醇質(zhì)量濃度，驗證這些物質(zhì)對乙醇測定的影響。結(jié)果表明，葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、Ca2+對乙醇測定沒有明顯影響。維生素C存在時，工作酶電極、輔助酶電極電信號均出現(xiàn)大幅上漲，但經(jīng)計算所得乙醇質(zhì)量濃度跟其實際值相較無明顯區(qū)別。這是因為維生素C具有較強的還原性，是一種靈敏的電化學活性物質(zhì)，能夠在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，引起電極電信號的明顯增強，但輔助酶電極的協(xié)同作用和比較，恰好消除了這一類非乙醇底物參與產(chǎn)生的電信號，從而實現(xiàn)其對維生素C的抗干擾目的。過氧化氫酶存在時，工作酶電極與輔助酶電極的電信號則均大大低于其他實驗組，最終計算得乙醇質(zhì)量濃度值也與實際值相一致。分析其原因可能是，乙醇底物反應(yīng)產(chǎn)生的部分過氧化氫被過氧化氫酶催化[11]，故工作酶電極、輔助酶電極所能采集到電信號均降低，輔助酶電極的協(xié)同作用，消除了因過氧化氫產(chǎn)物減少引起的信號誤差，實現(xiàn)了過氧化氫酶存在情況下的乙醇準確測定。因此，輔助酶電極的存在，能夠有效消除果汁中常見干擾物對乙醇檢測的影響，達到乙醇準確測定的目的。

2.7 與國家標準、GC法對比實驗

取兩種市售果汁，分別記為1#、2#，離心稀釋，并分別用本實驗方法、GC法、國標方法測定乙醇質(zhì)量濃度，重復(fù)4次。T檢驗比較三種方法的差異顯著性(表5)。由表5可知，利用生物傳感器法測定果汁乙醇質(zhì)量濃度時，與GC法相比較，測定結(jié)果低，但是差異不明顯(P>0.05)。可以認為，工作酶電極和輔助酶電極協(xié)同工作，用于測定成分復(fù)雜的果汁中乙醇質(zhì)量濃度時，準確度較高。

表5 乙醇檢測系統(tǒng)與國標法、GC法對比實驗Table 5 Comparison of ethanol detection system with national standard method and GC

3 結(jié)論

本文構(gòu)建了一種新型的乙醇檢測系統(tǒng)，將工作酶電極和輔助酶電極協(xié)同作用，建立了乙醇抗干擾測定方法。該方法對果汁中常見干擾物質(zhì)，諸如糖類、金屬離子、檸檬酸的抗干擾能力強。此外，輔助酶電極的存在，不僅能消除電化學活性物質(zhì)對電信號的干擾，實現(xiàn)對乙醇的抗干擾測定，而且能消除底物中的氧化還原酶對測定的影響。鑒于以上抗干擾性能，該方法不僅能用于果汁中乙醇的測定，還可廣泛應(yīng)用于其他相關(guān)行業(yè)(如啤酒、果味酒、飲料、調(diào)味品等生產(chǎn)中的乙醇測定)發(fā)酵過程中乙醇的含量控制，以及血清、血漿中的乙醇測定。因此，該方法在食品行業(yè)、發(fā)酵行業(yè)，甚至血液制品行業(yè)均有廣闊的應(yīng)用前景。此外，該方法操作簡單、成本低廉且準確度高，能夠滿足低成本要求的實際生產(chǎn)要求，有望代替國家標準方法或GC法成為乙醇測定的主要手段，對于提高相關(guān)領(lǐng)域的生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本具有重要意義。