柚皮苷轉(zhuǎn)化生成紅花素及異紅花素的研究

李業(yè)英 馬瑛 崔曉蘭 尹力新 穆云龍 單越琦 路新華 沈文斌

(1 微生物藥物國家工程研究中心，河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，石家莊 052165；2 華北制藥股份有限公司，石家莊 050015)

柚皮苷和柚皮素是一種廣泛存在于蕓香科植物中的二氫黃酮類化合物，具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗突變、抗雌激素、抗動脈粥樣硬化和抗癌等[1-2]，近年來受到人們越來越多的重視和研究。柚皮苷和柚皮素的生物活性在某種程度上都與其抗氧化的特性有關(guān)，抗氧化特性又取決于化合物中羥基數(shù)量的多少以及是否存在相鄰的羥基。因此可通過化學(xué)或生物合成的方法在柚皮苷或柚皮素中引入額外的羥基，獲得抗氧化活性增強(qiáng)的衍生物，并將其用于食品添加劑和臨床藥物的研發(fā)[3]。

紅花素和異紅花素是柚皮素羥基化修飾后的產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)中都含有鄰近的羥基，具有很強(qiáng)的抗氧化活性，其抗氧化活性要強(qiáng)于柚皮苷和柚皮素[4]，特別是異紅花素，其抗氧化活性幾乎與維生素E相當(dāng)[5]。紅花素和異紅花素還具有抗糖尿病活性，已經(jīng)用于抗糖尿病制劑的研發(fā)[6]。紅花素除了對晶狀體醛糖還原酶具有顯著的抑制作用外[7]還具有較強(qiáng)的對抗由組織胺引起的平滑肌收縮作用，同時還有很好的祛痰作用，是治療慢性支氣管炎的有效成分[8]。異紅花素是酪氨酸酶的自殺性底物，作為酪氨酸酶抑制劑可用于防止水果褐化、蔬菜保鮮、治療一些與黑色素色素沉著和神經(jīng)退行性相關(guān)的皮膚病，可用于化妝品以及昆蟲控制[5]。

紅花素和異紅花素可以從紅花、半枝蓮和黃芩等天然植物中提取得到[8,10-11]，但其在植物中的含量較低[3,5]，獲取困難，例如Werawattanachai等[5]從4.8 kgParinari anamense中分離得到25 mg異紅花素，嚴(yán)重限制了它們的應(yīng)用。人們一直在尋找經(jīng)濟(jì)實用的獲取方法，Miyake等[4]利用齋藤曲霉(Aspergillus saitoi)轉(zhuǎn)化柚皮苷獲得紅花素和異紅花素，趙淑娟等[9]和Jing等[3]利用黑曲霉，Anna等[5]利用紅酵母轉(zhuǎn)化柚皮素獲得紅花素和異紅花素，但紅花素和異紅花素的總產(chǎn)量較低，最高總共約有233.3 mg/L。柚皮素水溶性較柚皮苷差且需要通過酶解或水解柚皮苷獲得[12-13]。因此，由柚皮苷直接轉(zhuǎn)化生成紅花素和異紅花素并提高產(chǎn)量具有一定的意義。

本文報道一株日本曲霉能夠直接將柚皮苷轉(zhuǎn)化生成紅花素和異紅花素，且發(fā)酵單位較高。由日本曲霉直接轉(zhuǎn)化柚皮苷生成紅花素和異紅花素還未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

菌株編號F06Z0123，本實驗室分離自重慶市江津四面山土壤，鑒定為日本曲霉，現(xiàn)保藏于本實驗室。

1.1.2 主要儀器與試劑

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：淀粉1%，葡萄糖2%，麥芽粉0.6%，熱豆粉0.2%，氯化鈉0.2%，碳酸鈣0.2%，pH自然。

發(fā)酵及轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基：淀粉3%，麥芽粉0.4%，熱豆粉0.3%，氯化鈉0.2%，碳酸鈣0.15%，pH自然。

1.1.4 底物的配制

稱取柚皮苷1.2 g，溶于75 mL 50%的乙醇溶液中，改進(jìn)后為溶于75 mL 26.6%的熱乙醇溶液中；濃度均為16 mg/mL。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)和底物轉(zhuǎn)化

將菌株孢子液0.2 mL接種到裝有40 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，硅膠塞通氣，26℃，200 r/min培養(yǎng)24 h；種子液以3%接種量接種到裝有40 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，硅膠塞通氣，26℃，200 r/min培養(yǎng)72 h后將搖床轉(zhuǎn)速降至60 r/m。發(fā)酵液中加入50%乙醇溶解的底物5 mL，發(fā)酵培養(yǎng)基中底物終濃度為2 mg/mL。從加入底物開始計算轉(zhuǎn)化時間，一般轉(zhuǎn)化36 h結(jié)束。

