基于GEO數(shù)據(jù)庫膿毒癥心肌病差異基因的篩選與生物信息分析

秦偉強，顧楊，李莉，余濤

膿毒癥心肌?。╯epstic cardiomyopathy，SCM）是在膿毒癥休克中經(jīng)常出現(xiàn)的疾病，且常常預示著不良的預后，但由于其顯著提高了病人的死亡率至70%，其發(fā)病率約在所有膿毒性休克病人中的18%~40%［1］。膿毒癥病人在發(fā)作時可能會出現(xiàn)心肌嚴重抑制，表現(xiàn)為心率紊亂、心力的衰竭和血壓下降，在SCM中可能會發(fā)展得更嚴重。因此，目前SCM已被視為是膿毒性休克的潛在并發(fā)癥；SCM通常被認為一個對左心室可逆性的收縮障礙［2］。不過，目前其致病機理尚不明確，主要包括細胞因子對心肌的損傷、缺血和再灌注損傷、Ca2+心肌細胞超載、心肌功能障礙等。

SCM的發(fā)生主要是因為左室和右室的結構和功能發(fā)生了復雜的血流動力學變化，同時也與外周動脈的張力發(fā)生了絕對或相對的降低，從而導致中心血容量減少有關。膿毒癥患者可能具有低動態(tài)狀態(tài)，特征為左心室擴張和左心室射血分數(shù)（EF）降低；容量復蘇后，膿毒癥患者可以形成多動力循環(huán)，其特征為動脈張力降低、心動過速和LVEF增加［3，4］。由此可見，對于SCM的早期準確識別是極其困難的。但目前，對SCM的檢測主要還是以心臟酶譜法、彩色多普勒超聲心動圖等方法為主，但其特異性仍然不高?，F(xiàn)有的研究顯示，SCM患者的心臟基因與晚期心力衰竭患者之間的基因表達差異很大，但還需要更多的研究。本文采用GEO數(shù)據(jù)庫中的SCM相關基因芯片進行了生物信息學的分析和挖掘，從中找出與SCM相關的基因，并進行了富集分析，從中篩選出與SCM發(fā)病有關的重要基因，從而為進一步深入地探索SCM的發(fā)病機制和早期識別提供了新的思路。

1 資料與方法

1.1 資料來源和處理

資料來源：GEO公共數(shù)據(jù)庫中通過關鍵詞“Septic Cardiomyopathy”檢索并整理出有關膿毒癥心肌病患者的基因芯片表達數(shù)據(jù)集：GSE79962，由Matkovich SJ.eg提交，共有31個樣本，包括11名對照組（Nonfailing）和20例SCM患者的基因表達矩陣。

1.2 差異基因篩選與可視化

使用Networkanalyst在線分析工具（https：//www.networkanalyst.ca/）對數(shù)據(jù)集GSE79962進行分組，篩選差異表達基因（DEGs）進行研究，P＜0.05，logFC（差異倍數(shù)）＞15。篩選上調(diào)和下調(diào)基因。Graphpad prism 8用于數(shù)據(jù)集基因的定位和可視化顯示。

1.3 功能富集解析使用

Metascope在線數(shù)據(jù)庫基因本體（go）解析和京都遺傳學組和遺傳學組百科全書（KEGG）解析在SCM相關DEG上進行。P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析

將篩選得出的DEGs輸入String在線數(shù)據(jù)庫（https：//String-db.org/），以最小互作評分為0.4構建蛋白質(zhì)互相作用（protein-protein interaction，PPI）的網(wǎng)絡圖。并使用Cytoscape 3.9.0，更進一步實現(xiàn)了可視化展示。使用Cytoscape插件MCODE可以實現(xiàn)具有明顯效果的功能模塊，設定參數(shù)為Degree cutoff=2、Node score cutoff=0.2、K-score=2、Max.depth=100。應用CytoHubba的MMC算法插件，揀選出前10個分數(shù)最高的關鍵基因。

2 結果

2.1 使用NetworkAnalyst技術

對GSE79962數(shù)據(jù)集進行了檢測，共確定三百九十個符合條件的DEGs，其中上升基因228個，下降基因162個。按照logFC大小進行排列，從而獲得差異中表現(xiàn)最明顯的前10個DEGs，并分為了上升和下降（見表1）；而且由PCA圖可以看出，兩組間有明顯的組間差異。應用GraphPad Prism 8.0.1對DEGs實施可視化展示（見圖1）。

