葛根枳椇子植物飲料對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用研究

吳名草，郁 星，沈旭丹，蔣文浩，錢 和

（1. 江陰天江藥業(yè)有限公司，江蘇 無錫 214429；2. 江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

酒精性肝損傷是一種常見的肝臟疾病，表現(xiàn)為脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化等，嚴(yán)重時(shí)甚至惡化為肝功能衰竭、肝癌[1]。隨著人們生活水平的提升，酒產(chǎn)業(yè)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展以及嗜酒人群的增加，由酒精引起的肝臟疾病的發(fā)病率日益增加，嚴(yán)重危害人體健康。研究發(fā)現(xiàn)，酒精性肝損傷主要是由于酒精在代謝過程中會(huì)通過多種途徑產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），使抗氧化酶活性降低，脂質(zhì)過氧化作用增加，從而破壞機(jī)體氧化還原平衡和線粒體功能，誘發(fā)氧化應(yīng)激及脂質(zhì)代謝紊亂，最后導(dǎo)致肝損傷[2]。早期臨床上治療酒精性肝損傷的措施主要有戒酒、營(yíng)養(yǎng)支持、藥物輔助治療等，但長(zhǎng)期服用藥物會(huì)產(chǎn)生一些不良反應(yīng)，因此研制效果好、低毒副作用的解酒護(hù)肝產(chǎn)品具備廣闊的市場(chǎng)前景。

研究表明葛根[3-5]、枳椇子[6-7]等藥食同源物質(zhì)對(duì)酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用。葛根是豆科植物野葛的干燥根，主要有效成分為黃酮類化合物和皂苷，有發(fā)表解肌退熱、升陽(yáng)止泄、生津止渴的作用，能使肝臟乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的活性提高，從而清除酒精及其代謝物，具有解酒護(hù)肝的功能[3-6]。枳椇子的主要有效成分為黃酮類化合物，有抗脂質(zhì)過氧化的功效，可減輕肝臟內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)程度[7-8]。較多研究表明，葛根和枳椇子具有協(xié)同解酒作用[9-10]。其機(jī)制可能是通過穩(wěn)定乙醇代謝途徑，加快機(jī)體乙醇的清除，從而達(dá)到解酒效果[9]。本研究通過一次大劑量酒精灌胃建立小鼠急性酒精性肝損傷模型，初步探討以葛根提取物、枳椇子提取物為主要成分的葛根枳椇子植物飲料對(duì)酒精誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用，為葛根枳椇子植物飲料在護(hù)肝方面的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑

葛根枳椇子植物飲料：江陰天江藥業(yè)有限公司提供；聯(lián)苯雙酯：國(guó)立堂大藥房。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、還原型谷胱甘肽（GSH）以及丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所；其余試劑：國(guó)藥試劑，均為分析純。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)健康KM小鼠，雄性，體質(zhì)量為（20±2）g：浙江維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0001）。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4）：上海申順生物科技有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101C-3B）：上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠；組織勻漿機(jī)：德國(guó)IKA公司；雙光束紫外可見分光光度計(jì)（TU-1900）：北京普析通用儀器；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（M5）：美國(guó)Molecular Devices。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及給藥

60只KM小鼠（雄性，6周齡），適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為6組（n=10），分組情況見表1。試驗(yàn)期間，飼養(yǎng)環(huán)境嚴(yán)格控制在溫度（23.1±0.9） ℃、相對(duì)濕度52.8%±3.0%、換氣次數(shù)為10～20次/h、光照12 h和黑夜12 h的清潔干燥環(huán)境中，小鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水。試驗(yàn)方案經(jīng)江南大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（JN.No20210415k 0600610[067]）。

表1 小鼠分組及試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Groups of mice and experimental design

