黃林華,蔡德萍,郭莉,談安群,譚祥
國家柑桔工程技術(shù)研究中心/西南大學柑桔研究所,重慶 400712
柑橘類水果中含有黃烷酮、酚酸、檸檬苦素、L-抗壞血酸、類胡蘿卜素、揮發(fā)性萜烯等多種生物活性化合物,具有抗氧化[1-2]、抗腫瘤[3]和抑菌[2]等作用。橙汁不僅富含VC、多酚等多種功能性營養(yǎng)成分,更因其誘人的色澤和清爽的酸甜口味而受到消費者的青睞,成為全球最受歡迎的果汁品類之一[4]。非濃縮還原(not from concentrate,NFC)橙汁是將新鮮甜橙榨汁、殺菌后直接灌裝冷藏,不經(jīng)過濃縮及復原,最大程度地保留甜橙原有的新鮮風味和營養(yǎng)成分。從微生物安全的角度來看,橙汁屬于高酸類食品(pH<4.6),經(jīng)巴氏殺菌得到的橙汁在室溫下穩(wěn)定安全[5]。然而在避光貯藏期間,橙汁的感官和營養(yǎng)品質(zhì)仍會發(fā)生變化,主要是由于頂部空間的氧氣和透過包裝材料的氧氣不斷溶解在橙汁中[6],與橙汁中的營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生氧化反應,如橙汁中VC的氧化降解[7]、酚類化合物發(fā)生氧化縮合形成褐色物質(zhì)[8]以及類胡蘿卜素的氧化異構(gòu)化[9]等,導致橙汁整體品質(zhì)不斷降低。
科研人員大多僅研究新型包裝材料對橙汁品質(zhì)的影響,如紙鋁塑復合包裝[10]、具有吸氧功能的包裝材料[11];或者通過氣體交換去除包裝容器內(nèi)的氧氣,研究貯藏過程中橙汁品質(zhì)的變化,如充入N2和CO2[12]。然而,鮮有學者研究NFC橙汁貯藏過程中溶解氧含量的變化規(guī)律及其對橙汁貯藏營養(yǎng)品質(zhì)的影響。而目前NFC果蔬汁的低溫貯藏和貨架期短是其儲運銷成本較高的主要原因,也是導致該類產(chǎn)品價格高、市場接受度低的重要因素。
本研究采用不同透氧性的包裝材料灌裝橙汁,觀察常溫貯藏過程中溶解氧(dissolved oxygen,DO)含量的動態(tài)變化,研究其變化與橙汁貯藏品質(zhì)的關(guān)系,從而明確NFC橙汁常溫貯藏中DO值控制參數(shù),為實現(xiàn)NFC橙汁的常溫貯藏、延長其貨架期、降低儲運成本提供新思路。
長葉香橙(Citrus sinensis(L.)Osbeck),2019年3月采摘于西南大學柑桔研究所果園。
Pertifilm TM測試片(菌落總數(shù)、金黃色葡萄球菌、大腸菌群、霉菌/酵母菌)購于3M中國有限公司;NaOH、酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、草酸等試劑均為化學純,購于重慶川東化工有限公司;冰乙酸、甲醇等為色譜純,購于美國Sigma-Aldrich公司。
玻璃(glass,GL)瓶,購于徐州聚霖玻璃制品有限公司;聚丙烯(polypropylene,PP)瓶,購于河北滄州東盛塑料有限公司;聚乙烯(polyethylene,PE)蒸煮袋,購于河北保定龍興包裝有限公司。
GL、PP和PE均為無色透明材料,各包裝材料的性能見表1。
表1 包裝材料性能Table 1 Packaging material performance
S9溶氧儀,梅特勒托利多(上海)有限公司;Color i5色差儀,瑞士Gretag Macbech公司;TU-1901紫外-分光光度計,普析通用儀器有限責任公司;WAY-2S阿貝折光儀,上海精密科學儀器有限公司;1260 infinity高效液相色譜儀(HPLC-DAD),安捷倫科技(中國)有限公司。