圖1 數(shù)據(jù)集差異基因 A：膿毒癥心肌病組與對照組基因表達值進行樣本間的PCA分析；B：膿毒癥心肌病組與對照組排名前10的DEGs的棒棒糖圖；C：膿毒癥心肌病組與對照組間差異基因火山圖；D：膿毒癥心肌病組與對照組間DEGs表達譜熱圖

表1 TOP10上調(diào)DEGs

2.2 GO解析與KEGG解析

使用String在線數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)實現(xiàn)對DEGs實現(xiàn)的GO解析與KEGG解析。GO功能富集解析結論為：①生物流程（biological process，BP）：DEGs功用一般富集在對藥物反應、對血栓形成的積極調(diào)控、對細菌繁殖的負性調(diào)控等；②細菌組成（cellular component，CC）：DEGs一般富集于細胞外范圍、細菌外間隙、漿膜的整體成分等；③分子作用功能（molecular function，MF）DEGs一般富集于蛋白質(zhì)融合、鈣離子融合、受體融合等（見表3）。KEGG的分析結果表明，DEGs主要是富集在礦物質(zhì)營養(yǎng)吸收、HIF-1信息通道、胰島素抵抗、腫瘤中的轉錄障礙、小細胞肺癌、p53信息通道、PI3K-Akt信息通道、脂肪細胞激素信息通道中等（見圖2，表3）。

圖2 富集分析 A：排名前20的生物過程(BP)通路；B：排名前20的細胞組成(CC)通路；C：排名前20的分子功能(MF)通路；D：排名前10的KEGG通路

表2 TOP10下調(diào)DEGs

表3 GO分析

2.3 PPI網(wǎng)絡建立和對關鍵基因的篩選

通過String在線分析網(wǎng)絡構建了PPI系絡圖，并使用Cytoscape 3.9.0進行解析其結果，得到了二百八十八個蛋白節(jié)點和七百二十八條邊，從而繪制了PPI系絡圖（見圖3）。利用MCODE插件可以獲得顯著的相互作用模塊一和模塊二（見圖4），各包括八個節(jié)點、28條邊，MCODE score為9.33。使用cytoHubba的MCC算法，檢測出了十個重要基因：STAT3、SERPINE1、TIMP1、TP53、ICAM1、IGF1、MYC、THBS1、HMOX1、ADIPOQ（見表4、圖3）。

圖3 A：PPI網(wǎng)絡建立；B：關鍵基因（Hub Genes）的篩選

表4 關鍵基因

3 討論

SCM作為膿毒癥中最嚴重的并發(fā)癥之一，同時也是最常見的臨床表現(xiàn)。SCM病因病理過程十分復雜，也可能是由許多原因相互作用所造成的后果，可能與心臟抑制物、線粒體功能障礙、過氧化應激、鈣調(diào)節(jié)失衡、神經(jīng)細胞凋亡、腎上腺素受體等相關［5，6］。在膿毒癥初期，心肌細胞會受到抑制，并且會隨著病情的進展而發(fā)展成心功能紊亂。因此，倘若及時早期識別和預防心功能不全，將能更好地改善患者的預后。近幾年，隨著生物信息學的迅速發(fā)展，人們對很多疾病的認識都有了新的認識，并為進一步了解其致病機理和可能的治療目標提供了新的途徑。