如表1所示，小鼠隨機(jī)分成6組，分別為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、葛根枳椇子植物飲料低、中、高劑量組，灌胃體積為0.2 mL/20g·bw，每日一次，連續(xù)灌胃30 d。聯(lián)苯雙酯是治療病毒性肝炎和藥物性肝損傷引起轉(zhuǎn)氨酶升高的常用藥物，具有保護(hù)肝細(xì)胞，增加肝臟的解毒功能的藥理作用，且毒性低副作用小，因此選擇其作為陽(yáng)性對(duì)照組。葛根枳椇子植物飲料的劑量選擇依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》[11]，按照人體推薦攝入量每日40 g/60kg設(shè)置低、中、高3個(gè)劑量組（根據(jù)動(dòng)物試驗(yàn)與人體等效劑量換算方法，小鼠灌胃劑量為人體推薦攝入量5倍、10倍、20倍時(shí)，換算為人體等效劑量約為人體推薦攝入量的0.5倍、1倍、2倍）。末次灌胃1 h后，除空白組外，其他組按12 mL/kg·bw一次性灌胃50%的酒精。

1.3.2 樣品的采集和處理

末次灌胃16 h后，稱小鼠質(zhì)量，摘眼球取血后頸椎脫臼處死小鼠，然后立即取出肝臟，稱重后剖取小部分肝臟組織固定于4%多聚甲醛溶液，剩余部分-80 ℃保存。

1.3.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.3.1 小鼠肝臟指數(shù)的測(cè)定 小鼠頸椎脫臼處死后解剖，取完整肝臟，4 ℃預(yù)冷生理鹽水洗去肝臟表面浮血，濾紙拭干后稱重。按以下公式計(jì)算小鼠肝臟指數(shù)：

肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量(g)/體重(g)×100%

1.3.3.2 肝臟病理學(xué)檢查 在各組小鼠肝臟相同部位剪取部分組織，浸入4%多聚甲醛中固定過夜，脫水，石蠟包埋，蘇木精-伊紅（HE）染色，并于光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肝組織病理形態(tài)改變。

1.3.3.3 血清生化指標(biāo)和肝臟生化指標(biāo)的檢測(cè) 眼眶取血后，血漿靜置30 min，3 500 r/min離心15 min，得到分離血清，4 ℃保存。一周內(nèi)按照試劑盒說明書方法檢測(cè)血清中TC、TG、AST、ALT、LDL和HDL活力。

剩余肝組織4 ℃預(yù)冷生理鹽水沖洗后，用9倍（w/v）的預(yù)冷生理鹽水勻漿，在4 ℃、3 000 r/min條件下離心15 min，收集上清液，按照試劑盒說明書方法檢測(cè)肝組織SOD、MDA、GSH-Px和GSH活力。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根枳椇子植物飲料對(duì)小鼠肝臟指數(shù)的影響

小鼠的肝臟指數(shù)與酒精引起的肝損害密切相關(guān)，可以直接反映肝損傷的程度。由圖1可知，與空白組小鼠相比，模型組小鼠肝臟指數(shù)明顯增加（P＜0.01），說明酒精性肝損傷小鼠造模成功。而與模型組相比，灌胃陽(yáng)性藥物（聯(lián)苯雙酯）及不同劑量的葛根枳椇子植物飲料，均能降低小鼠的肝臟指數(shù)，其中中劑量組小鼠的肝臟指數(shù)降低最顯著4.66%±0.18%（P＜0.01），且其效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組4.66%±0.18%。表明葛根枳椇子植物飲料的攝入，可降低酒精性肝損傷小鼠的肝臟指數(shù)，減輕小鼠肝損傷程度，且中劑量的葛根枳椇子植物飲料效果最好。

圖1 小鼠的肝臟指數(shù)Fig.1 Liver index of mice

2.2 葛根枳椇子植物飲料對(duì)小鼠肝組織病理學(xué)變化的影響

肝臟作為酒精代謝的主要器官，酒精及其衍生物的代謝反應(yīng)會(huì)引起炎癥反應(yīng)，肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重甚至導(dǎo)致細(xì)胞壞死、纖維化。肝組織病理切片能直觀反映肝臟細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)的損傷程度。如圖2，通過光學(xué)顯微鏡對(duì)肝組織切片觀察可以發(fā)現(xiàn)，空白組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，細(xì)胞核無水腫、脂肪變性或其他病變。模型組小鼠的肝細(xì)胞明顯受損，具有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞變性，雙核細(xì)胞出現(xiàn)，脂肪空泡形成和其他負(fù)面變化。與模型組比較，低劑量組無明顯改善；陽(yáng)性對(duì)照組及葛根枳椇子植物飲料中、高劑量組的小鼠肝細(xì)胞病理?yè)p傷明顯減輕，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，排列比較整齊，壞死區(qū)域顯著減少。

