預先切口浸潤氟比洛芬酯對切口痛大鼠術后疼痛及炎癥細胞因子的影響

江磊 賈子普 羅芳

(首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院，北京 100050)

手術的機械損傷可直接刺激外周的傷害性感受器，手術創(chuàng)傷也可引起術區(qū)炎癥反應，間接刺激傷害性感受器，傷害性刺激逐級傳遞致大腦皮層感覺中樞，從而使大腦感知到疼痛〔1，2〕。術后疼痛又稱傷害性疼痛，是手術即刻發(fā)生的急性疼痛，主要表現(xiàn)是自發(fā)性疼痛、觸誘發(fā)痛和痛覺過敏，是臨床最常見的急性疼痛類型〔3，4〕。術后疼痛影響患者循環(huán)、呼吸、消化及內(nèi)分泌等各系統(tǒng)功能，導致術后一系列并發(fā)癥，影響術后恢復。

氟比洛芬酯是一種具有靶向作用的新型非甾體類鎮(zhèn)痛脂質(zhì)微球〔5〕。氟比洛芬酯的載體是脂質(zhì)微球，可以使藥物更好地傳遞到疼痛部位發(fā)揮作用，具有良好的抗炎和鎮(zhèn)痛療效，具有用量小、不良反應少、鎮(zhèn)痛效果好的優(yōu)點〔6〕。研究表明氟比洛芬酯可以有效抑制術后疼痛引起的應激反應，減少術后并發(fā)癥，促進患者恢復〔7～9〕。已有研究報道氟比洛芬酯靜脈注射用于腹部、骨折、腫瘤手術患者術后鎮(zhèn)痛〔10～12〕。預先在切口局部浸潤氟比洛芬酯的術后鎮(zhèn)痛作用及其可能的機制目前仍未見報道。本研究利用大鼠切口痛模型，通過預先局部浸潤不同濃度氟比洛芬酯對術后鎮(zhèn)痛的影響，篩選出最適宜的濃度。利用適宜濃度氟比洛芬酯研究其對炎性細胞因子，包括腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β及IL-6表達水平的影響，明確切口預先局部浸潤氟比洛芬酯的術后鎮(zhèn)痛作用及其可能機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 健康成年雄性SD大鼠60只，體重180～220 g，8周齡，由維通利華公司實驗動物中心提供。實驗室籠養(yǎng)，自由飲水，室溫(22±2)℃，濕度保持在40%～60%，光照周期8∶00～20∶00。大鼠入室后分籠飼養(yǎng)，適應環(huán)境1 w。本研究已獲得北京天壇醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準。

1.2主要儀器和試劑 電子馮弗雷纖維絲測痛儀(Electronic von Frey anesthesiometer，IITC Inc)；麻醉機(Drager Fabius，德國Drager公司)；自制玻璃麻醉誘導箱；Gen5酶標儀(美國BioTek公司)；CF16RX恒溫離心機(日本HITA-CHI公司)；光熱甩尾測痛儀(上海軟隆科技發(fā)展有限公司，型號：BW-YLS-12A)。氟比洛芬酯注射液(凱紛)購自北京泰德制藥有限公司提供。七氟烷、生理鹽水購自國藥集團容生制藥有限公司；大鼠TNF-α、IL-1β、及IL-6試劑盒均購自美國R&D公司；Von Frey購自美國Stoelting公司；熱輻射刺激儀購自意大利Ugo公司；多聚甲醛固定液(G1101-500ML，Servicebio)；無水乙醇(100092683，國藥集團化學試劑有限公司)；二甲苯(10023418，國藥集團化學試劑有限公司)；蘇木素-伊紅(HE)染液套裝(G1003，Servicebio)；中性樹膠(10004160，國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3大鼠切口痛模型建立 參照Brennan等〔13〕的方法制備大鼠足底切口痛模型，將實驗大鼠稱重后置入麻醉箱中，麻醉箱一側接麻醉機，采用3%七氟烷麻醉誘導，待麻醉平穩(wěn)后將大鼠取出，俯臥位固定于手術臺上，經(jīng)鼻罩給予七氟烷繼續(xù)維持麻醉后切割大鼠左后足。從足跟近端0.5 cm處向趾部作一縱行切口，長度約1 cm，切開左后足的皮膚及筋膜，用眼科鑷輕輕挑起足底肌肉并作縱向切割，壓迫止血后用絲線縫合。手術后將大鼠置于避光、安靜、溫暖的環(huán)境下蘇醒，蘇醒后左后足無運動障礙，手術結束30 min后左后足不著地且有咬、舔現(xiàn)象為造模成功。