長葉香橙鮮果于西南大學柑桔研究所中試車間內(nèi)經(jīng)清洗、分級、壓榨、精濾、真空脫氣后,在殺菌管道內(nèi)進行巴氏殺菌(95℃,30 s),然后在灌裝室內(nèi)取樣至無菌操作臺,立即分別熱灌裝至滅菌的GL瓶、PP瓶、PE蒸煮袋(透氧性:GL<PP<PE)中,灌裝至頂空空隙小于0.1 cm,密封,冷水浴中冷卻至室溫,最后放置在恒溫培養(yǎng)箱中,于25℃(模擬室溫)下用多層黑色塑料膜包裹避光貯藏。所有樣品準備2個平行,每個樣品重復測定3次,分別在第0、3、7、15、30、60和120天時取樣測定,當感官評定總分低于50分的樣品不再進行理化指標測定。以第0天的橙汁樣品作為空白對照樣品。
1)感官評定。參照GB/T 16291.2—2010《感官分析:選拔、培訓和管理評價員一般導則:第二部分:專家評價員》的要求對小組成員進行培訓,要求評定人員對標準橙汁的感官屬性非常熟悉。感官評價指標為色澤、氣味、滋味和狀態(tài)與雜質(zhì),評定時均采用10分制,8~10分為標準,5~7分為合格,0~4分則為不合格[14]??傮w評價結(jié)果以100分計,各指標的加權(quán)系數(shù)為色澤(20%)、氣味(30%)、滋味(30%)和狀態(tài)與雜質(zhì)(20%),低于60分視為該橙汁樣品不被接受。
2)溶解氧(DO)測定。使用S9溶氧儀進行侵入型測定,測定前對溶氧儀進行兩點校準,校準結(jié)束后在氮氣環(huán)境中測定樣品,測定時輕微晃動溶氧儀,每個樣品測定5次。
3)色澤的測定。Color i5色差儀開機后選擇光源C-02,設定測試參數(shù)L*、a*、b*值,用黑白板進行校正,校正結(jié)束后每個樣品平行測定5次,并計算ΔE值。
4)褐變度(A420)的測定。國內(nèi)外通常用A420作為果汁非酶褐變的指標,主要是因為非酶褐變反應所產(chǎn)生的色素在420 nm處有非常強的吸光值,吸光值越大,褐變就越嚴重[15]。參考韓智等[16]的測定方法加以修改。取6 mL樣品于10 000 r/min條件下離心20 min,轉(zhuǎn)移3 mL上清液,加入等體積95%乙醇,充分振蕩混合,再在10 000 r/min條件下離心20 min,于420 nm處測定吸光值,平行測定3次。
5)還原糖含量的測定。根據(jù)行業(yè)標準NY/T 2742—2015《水果及制品可溶性糖的測定 3,5-二硝基水楊酸比色法》進行測定。以葡萄糖為標準品,根據(jù)標準中的方法制作標準曲線,所得回歸方程:y=0.0491x+0.0074,式中y為質(zhì)量濃度,x為吸光度,R2=0.995 9。
6)抗壞血酸(VC)的測定。根據(jù)GB 5009.86—2016《食品安全國家標準食品中抗壞血酸的測定》第三法——2,6-二氯靛酚法進行測定,結(jié)果以每100 g橙汁所含L-抗壞血酸質(zhì)量表示(mg/100 g)。
7)類黃酮化合物(蘆丁、橙皮苷和香蜂草苷)的測定。稱取2份平行試樣6 g于50 mL離心管中,加入8 mL乙酸乙酯,渦旋混勻5 min,于8 000 r/min條件下離心10 min,收集上清液,重復上述操作1次,合并上清液,氮吹濃縮至干,50%甲醇溶液定容至2 mL,經(jīng)0.22 μm微孔有機濾膜過濾后,高效液相色譜儀進樣20 μL進行檢測。將蘆丁、橙皮苷和香蜂草苷標準品配制成不同濃度梯度的混合溶液上機檢測,制得3種類黃酮化合物的標準曲線回歸方程,見表2。檢測條件:色譜柱為AcclaimTM120 C18分析柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為1%冰乙酸(A)和甲醇(B)。梯度洗脫程序:0 min 75%A,25%B;30 min 55%A,45%B;50 min 0%A,100%B;60 min 75%A,25%B;75 min 75%A,25%B。流速1 mL/min,柱溫30℃,檢測波長283 nm。