圖2 小鼠的肝組織HE染色Fig.2 HE staining of mouse l iver

由此可見，中、高劑量的葛根枳椇子植物飲料對(duì)小鼠的組織病理學(xué)病變有一定的緩解和改善作用。

2.3 葛根枳椇子植物飲料對(duì)小鼠肝功能的影響

酒精代謝物可以通過結(jié)合肝臟細(xì)胞膜增加其通透性，進(jìn)而影響肝功能[12]。乙醛等代謝產(chǎn)物的積累和肝細(xì)胞的炎性損傷、氧化損傷等因素將共同導(dǎo)致肝細(xì)胞膜通透性增加，使細(xì)胞中轉(zhuǎn)氨酶從肝臟滲透到血液[12]，從而導(dǎo)致血液中ALT、AST濃度升高。因此血清中ALT、AST的含量是評(píng)估肝細(xì)胞損傷程度的重要指標(biāo)。

如圖3所示，對(duì)比空白組小鼠，模型組小鼠的ALT，AST水平較高，達(dá)到（16.41±3.86）U/L和（27.42±7.22）U/L，表明該模型已成功建立。對(duì)比模型組小鼠，葛根枳椇子植物飲料低、中、高劑量組小鼠的ALT、AST水平降低，且中、高劑量葛根枳椇子植物飲料對(duì)小鼠的AST水平干預(yù)效果顯著，分別下降到（19.17±6.22）U/L和（20.28±4.86）U/L，表明葛根枳椇子植物飲料干預(yù)對(duì)小鼠肝功能的恢復(fù)具有積極作用，且中、高劑量的葛根枳椇子植物飲料效果更明顯。這可能是由于植物飲料中葛根提取物、枳椇子提取物等成分加強(qiáng)酒精和乙醛在體內(nèi)的代謝，降低肝細(xì)胞膜通透性，恢復(fù)血清中ALT、AST的水平，起到肝保護(hù)作用。

圖3 葛根枳椇子植物飲料對(duì)小鼠肝功能的影響Fig.3 Effects of botanical beverage with pueraria extract and Hovenia dulcis Thunb. extract on liver function in mice

2.4 葛根枳椇子植物飲料對(duì)小鼠脂質(zhì)代謝的影響

酒精在機(jī)體內(nèi)代謝時(shí)，肝臟細(xì)胞的氧化還原平衡被破壞，肝臟對(duì)脂肪酸類物質(zhì)的氧化能力下降，進(jìn)而影響脂類物質(zhì)的代謝，導(dǎo)致TC、TG在肝細(xì)胞中大量蓄積[13]。此外，有研究顯示，它還能誘導(dǎo)皮下脂肪酸遷移至肝臟，引起肝臟內(nèi)TG等含量的增加，嚴(yán)重的將誘發(fā)酒精性脂肪肝的發(fā)生[14]。如圖4所示，對(duì)比空白組小鼠，模型組小鼠血清的TC、TG和LDL水平較高，分別為（5.32±0.63）mmol/L、（2.19±0.30）mmol/L和（0.32±0.12） mmol/L，而HDL水平較低，為（3.64±0.76）mmol/L，表明該模型已成功建立。對(duì)比模型組，葛根枳椇子植物飲料干預(yù)組的TC、TG和LDL水平有所下降，且中劑量葛根枳椇子植物飲料干預(yù)組效果較好，TC、TG和LDL分別降低至（4.77± 0.33） mmol/L、（1.92±0.24） mmol/L和（0.22±0.09）mmol/L（P＜0.05）。這表明使用中劑量的葛根枳椇子植物飲料干預(yù)對(duì)改善脂質(zhì)代謝紊亂具有更好的效果。這可能是由于葛根枳椇子植物飲料能加強(qiáng)肝臟對(duì)脂肪酸內(nèi)物質(zhì)的氧化能力，恢復(fù)小鼠血清TC、TG、LDL水平，改善脂質(zhì)代謝紊亂。