1.4最佳給藥濃度的篩選

1.4.1動物分組 造模成功大鼠24只分為對照組(生理鹽水)、低濃度組(氟比洛芬酯5 mg/ml)、中濃度組(氟比洛芬酯7.5 mg/ml)及高濃度組(氟比洛芬酯10 mg/ml)，對照組給予0.5 ml生理鹽水，藥物組給予0.5 ml不同濃度氟比洛芬酯行預先切口局部浸潤。

1.4.2機械縮足閾值(PWT)測量 選用8根強度呈對數(shù)遞增的(0.41、0.70、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51、15.14)馮弗雷纖毛機械刺激針(VFH)垂直刺激大鼠左后足底，從2.04開始，以探針輕微彎曲并持續(xù)2～3 s為準，每次刺激間隔30 s，如大鼠出現(xiàn)快速撤足為陽性反應。若反應陰性，選用刺激強度呈對數(shù)遞增的相鄰VFH繼續(xù)刺激；若撤足反應為陽性，則選用相鄰遞減的刺激強度給予刺激。以出現(xiàn)第1次陽性反應前的陰性反應作為起點，選擇包括該點在內(nèi)的6次連續(xù)刺激，50%PWT=10(Xf +κδ)/104 (Xf：序列中最后一根VFH的對數(shù)值；κ：根據(jù)測量所得序列查表后得到的值；δ=0.224)。

1.4.3累計疼痛評分(CPS) 將大鼠置于透明有機玻璃箱中適應30 min，待大鼠停止探覓行為且恢復安靜后，開始進行CPS測量。測量方法為觀察其術側后肢著地和負重的情況，術側后肢著地且被壓迫致發(fā)白表示負重；術側后肢因為疼痛而翹起不著地計2分；術側后肢著地但不負重計1分；術側后肢著地并負重計0 分。每5 min觀察1次大鼠的行為變化，每次觀察1 min，在觀察的1 min內(nèi)大鼠最常采用的站立姿勢作為疼痛評分記錄，共觀察1 h(即12次)，將12次疼痛評分的總和計為該時點的CPS。

1.4.4篩選最佳的氟比洛芬酯濃度 于造模前(T0)、造模后2 h(T2)、6 h(T6)、12 h(T12)、24 h(T24)及48 h(T48)行大鼠切口痛行為學和切口紅腫、滲血、不愈合等安全性指標觀察，篩選出最佳藥物濃度。

1.5最佳給藥濃度下氟比洛芬酯對切口痛大鼠的干預。

1.5.1動物分組 大鼠36只隨機等分為對照組(生理鹽水組)和藥物組(最佳濃度氟比洛芬酯組)，分別預先切口局部浸潤生理鹽水或篩選出最佳濃度的氟比洛芬酯各0.5 ml后建立切口痛模型。對照組給予0.5 ml生理鹽水，藥物組給予0.5 ml最佳給藥濃度的氟比洛芬酯行預先切口局部浸潤。

1.5.2PWT和CPS測定 于T0、T2、T6、T12、T24及T48時分別按照1.4.2和1.4.3的方法進行PWT和CPS測定，比較對照組和藥物組的疼痛指數(shù)。

1.5.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 于T0、T2、T6、T12、T24及T48時，3%水合氯醛腹腔注射，將大鼠麻醉后，迅速用乙二胺四乙酸(EDTA)K2抗凝采血管采集心房血液2 ml，將取得的血液放入離心機中以3 000 r/min離心15 min，取上清液即血漿放入EP管中，參照說明書檢測血漿中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度。