表2 酚酸及類黃酮特征化合物的標準曲線回歸方程Table 2 Standard curve regression equation for the characteristic monomer of phenolic acids and flavonoids
8)酚酸類化合物(阿魏酸、對香豆酸和咖啡酸)的測定。稱取2份平行試樣6 g于50 mL離心管中,加入5 mL 8 mol/L的NaOH溶液,渦旋混勻反應1 h;8 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至2.0,加入8 mL乙酸乙酯和甲基叔丁基醚(體積比1∶1)混合液,于10 000 r/min條件下離心10 min,收集上清液,重復上述操作1次,合并上清液,氮吹濃縮至干,50%甲醇溶液定容至2 mL,經(jīng)0.22 μm微孔有機濾膜過濾后,高效液相色譜儀進樣20 μL進行檢測。將阿魏酸、對香豆酸和咖啡酸標品配制成不同濃度梯度的混合溶液上機檢測,制得3種酚酸化合物的標準曲線回歸方程,見表2。檢測條件:色譜柱為AcclaimTM120 C18分析柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為1%冰乙酸(A)和甲醇(B)。梯度洗脫程序:0 min 80%A,20%B;22 min70%A,30%B;52min0%A,100%B;60min80%A,20%B;66 min 80%A,20%B。流速1 mL/min,柱溫30℃,檢測波長為260 nm和320 nm。
9)微生物檢測方法。菌落總數(shù)的檢測參照《3M Pertrifilm TM菌落總數(shù)測試片法》進行檢測。大腸菌群的檢測參照《3M Pertrifilm TM大腸菌群測試片法》進行檢測。霉菌及酵母菌的檢測參照《3M Pertrifilm TM霉菌及酵母菌測試片法》進行檢測。金黃色葡萄球菌的檢測參照《3M Pertrifilm TM金黃色葡萄球菌測試片法》進行檢測。以上微生物檢測在NFC橙汁冷藏結(jié)束(180 d)時進行。目前國標對于NFC果汁的微生物指標沒有明確規(guī)定,所以根據(jù)GB 7101-2015《食品安全國家標準飲料》和GB 29921—2013《食品安全國家標準食品中致病菌限量》等標準,將對NFC橙汁中的微生物進行嚴格控制。
本試驗所有樣品重復測定3次,測試結(jié)果以“平均值±標準差”表示。使用Origin 8.5軟件進行相關(guān)圖的繪制,利用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行兩因素交互方差分析,采用Duncan’s法比較平均值之間的差異性,P<0.01表示差異極顯著,P<0.05表示差異顯著。
由圖1可知,在貯藏過程中,PE包裝中的DO值升高幅度最大,其次是PP包裝,GL包裝中最低,這與3種包裝材料的透氧性(PE>PP>GL)大小一致。GL包裝的橙汁中DO值整體趨勢平穩(wěn),基本維持在0.5 mg/L左右。而PP和PE包裝的橙汁中DO值變化趨勢一致,均呈現(xiàn)先升高、而后迅速降低、最后逐漸升高至平穩(wěn)的趨勢,出現(xiàn)這一變化的可能原因是在貯藏初期,初始DO值低,限制了橙汁中的氧化反應速度,所消耗的溶解氧小于溶解在橙汁中的透過氧,DO值升高;當DO值達到一定量后,橙汁中的氧化反應加速,消耗的溶解氧大于溶解在橙汁中的透過氧,DO值下降;而后橙汁中的氧化反應底物大量減少,氧化反應又逐漸減緩,消耗的溶解氧小于溶解在橙汁中的透過氧,貯藏后期PP和PE中的DO值逐漸升高,直至保持穩(wěn)定。
