間充質(zhì)干細胞通過抑制TYK2磷酸化緩解小鼠銀屑病樣皮炎的皮損病變

梁麗娜, 駱青燕, 王歡, 吉蘇云

南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091

銀屑病(psoriasis)的發(fā)病與遺傳背景、環(huán)境誘因、免疫應(yīng)答異常等因素有關(guān)[1]，其中IL-23/Th17軸被認為在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用[2]。Janus激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)途徑是一種重要的細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[3]。TYK2作為JAK家族成員之一，介導(dǎo)IL-23誘導(dǎo)Th17細胞的增殖、活化，促使IL-17、IL-22、IL-23等細胞因子表達增加，與銀屑病的發(fā)病機制有關(guān)[1]。既往研究報道TYK2抑制劑可顯著抑制銀屑病樣皮炎小鼠的皮膚炎癥和細胞因子的產(chǎn)生[4]，目前Ⅱ期臨床研究結(jié)果也顯示口服選擇性TYK2抑制劑對中重度銀屑病有著良好的治療效果[5]。

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種免疫原性低、自我更新能力強、免疫調(diào)節(jié)特性強的成體多能祖細胞，因具有調(diào)節(jié)B、T細胞增殖、抑制樹突狀細胞成熟、抑制中性粒細胞動員等免疫調(diào)節(jié)功能，被認為是治療克羅恩病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種自身免疫或炎癥性疾病的一種治療方式[6-8]。有報道2例尋常型銀屑病患者在接受MSCs治療后療效明顯，且觀察4～5年均無復(fù)發(fā)[9]。但目前MSCs治療銀屑病的詳細機制尚未清楚，對TYK2的作用亦不清楚。因此，本研究探討MSCs對銀屑病樣皮炎小鼠TYK2的磷酸化影響，為MSCs治療銀屑病的機制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞

MSCs來源于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院劉秋莉老師贈與的人臍血來源的第4代MSCs。BALB/C雌性小鼠，共9只，6～8周齡，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。研究經(jīng)本院倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 MSCs培養(yǎng) 在37 ℃、5% CO2標準細胞培養(yǎng)箱中，用10% FBS(Gibco)、1%雙抗(Gibco)的低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)MSCs，取第5～8代的MSCs用于動物實驗。

1.2.2 小鼠建模 隨機分為3組：空白組、咪喹莫特組(IMQ組)及治療組(IMQ+MSC組)，每組3只。剃掉小鼠背部毛發(fā)，連續(xù)6 d在每只小鼠的背部均勻涂抹62.5 mg咪喹莫特乳膏。第6天，涂抹咪喹莫特乳膏后，空白組不予任何處理，IMQ組經(jīng)尾靜脈注射100 μL的無菌PBS溶液，IMQ+MSC組經(jīng)尾靜脈注射同體積的1×106的MSC懸浮液。48 h后，予頸椎脫臼法分別將各組小鼠處死，取背部皮膚組織備用。

1.2.3 PASI評分 采用PASI評分動態(tài)評估各組皮損的嚴重程度，紅斑、鱗屑和皮損厚度評分為0～4分(0分：無；1分：輕度；2分：中度；3分：顯著；4分：非常顯著)。紅斑+鱗片+皮損厚度的總分為最后評分。

1.2.4 HE染色 取合適大小的近后正中線的背部皮膚組織于4%的多聚醛溶液中室溫固定24～48 h后脫水、石蠟包埋，制成3 μm厚的切片行蘇木素和伊紅染色。

1.2.5 免疫熒光染色檢測皮膚組織中CD4+T細胞及CD11c+樹突狀細胞 取各組小鼠的病理切片行脫蠟、修復(fù)、封閉后，用大鼠抗鼠CD4+抗體(Biolegend，1 ∶500稀釋)、大鼠抗鼠CD11c抗體(Biolegend，1 ∶500稀釋)4 ℃孵育過夜，PBS泡洗后予相應(yīng)二抗37 ℃孵育1 h，再次PBS泡洗后予DAPI熒光封片劑封存，共聚焦顯微鏡下觀察圖像并保存。

1.2.6 Western blot測定皮膚組織中TYK2及其磷酸化 液氮研磨各組小鼠的皮膚組織，通過裂解、離心獲取樣品上清液。根據(jù)BCA蛋白測定試劑盒說明書測定蛋白提取液的濃度。等量蛋白質(zhì)(約50 μg)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，5%的BSA封閉1 h后兔抗TYK2磷酸化抗體(Abmart，1 ∶500稀釋)4 ℃過夜，TBST洗滌后室溫孵育相應(yīng)二抗1 h。將兔抗TYK2磷酸化抗體剝脫后，用5%的脫脂牛奶封閉1 h，兔抗TYK2抗體(Abmart，1 ∶1 000稀釋)4 ℃過夜，TBST洗滌后室溫孵育相應(yīng)二抗1 h。均以GAPDH(銳抗，1 ∶5 000稀釋)作為內(nèi)源性對照，用ECL試劑在多功能凝膠成像儀中檢測目的條帶。利用ImageJ軟件對圖像進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MSCs減輕銀屑病樣皮炎小鼠皮損嚴重程度

在第6天，與空白組相比，IMQ組及IMQ+MSC組均出現(xiàn)明顯的紅斑、鱗屑，PASI評分明顯升高；在第8天，與IMQ組比較，IMQ+MSC組小鼠的紅斑、鱗屑減輕，PASI評分下降(圖1A～1E)。表明MSCs減輕了銀屑病樣皮炎小鼠皮損的嚴重程度。

圖1 各組小鼠外觀(1A)及紅斑(1B)、鱗屑(1C)、皮損厚度(1D)評分、總PASI評分(1E)Figure 1 Clinical pictures(1A) and erythema score(1B), scale score(1C), skin thickness score(1D), total PASI score(1E) in each group.