1.6統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1氟比洛芬酯最佳給藥濃度的篩選

2.1.1各組PWT比較 T0時各組PWT值無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。造模后，各組各時間點PWT均低于T0，尤以T2下降明顯，隨后各組PWT呈上升趨勢，直至T48仍低于T0。低、中、高濃度組PWT值于T12、T24、及T48時明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.1.2各組CPS比較 T0時各組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。模型建立后各組CPS迅速上升，尤以T2上升明顯，隨后各組CPS呈下降趨勢，直至T48仍高于T0。T12、T24及T48時低、中、高濃度組CPS明顯低于對照組(P<0.05)，見表2。

2.1.3副作用 低、中、高濃度組術后不同時間點未見傷口腫脹、滲血、感染、不愈合等副作用。

2.1.4最佳濃度 按照最低有效的原則，本研究中5 mg/ml氟比洛芬酯為最佳的濃度。

2.2對切口痛大鼠的干預作用及對炎癥細胞因子的影響

2.2.1兩組PWT和CPS比較 造模后，兩組PWT值明顯下降，尤其以T2下降明顯，隨后逐漸上升，但直至T48仍低于T0。與對照組比較，藥物組T12、T24及T48時PWT值明顯升高(P<0.05)。建模后，兩組的CPS值迅速上升，尤其以T2升高明顯，隨后逐漸下降，但直至T48仍高于T0。與對照組比較，藥物組T12、T24及T48時CPS明顯降低(P<0.05)，見表3。

2.2.2兩組IL-1β、IL-6、及TNF-α水平比較 與T0相比，對照組和藥物組術后T2、T6、T12、T24及T48時IL-1β、IL-6、及TNF-α的表達均有所增高；與對照組相比，T2和T6時藥物組IL-1β和IL-6水平明顯降低(P<0.05)，見表4。

表1 4組疼痛行為學PWT比較

表2 4組疼痛行為學CPS比較分，n=6)

表3 兩組PWT和CPS比較

表4 兩組IL-1β、IL-6及TNF-α水平比較值)

3 討 論

Brennan等〔13〕首次建立大鼠切口痛模型，證明了術后術側后爪能表現(xiàn)出明顯的自發(fā)性疼痛行為、觸誘發(fā)痛、機械性痛覺過敏及熱痛覺過敏。該模型術后0.5 h出現(xiàn)明顯的痛覺過敏，2 h達到峰值，且可持續(xù)到術后4～7 d〔14〕。本研究與Brennan等〔13〕報道一致，表明造模成功。不同濃度藥物組預先切口局部浸潤不同濃度氟比洛芬酯后造模，各藥物組造模后疼痛程度也顯著增加，同樣證實造模成功。本研究結果證實，預先切口局部浸潤各濃度氟比洛芬酯均有明顯減輕大鼠機械性痛覺過敏、防治切口疼痛的作用。本研究結果還提示，局部浸潤氟比洛芬酯對于術后切口痛的早期鎮(zhèn)痛效果欠佳，12 h后局部浸潤氟比洛芬酯的術后鎮(zhèn)痛效果才顯著優(yōu)于生理鹽水；而且，本研究發(fā)現(xiàn)，雖然術后48 h藥物組的疼痛程度優(yōu)于對照組，但各藥物組造模后48 h與基礎值比較，疼痛程度仍未恢復到造模前，說明術后疼痛仍未完全控制，因此，氟比洛芬酯盡管對于切口疼痛具有一定的防治作用，但療效有限，今后可考慮術后配合其他多模式鎮(zhèn)痛方法，如聯(lián)合應用長效的局部麻醉藥，以改善術后疼痛的管理水平。