圖1 不同包裝材料中DO值的變化Fig.1 Changes of dissolved oxygen content in different packaging materials
圖2、3分別是評價人員對GL、PP、PE包裝橙汁樣品各感官指標的評分和總體評分結(jié)果。由圖2可見,對照組橙汁(貯藏0 d)的滋味為酸甜適中,略帶苦味,氣味新鮮怡人,具有橙子本身的鮮甜味。隨著貯藏時間延長,PP和PE包裝中橙汁逐漸褐變,出現(xiàn)絮狀漂浮固形物,能聞到不同程度的焦糖味,缺少了橙汁的新鮮風味;玻璃瓶中橙汁滋味和氣味大體上都沒有明顯變化。當橙汁開始發(fā)生劣變時,3種包裝的橙汁樣品的氣味和滋味2個感官指標變化最為明顯,其次是色澤,橙汁的狀態(tài)相對穩(wěn)定。PE包裝的橙汁樣品的感官總分在貯藏15 d后低于60分,但氣味和滋味2個感官指標評分在貯藏7 d時已經(jīng)低于6分。由圖3可見,PP中的橙汁在30 d時總分也已經(jīng)低于60分;但GL中的橙汁在貯藏60 d時感官評價總分仍高于60分,說明該橙汁仍能被消費者接受。通過方差分析發(fā)現(xiàn),3種不同透氧性的包裝對橙汁感官評價總分的影響差異顯著(P<0.01),說明降低橙汁的DO值對保持橙汁的良好感官品質(zhì)至關(guān)重要。
圖2 GL(A)、PP(B)、PE(C)包裝橙汁感官指標評分雷達圖Fig.2 Orange juice sensory index score radar chart of GL(A),PP(B)and PE(C)
圖3 不同包裝的橙汁的感官評價總分Fig.3 Orange juice sensory evaluation score of GL,PP and PE
由表3可知,隨著貯藏時間延長,所有橙汁樣品的L*值均下降,但在120 d時GL包裝中橙汁的L*值僅降低2%,肉眼無法直接辨別出差異,而PP和PE包裝中橙汁的L*值分別降低了13%和23%;這說明隨著包裝的透氧量增加,橙汁的DO值越高,氧化反應越快,加速了橙汁的色澤褐變。a*表示紅綠值,所有橙汁樣品的a*值均為正值,且隨著貯藏時間延長而增加,說明橙汁的色澤逐漸變紅;在貯藏120 d時,PP和PE中橙汁的a*值分別上升了38%和74%,GL中a*值僅上升了12%。GL、PP和PE中橙汁的b*值在貯藏120 d時分別下降了9%、37%和45%,即橙汁的黃色值在逐漸下降,貯藏過程b*值的增加可能是VC氧化降解、美拉德反應和酚類氧化聚合共同作用的結(jié)果。除此之外,橙汁中的類胡蘿卜素氧化異構(gòu)化,導致黃色色素減少,b*值下降。ΔE代表橙汁整體色澤變化的理論參考值,一般認為2≤ΔE<4時,顏色變化肉眼可見,但在特定情況下可接受;ΔE≥4視為色差嚴重至無法接受[17]。GL包裝中橙汁的ΔE值在120 d時僅為3.72,在感官指標評分(圖2)中,該橙汁樣品的色澤評分也高于6分,仍在合格范圍內(nèi),而PP和PE中橙汁在貯藏30 d時,ΔE>4。通過方差分析發(fā)現(xiàn),貯藏時間和不同透氧性包裝材料對橙汁的L*值、a*值、b*值和色差ΔE的影響均呈極顯著差異(P<0.01),GL包裝效果最好。
表3 貯藏過程中橙汁色澤的變化Table 3 Changes of color of orange juice during storage
由圖4可知,A420隨貯藏時間的延長逐漸增加,表明橙汁的褐變度逐漸變得嚴重。在貯藏60 d時,PP和PE包裝中橙汁的A420均是第0天的3倍,而GL包裝中的A420在貯藏過程中沒有顯著性變化。通過方差分析發(fā)現(xiàn),不同透氧性包裝對A420的影響具有顯著性差異(P<0.01),表明不同包裝材料對橙汁的褐變度影響差異較大。