圖4 葛根枳椇子植物飲料對(duì)小鼠脂質(zhì)代謝的影響Fig.4 Effects of botanical beverage with pueraria extract and Hovenia dulcis Thunb. extract on lipid metabolism in mice

2.5 葛根枳椇子植物飲料對(duì)小鼠肝臟氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是酒精性肝損傷的一個(gè)重要原因。人體大量攝入酒精后，酒精在體內(nèi)氧化代謝為乙醛，引起抗氧化相關(guān)物質(zhì)的消耗，大量的自由基生成，機(jī)體的氧化還原平衡被破壞，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，進(jìn)而引發(fā)氧化損傷[15]。SOD、GSH-Px等抗氧化酶系和GSH等非酶類抗氧化物質(zhì)的協(xié)同作用可以保持機(jī)體自身抗氧化防御系統(tǒng)平衡，防止過氧化損傷[16]。MDA是脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志性產(chǎn)物，肝臟MDA含量的高低直接反映了肝臟氧化應(yīng)激的強(qiáng)烈程度[17]，常被看作是反映氧化損傷水平的重要指標(biāo)[17-18]。

如圖5所示，對(duì)比空白組小鼠的SOD、GSH-Px和GSH水平，模型組小鼠水平明顯降低，由（109.66±19.98）U/mg pro、（550.78±142.34）U/mg pro和（12.99±4.10） μmol/g pro下降為（76.68±13.07） U/mg pro、（328.64±66.35）U/mg pro和（7.96±2.83）μmol/g pro；而MDA水平顯著升高至（1.13±0.25）nmol/mg pro（P＜0.01），表明酒精性肝損傷模型成功建立。對(duì)比模型組，葛根枳椇子植物飲料中、高劑量組的SOD和GSH-Px水平顯著提高（P＜0.05），僅高劑量組的GSH水平明顯升高。此外，中、高劑量組的MDA的水平均顯著降低（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，中、高劑量的葛根枳椇子植物飲料具有緩解肝臟氧化應(yīng)激的作用，可抵抗酒精引起的肝損傷。

圖5 葛根枳椇子植物飲料對(duì)小鼠肝臟氧化相關(guān)指標(biāo)的影響Fig.5 Effects of botanical beverage with pueraria extract and Hovenia dulcis Thunb. extract on liver oxidation-related indicators in mice

3 結(jié)論

肝臟是酒精代謝的主要器官，也是酒精攻擊的靶器官。相關(guān)研究表明，葛根、枳椇子等物質(zhì)可用于急性、慢性酒精性肝損傷的防護(hù)。因此本研究通過建立小鼠急性酒精性肝損傷的試驗(yàn)動(dòng)物模型，觀察了葛根枳椇子植物飲料在一次大劑量酒精（50% V/V，0.016 L/kg）暴露下對(duì)急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用，試驗(yàn)結(jié)果表明，中、高劑量葛根枳椇子植物飲料的攝入，能增強(qiáng)肝臟抗氧化以及脂質(zhì)代謝能力，增強(qiáng)肝細(xì)胞功能，從而緩解小鼠在急性酒精暴露后的肝損傷程度，有效降低小鼠血清ALT、AST、TC、TG以及LDL水平，提高小鼠肝臟SOD、GSH-Px及GSH活性；還可顯著降低小鼠肝臟的脂質(zhì)過氧化水平，改善肝細(xì)胞脂肪變性情況。綜上所述，本研究表明一定劑量的葛根枳椇子植物飲料對(duì)急性酒精性肝損傷有明顯的保護(hù)作用，為其在酒精性肝損傷保護(hù)方面的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。