1.2.2 有機(jī)氮源對轉(zhuǎn)化的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基中的熱豆粉等量替換為生物氮素、酵母粉、棉籽粉、玉米漿粉、蛋白胨、花生餅粉，考察常用氮源對轉(zhuǎn)化的影響。

1.2.3 熱豆粉添加濃度對轉(zhuǎn)化的影響

調(diào)整熱豆粉添加濃度為0.2%、0.3%和0.4%，考察熱豆粉濃度對轉(zhuǎn)化的影響。

1.2.4 微量元素及含量對轉(zhuǎn)化的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加硫酸鋅、硫酸亞鐵及氯化錳，添加濃度均為0.01%，考察添加微量元素對發(fā)酵的影響，并對微量元素的添加濃度進(jìn)行試驗。

1.2.5 搖床轉(zhuǎn)速的影響

轉(zhuǎn)化時的搖床轉(zhuǎn)速會影響到發(fā)酵培養(yǎng)基的通氣和物料的混勻，試驗了搖床轉(zhuǎn)速對轉(zhuǎn)化的影響。所用搖床的偏心距為2.5 cm。

1.2.6 底物添加濃度及添加方式對轉(zhuǎn)化的影響

通過使用熱乙醇水配制底物溶液，將乙醇的濃度降低至26.6%，在此基礎(chǔ)上將底物添加終濃度提高至3和4 mg/mL。對照仍舊用50%乙醇配制底物，添加終濃度為2 mg/mL。

提高底物添加終濃度后，比較一次添加和二次添加底物方式對轉(zhuǎn)化的影響。二次添加方式是在第一次添加底物12 h后，再次添加等量的底物。

1.2.7 轉(zhuǎn)化時間的確定

采用二次添加底物方式后，考察時間對轉(zhuǎn)化的影響。

1.2.8 HPLC檢測方法

島津LC-20AT，納微Nano-Micro C18柱(4.6 mm×15 cm)，柱溫30℃，25%～60%乙腈梯度(含0.5%三氟乙酸)，流速1 mL/min。0～2 min，25%乙腈；2～5 min，25%～60%乙腈；5～14 min，60%乙腈；14～15 min，60%～25%乙腈；15～20 min，25%乙腈；進(jìn)樣10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)氮源對轉(zhuǎn)化的影響

從圖1中可以看出，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源為生物氮素、棉籽粉和花生餅粉時，底物脫糖生成的柚皮素大量積累，只有很少量的紅花素和異紅花素生成。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源為熱豆粉、玉米漿粉和蛋白胨時，產(chǎn)物中有較多的紅花素和異紅花素生成，以熱豆粉轉(zhuǎn)化效果較優(yōu)。

2.2 熱豆粉濃度對轉(zhuǎn)化的影響

從圖2中可以看出，熱豆粉濃度的提高，有利于異紅花素的生成，對紅花素影響不大，但繼續(xù)提高熱豆粉濃度會對異紅花素的生成產(chǎn)生抑制。綜合考慮紅花素和異紅花素的產(chǎn)量，將熱豆粉的含量定在0.3%較為合適。在此濃度下紅花素發(fā)酵單位為66 μg/mL，異紅花素單位為263 μg/mL。

2.3 微量元素及含量對轉(zhuǎn)化的影響

從圖3中可以看出與對照相比，添加氯化錳有利于異紅花素的生成；硫酸亞鐵的添加有利于紅花素的生成，但會減少異紅花素的生成。

從圖4中可以看出，硫酸亞鐵濃度為0.02%時比較有利于紅花素及異紅花素的生成。

從圖5中可以看出，氯化錳對紅花素的生成影響不大，氯化錳濃度為0.01%時比較有利于異紅花素的生成。

從圖6中可以看出，同時添加有較適濃度的硫酸亞鐵和氯化錳的發(fā)酵培養(yǎng)基更能促進(jìn)紅花素、異紅花素的生成。在此條件下紅花素單位達(dá)到253 μg/mL，異紅花素單位達(dá)到427 μg/mL。

2.4 搖床轉(zhuǎn)速對轉(zhuǎn)化的影響

從圖7中可以看出，降低和提高搖床轉(zhuǎn)速后紅花素、異紅花素的生成量都發(fā)生了下降，尤其是搖床轉(zhuǎn)速提高后的生成量明顯下降，推測可能是提高搖床轉(zhuǎn)速時日本曲霉對紅花素和異紅花素產(chǎn)生了消耗。降低搖床轉(zhuǎn)速時，中間產(chǎn)物柚皮素出現(xiàn)大量積累。