圖4 貯藏過程中褐變度(A420)的變化Fig.4 Changes of browning index(A420)during storage
圖5顯示,3種橙汁樣品中的還原糖含量在貯藏前期均有小幅下降,而在貯藏后期不斷上升。PP和PE包裝中橙汁的還原糖含量在貯藏7 d后開始逐漸增加,而GL中的還原糖含量在貯藏15 d后開始增加。并且通過方差分析發(fā)現(xiàn),貯藏時間和不同透氧性包裝材料對橙汁還原糖含量的影響差異極顯著(P<0.01)。
圖5 貯藏過程中還原糖含量的變化Fig.5 Changes of reducing sugar content during storage
在有氧條件下,VC發(fā)生有氧降解形成脫氫抗壞血酸,經(jīng)一系列反應后最終生成還原酮,還原酮再參與美拉德反應生成黑褐色物質(zhì);在無氧條件下VC也會發(fā)生降解,但速度比有氧降解慢。圖6顯示,VC含量整體呈下降趨勢,在貯藏30 d時,PP和PE包裝中的VC含量均下降了92%,而GL包裝中的VC含量僅減少了13%,說明透氧性低的GL包裝中DO值低,對橙汁的VC具有很好的保護作用。該結(jié)果與本試驗中溶解氧和褐變指數(shù)在30 d發(fā)生急劇變化一致,或可進一步佐證橙汁褐變主要由美拉德反應、VC降解及酚類物質(zhì)氧化聚合引起。雖然PP和PE 2種包裝的透氧性不同,包裝內(nèi)的DO值也不同,但通過方差分析發(fā)現(xiàn),PP和PE 2種包裝對VC含量的影響沒有顯著性差異。
圖6 貯藏過程中VC含量的變化Fig.6 Changes of VCcontent during storage
為探究不同DO值變化對橙汁中類黃酮化合物的影響,以含量較為豐富的橙皮苷、蘆丁和香蜂草苷為代表進行分析,結(jié)果如圖7所示。通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),橙皮苷、蘆丁和香蜂草苷的質(zhì)量濃度與DO值均不具有顯著相關(guān)性。3種類黃酮化合物的質(zhì)量濃度在貯藏前期均呈現(xiàn)下降趨勢,而后均出現(xiàn)升高,在貯藏后期又逐漸下降。
圖7 貯藏過程中橙皮苷(A)、蘆?。˙)和香蜂草苷(C)含量的變化Fig.7 Changes of the contents of hesperidin(A),rutin(B)and didymin(C )during storage
為了探究橙汁貯藏過程中DO值對酚酸化合物的影響,選擇以占比相對較多的阿魏酸、咖啡酸和對香豆酸為代表進行測定,其結(jié)果如圖8所示。3種酚酸化合物在波動中呈現(xiàn)先下降、后上升最后再逐漸下降的趨勢,這與3種類黃酮化合物的變化趨勢一致,推測變化原因類似。通過分析發(fā)現(xiàn),包裝材料的透氧性與阿魏酸、對香豆酸和咖啡酸含量之間雖然不具有線性相關(guān)性,但降低DO值對各酚酸化合物具有良好的保護作用。在貯藏結(jié)束時,GL包裝中各酚酸化合物含量較初始值略低或相當。
圖8 貯藏過程中阿魏酸(A)、對香豆酸(B)和咖啡酸(C)含量的變化Fig.8 Changes of ferulic acid(A),p-coumaric acid(B)and caffeic acid(C)during storage
隨著橙汁樣品的貯藏溫度升高,橙汁中殘存微生物的生長情況可能發(fā)生變化。對常溫貯藏溫度下NFC橙汁中微生物的變化進行監(jiān)測。經(jīng)試驗檢測發(fā)現(xiàn),常溫貯藏至180 d時,GL、PP和PE包裝橙汁的菌落總數(shù)對數(shù)值分別為1.18、0.30和1.02。根據(jù)GB 7101-2015《食品安全國家標準飲料》,其菌落總數(shù)均屬于合格范圍。除此之外,橙汁樣品中的其他微生物,如大腸菌群、霉菌、酵母菌和金黃色葡萄球菌等均未檢出。結(jié)果表明,所有的橙汁樣品中的微生物指標均在合格范圍內(nèi),推測在貯藏期間,橙汁樣品的各種理化指標受微生物繁殖的干擾甚微。