這次研究中，選擇了GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE79962數(shù)據(jù)集，平臺則是GPL6244。以SCM病人的左心室壁組織為實驗組，以非膿毒癥人群的組織樣品為對照組，使用NetworkAnalyst等在線數(shù)據(jù)分析工具檢測與SCM有關的上升、下降差異基因。根據(jù)DEGs的生物信息學結果表明，在SCM病人中含有228個上升基因和162個下降基因。GO分子功能分析描述，其大多數(shù)在Ca2+結合、蛋白質(zhì)的結合、受體的結合等過程中富集和調(diào)控。心肌細胞鈣離子含量的失調(diào)引起了鈣超載，鈣超載在缺血性心臟再灌注損傷中起了主要作用。Ca2+作為心肌細胞內(nèi)最主要的第二信使，在膿毒癥中參與了許多重要的信號通路的傳導，例如線粒體損害、氧化應激、細胞自噬作用、炎癥的激活等［7］。Ca2+在細胞質(zhì)中的增加會引起磷脂酶的活化，促使細胞膜中的磷脂降解致使細胞膜損傷；聚集于細胞質(zhì)的Ca2+進入線粒體后消耗大量ATP，并與磷酸根結合，形成不能溶解的磷酸鈣，進一步損害線粒體［8］；細胞內(nèi)Ca2+的增加，會促進鈣依賴性蛋白酶的活力，促進黃嘌呤氧化酶的產(chǎn)生，使氧自由基的增加，加劇氧化應激的損害；另外，心肌的缺血再灌注期間，Ca2+與蛋白C復合物相互作用，導致肌鈣蛋白Ⅰ構象發(fā)生變化，致使肌動蛋白釋放與肌球蛋白結合增加，進而引起心肌纖維的收縮［9，10］。

KEGG分析提示，SCM的DEGs在礦物質(zhì)吸收、

PI3K-Akt信號通路、胰島素抵抗等通路顯著富集。PI3K-Akt信號通路參與免疫調(diào)控、介導細胞因子表達、細胞增殖、分化及凋亡和葡萄糖轉運等多種細胞功能的調(diào)節(jié)［11］。研究表明，TLR4受體與脂多糖（LPS）結合后，能直接激活PI3K-Akt信號通路，而PI3K-Akt信號通路激活后可抑制LPS誘導的炎癥反應以及細胞凋亡［11］。有研究顯示，抑制PI3K或Akt，能促使炎癥因子如IL-12、IL-6、TNF-α等的表達增加，提示PI3K-Akt信號通路的激活能減少膿毒癥患者體內(nèi)炎癥因子的釋放［12］。最近也有實驗證實，通過激活PI3K-Akt信號通路，能抑制NF-κB信號通路從而減少炎癥因子的釋放如TNF-α，同時抑制心肌細胞的凋亡，最終產(chǎn)生對心肌細胞的保護作用［13］?？梢?，PI3K-Akt信號通路的激活在膿毒癥心肌病中，參與炎癥反應、心肌細胞凋亡等起著重要作用。另外，DEGs在體內(nèi)的礦物質(zhì)吸收、胰島素抵抗、胰島素信號通路等方面均有富集，表明基因的失調(diào)在SCM患者體內(nèi)的代謝中扮演了重要角色。

通過Cytoscape的分析，獲得了10個關鍵基因，分別是STAT3、SERPINE1、TIMP1、TP53、ICAM1、IGF1、MYC、THBS1、HMOX1、ADIPOQ。其中STAT3（信號轉導及轉錄激活蛋白3）為STAT蛋白家族之一，其激活后起著重要的轉錄調(diào)節(jié)功能，并參與了細胞的增殖和凋亡［14］。STAT3作為膿毒癥細胞內(nèi)主要信號轉導系統(tǒng)之一，它與IL-6等炎癥因子的釋放有很大關系，因而在SCM患者中對機體的持續(xù)損害起著關鍵的作用［15，16］。研究顯示，STAT3表達量的升高對心肌具有保護作用，并具防止心力衰竭的發(fā)生［17，18］。TP53、thbs1和ADIPOQ尚不完全清楚，需要進一步研究。TIMP-1、IGF1、IGF1-24主要起心肌保護作用。SERPINE1該基因編碼絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serpin）超家族成員為纖溶的抑制劑，多在心肌纖維化重塑中起作用［19，20］，但具體作用尚未完全情況，可能是判斷SCM病情嚴重程度新的標志物。

本研究主要通過篩選出膿毒癥心肌病患者的差異基因并對其進行GO、KEGG及PPI功能通路的富集分析，尋找出可能是新的治療靶點。由于本研究的局限性，未發(fā)現(xiàn)藥物對基因表達的影響。但隨著生物信息技術的發(fā)展，使人們對其發(fā)病機制有了更多的了解，這將為SCM的治療提供了新的思路。