氟比洛芬酯鎮(zhèn)痛作用的主要機制是抑制環(huán)氧化酶(COX)生成，從而阻斷前列腺素(PGs)的生物合成，減少損傷部位的致痛物質(zhì)和炎癥介質(zhì)的生成和釋放。氟比洛芬酯脂質(zhì)微球的優(yōu)勢有3個方面，(1)靶向性：脂質(zhì)微球能使氟比洛芬酯在血供較為豐富的手術切口及炎癥部位聚集，繼而水解為氟比洛芬，從而增強藥效；(2)緩釋性：脂質(zhì)微球有助于控制氟比洛芬酯的釋放，使藥效持續(xù)時間更長；(3)轉運性：脂質(zhì)微球使氟比洛芬酯易于跨越細胞膜，從而促進其藥物的吸收，縮短起效時間〔15〕。目前，氟比洛芬酯靜脈給藥、作為一種靶向鎮(zhèn)痛作用的制劑通過上述機制發(fā)揮鎮(zhèn)痛的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，預先切口局部浸潤氟比洛芬酯達到了較好的術后鎮(zhèn)痛效果，證實了局部應用氟比洛芬酯即使很小的劑量即有顯著的鎮(zhèn)痛作用，為臨床上合理用藥提供良好的實驗依據(jù)。采用局部浸潤氟比洛芬酯脂質(zhì)微球的給藥方法，氟比洛芬酯可直達患處，從而達到抗炎鎮(zhèn)痛作用，理論上可能較靜脈應用氟比洛芬酯脂質(zhì)微球用量少、病灶局部藥物濃度高、效果更直接，有望成為一種安全有效的術后鎮(zhèn)痛手段。

組織損傷后局部釋放大量致痛物質(zhì)，同時術區(qū)出現(xiàn)無菌性炎癥反應，可導致急性疼痛及痛覺過敏〔16，17〕。手術創(chuàng)傷等傷害性刺激可導致炎癥細胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α等釋放。IL-1β和IL-6是誘導全身炎癥如急性期反應的主要促炎細胞因子，主要由T細胞、B細胞及單核巨噬細胞等合成，正常情況下人體血清中含量較低，而機體存在炎癥時血清中IL-1β及IL-6水平明顯升高〔18〕。IL-1β和IL-6主要作用于血管內(nèi)皮細胞引起通透性增加，進而引起大量炎癥細胞滲出，導致明顯的外周痛覺過敏。前期研究表明在大鼠切口痛模型中，IL-1β表達水平升高〔19〕。先前研究發(fā)現(xiàn)手術創(chuàng)傷后患者出現(xiàn)血清IL-6水平升高，因此IL-6被認為是反映應激程度的敏感指標〔20〕。IL-6對機體手術創(chuàng)傷刺激和感染起重要調(diào)節(jié)作用，在手術創(chuàng)傷局部大量產(chǎn)生并進入循環(huán)系統(tǒng)，是急性期炎癥細胞聚集的主要因素，被認為與術后疼痛程度密切相關〔21，22〕。這些細胞因子可以通過直接或間接作用于傷害性感覺神經(jīng)元上的受體，激活神經(jīng)元內(nèi)的p38絲裂酶原活化蛋白激酶、蛋白激酶A、蛋白激酶C等多種復雜信號傳導通路，降低周圍神經(jīng)元的興奮閾值，產(chǎn)生外周敏化，使得低強度的閾下刺激也可導致疼痛。本研究結果提示氟比洛芬酯有可能通過降低IL-1β和IL-6起到術后鎮(zhèn)痛的作用。本研究存在以下局限性。首先，本研究僅觀察到術后48 h的疼痛變化，切口痛模型術后疼痛可持續(xù)到術后4～7 d，今后應進一步延長觀察的時間。目前，術后疼痛機制主要由中樞敏化和外周敏化所致，前期研究表明外周神經(jīng)及組織損傷后將導致前列腺素、緩激肽、IL-1β、IL-6及TNF-α等升高，尤其是炎癥細胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α等對傷害感受器致敏，導致明顯的外周痛覺過敏〔23〕。前期研究報道，IL-1β、IL-6及TNF-α等炎癥介質(zhì)在不同的動物模型中證明能夠提高痛覺過敏癥狀〔24〕。本研究僅探討了IL-1β、IL-6及TNF-α這3種炎癥細胞因子的變化，今后，有待開展深入的研究探討其他可能涉及的鎮(zhèn)痛防治作用機制。最后，還需要進一步研究該技術的具體實施細則，如氟比洛芬酯理想的給藥時機、給藥方式等。

大鼠切口痛模型可獲得應用于人類急性疼痛模型的實驗數(shù)據(jù)，因此，本研究結果有望為減輕患者術后疼痛、應激和炎癥反應提供新技術，為臨床術后鎮(zhèn)痛提供合理用藥臨床依據(jù)。