2.5 底物添加濃度的影響

實驗中發(fā)現(xiàn)，如果使用50%濃度的乙醇配制底物，當(dāng)繼續(xù)提高底物終濃度時會導(dǎo)致紅花素和異紅花素大幅下降，甚至無產(chǎn)物生成。分析可能是提高底物濃度后，過多的乙醇對菌株產(chǎn)生了毒害。改進(jìn)底物配制方法，使用乙醇濃度為26.6%的熱乙醇水溶液溶解底物，進(jìn)行底物添加濃度實驗。

從圖8中可以看出，采用乙醇濃度降低至26.6%的底物配制方法，底物終濃度由2 mg/mL提高到4 mg/mL后，紅花素和異紅花素的產(chǎn)量都有所提高且柚皮素的含量也逐步提高。在底物終濃度為4 mg/mL時，紅花素單位為326 μg/mL，異紅花素單位為635 μg/mL。

2.6 底物添加方式的影響

從圖9中可以看出，在底物終濃度為4 mg/mL時，底物分兩次添加更有利于紅花素和異紅花素的生成。兩次添加方式下紅花素單位為373 μg/mL，異紅花素單位為906 μg/mL。

2.7 轉(zhuǎn)化時間的影響

采用二次添加底物的轉(zhuǎn)化方法后，轉(zhuǎn)化時間由36 h延長至48 h產(chǎn)物達(dá)到最高值，此時紅花素發(fā)酵單位389 μg/mL，異紅花素發(fā)酵單位946 μg/mL，圖10。

3 討論

文獻(xiàn)報道通過生物轉(zhuǎn)化的方式獲得紅花素和異紅花素可利用的菌株有齋藤曲霉、黑曲霉和紅酵母。本文的研究增加了獲取紅花素和異紅花素的菌株來源。

使用生物轉(zhuǎn)化法獲取紅花素和異紅花素可利用的底物有柚皮苷和柚皮素。目前已報道的能夠利用柚皮苷作為底物的菌株只有齋藤曲霉，本文顯示日本曲霉同樣能夠轉(zhuǎn)化柚皮苷獲得紅花素和異紅花素。相比于柚皮素，柚皮苷更易從自然界植物中獲得[14-15]，并且柚皮苷的水溶性較柚皮素好，作為底物更具有優(yōu)勢。同時我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，該菌株在一定條件下也可高效得將柚皮苷主要水解為柚皮素，所以該菌株不僅可以用于紅花素和異紅花素的產(chǎn)生，也可用于柚皮素的產(chǎn)生。

本文對一株日本曲霉直接轉(zhuǎn)化柚皮苷生成紅花素和異紅花素進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示發(fā)酵培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件對轉(zhuǎn)化都具有重要的影響。發(fā)酵培養(yǎng)基組分研究顯示熱豆粉是轉(zhuǎn)化的最適氮源，這可能與熱豆粉中含有較多的黃酮類物質(zhì)有關(guān)，對轉(zhuǎn)化酶系的合成具有一定的誘導(dǎo)作用。微量元素對酶活性具有調(diào)節(jié)作用。實驗發(fā)現(xiàn)添加不同的微量元素只會促進(jìn)單一產(chǎn)物如紅花素或異紅花素的生成，這表明由柚皮苷生成紅花素和異紅花素可能是由兩種酶分別作用的，且兩種酶的酶活性具有差異，因為無論通過柚皮苷還是柚皮素作為底物，產(chǎn)物中異紅花素的含量往往要高于紅花素，說明更傾向于生成異紅花素。搖床轉(zhuǎn)速會影響產(chǎn)物的生成，推測是通過影響發(fā)酵培養(yǎng)基的通氣造成的。因為由柚皮素羥基化生成紅花素和異紅花素是一氧化過程，需要一定的通氣量，但通氣量過多或過少都不利于紅花素和異紅花素的積累。通氣過少可能會造成底物和中間產(chǎn)物柚皮素的積累，減少紅花素和異紅花素的生成，通氣過大可能會消耗掉已生成的紅花素和異紅花素。

底物溶液中助溶劑乙醇的濃度和過高的底物濃度對轉(zhuǎn)化也有不利的影響。通過改變底物配制方法，使用熱乙醇水進(jìn)行底物配制，大大降低了底物溶液中乙醇的濃度，減輕了對反應(yīng)酶系的抑制作用。而通過多次添加底物方式避免了一次加入高濃度底物對轉(zhuǎn)化的抑制作用。

總之，我們通過試驗實現(xiàn)紅花素和異紅花素發(fā)酵單位的大幅度提升，紅花素發(fā)酵單位達(dá)到389 μg/mL，異紅花素發(fā)酵單位達(dá)到946 μg/mL。