橙汁中DO值過高,不僅會引起營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生氧化降解,還有助于好氧菌的生長繁殖,加速橙汁風味和營養(yǎng)品質(zhì)劣變[15]。本研究將橙汁灌裝至不同透氧性的包裝中貯藏,分析不同包裝橙汁在常溫貯藏過程中DO值變化,通過感官評價和理化指標分析發(fā)現(xiàn),橙汁的品質(zhì)與DO值和包裝的透氧性密切相關(guān)。PE包裝透氧性最大,DO值最高,品質(zhì)劣變最快;其次是PP包裝;GL包裝最有利于橙汁品質(zhì)的保持。GL包裝中橙汁DO值一直維持在0.5 mg/L左右,可能原因是GL包裝透氧率低,可利用的DO有限,使得整個貯藏過程中氧化反應極慢,消耗的DO與溶解在橙汁中的透過氧保持動態(tài)平衡[18-19]。橙汁的VC、酚酸類化合物等得到較好的保留,A420沒有顯著性變化,說明褐變度不嚴重。
VC降解速率可通過動力學模型進行定量描述,降解速率常數(shù)K的絕對值越小,表明降解速率越慢。通過分析發(fā)現(xiàn),3種不同包裝中的VC降解均符合一級降解動力學模型,GL、PP和PE包裝中Vc的降解速率常數(shù)K分別為-0.057 4±0.002、-1.271 8±0.001和-1.224 7±0.006,說明GL包裝中VC的降解速率最慢,該結(jié)果與Wibowo等[20]的研究結(jié)果一致。橙汁褐變主要由美拉德反應、VC降解及酚類物質(zhì)氧化聚合引起,該結(jié)果與VC的結(jié)果相互印證,并且與Bacigalupi等[11]研究的結(jié)果一致。還原糖含量前期有所下降,可能是由于美拉德反應消耗還原糖的速率大于還原糖生成的速率,還可能和羥基自由基與葡萄糖反應有關(guān)[21],后期不斷上升,分析原因為隨著蔗糖、果膠、纖維素等水解以及果肉懸浮物中的可溶性糖溶出,導致還原糖生成的速率大于美拉德反應的速率,該變化與吳敏[19]研究荔枝汁的還原糖在貯藏期內(nèi)的變化趨勢類似。PP和PE包裝橙汁比GL包裝橙汁還原糖含量先上升,出現(xiàn)這種差異的可能與PP和PE包裝橙汁中較高的DO加速了還原糖的生成反應有關(guān)[19]。
通過進一步分析發(fā)現(xiàn),橙皮苷的減少量最大,其次是蘆丁,香蜂草苷最少,出現(xiàn)該現(xiàn)象除與橙汁中黃酮化合物本身的含量有關(guān)外,由于黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中常含有酚羥基、甲基、甲氧基等取代基團,酚羥基的甲基化或糖基化會都降低柑桔酚類物質(zhì)的自由基清除能力,而且自由羥基所含數(shù)目與抗氧化能力呈顯著正相關(guān)[22-23]。由于類黃酮屬于多酚類化合物,推測含量減少可能由類黃酮化合物消耗水中溶解氧發(fā)生氧化縮合反應所引起,而含量增加可能與果肉細胞中類黃酮化合物溶出有關(guān)[24]。GL包裝的NFC橙汁在常溫避光貯藏條件下,感官評價的可接受時間達到60 d,有效延長了橙汁的常溫貯藏時間。本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)橙汁貯藏過程中溶解氧的變化與橙汁顏色、風味和營養(yǎng)成分含量變化具有較大相關(guān)性,但溶解氧在橙汁貯藏過程品質(zhì)劣變的作用機制和反應途徑有待進一步的研究。