2.2 MSCs減輕銀屑病樣皮炎小鼠的組織病理改變

建模第6天，咪喹莫特乳膏誘導(dǎo)IMQ組及IMQ+MSC組小鼠的HE染色可見角化不全、Munro微膿腫、表皮增厚;而在MSCs治療2 d后，與IMQ組相比，IMQ+MSC組未見明顯角化不全、Munro微膿腫，表皮厚度明顯變薄(圖2A、2B)。建模第8天，在IMQ組的皮損中可見大量CD4+T細胞及CD11+樹突狀細胞浸潤，而IMQ+MSC組中CD4+T細胞及CD11+樹突狀細胞明顯減少(圖3)。證明MSCs可減輕銀屑病樣皮炎小鼠的組織病理改變及減少CD4+T細胞、CD11+樹突狀細胞的浸潤。

圖2 各組銀屑病樣皮炎小鼠皮膚組織病理學(xué)(2A,HE，200×)及第8天表皮厚度(2B)統(tǒng)計Figure 2 Histopathology (HE staining,200×) of lesions of psoriasis-like mice(2A) and epidermal thickness in each group(2B).

圖3 免疫熒光檢測第8天各組小鼠CD4+T細胞、CD11c+樹突狀細胞(200×)Figure 3 Immunofluorescence results of CD4+ T cells and CD11c+ dendritic cells in each group(200×).

2.3 MSCs抑制銀屑病樣皮炎小鼠TYK2的磷酸化

Western blot比較各組的TYK2及其磷酸化水平(圖4),結(jié)果顯示各組的總TYK2表達水平未見差異,但IMQ組TYK2磷酸化水平升高(1.233±0.163比0.634±0.117,P<0.05)，IMQ+MSC組在治療后比IMQ組下降(0.501±0.074比1.233±0.163,P<0.05)，證明MSCs抑制了銀屑病樣皮炎小鼠TYK2的磷酸化。

圖4 Western blot分析各組小鼠的TYK2及其磷酸化水平Figure 4 The levels of TYK2 and pTYK2/TYK2 of each group analyzed by Western blotting.

3 討論

本研究探討MSCs對銀屑病樣皮炎小鼠TYK2磷酸化的影響,結(jié)果顯示MSCs的治療可減輕咪喹莫特乳膏誘導(dǎo)的銀屑病樣皮炎小鼠紅斑、鱗屑及PASI評分，并改善病變皮損的表皮厚度、炎癥細胞浸潤。此外，通過Western blot檢測各組皮損的TYK2及其磷酸化水平，證明MSCs抑制了銀屑病樣皮炎小鼠TYK2的磷酸化水平，表明MSCs可通過抑制TYK2磷酸化減輕銀屑病樣皮炎小鼠皮損的嚴重程度。

銀屑病的臨床表現(xiàn)以局限或廣泛分布的鱗屑性紅色斑塊為主，也可伴有系統(tǒng)疾病，皮損組織病理特征為角化過度、角化不全、Munro微膿腫、棘層肥厚及中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等炎癥細胞浸潤[10-11]。咪喹莫特乳膏作為一種Toll樣受體7/8配體和強效免疫激活劑，反復(fù)涂抹可誘導(dǎo)并加重炎癥性皮損，被廣泛用于銀屑病皮膚炎癥模型[12]。本研究結(jié)果與既往研究[8]一致，咪喹莫特乳膏誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)銀屑病樣的紅斑、鱗屑，組織病理也表現(xiàn)出銀屑病的特征，包括角化過度、角化不全、Munro微膿腫和真皮炎癥細胞浸潤等；MSCs的治療可明顯緩解銀屑病樣皮炎小鼠的紅斑、鱗屑、皮損厚度等臨床表現(xiàn)，減輕表皮厚度、CD4+T細胞和CD11c+樹突狀細胞的浸潤，驗證了MSC具有強大的抗炎、免疫調(diào)節(jié)功能，對銀屑病樣皮炎小鼠有著良好的療效。

TYK2作為JAK家族的成員之一，參與不同細胞因子如IL-12、IL-23啟動的細胞內(nèi)信號傳遞[13]，并在銀屑病中參與了Th17細胞的增殖、活化[1]。在一項全基因組關(guān)聯(lián)研究中，TYK2被確定為銀屑病易感位點[14]。TYK2抑制劑顯著減輕銀屑病樣皮炎小鼠皮損的嚴重程度及減少炎癥因子產(chǎn)生[1, 4]。TYK2被認為是銀屑病的治療靶標之一[15]。目前已完成的Ⅱ期臨床研究表明口服選擇性TYK2抑制劑對中重度銀屑病有著良好的臨床療效[1,13]。本研究結(jié)果顯示MSCs的治療抑制了銀屑病樣皮炎小鼠TYK2的磷酸化，證明MSCs一定程度上是通過抑制TYK2的磷酸化減輕銀屑病樣皮炎小鼠的嚴重程度。

綜上所述，MSCs可通過抑制TYK2磷酸化緩解銀屑病樣皮炎小鼠的紅斑、鱗屑、皮損厚度及相關(guān)炎癥細胞浸潤。