P53 對基于MRI 的骨關(guān)節(jié)炎間隙狹窄程度影響的臨床研究

張雙，信瑞強，石逸杰，李艷翠，彭如臣

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性、漸進性、炎癥性的關(guān)節(jié)退行性疾病，常累及膝關(guān)節(jié)、手和髖部[1]。OA 常表現(xiàn)為軟骨破壞、骨贅增生、滑膜增生，以疼痛為主要臨床表現(xiàn)[2]。OA 患者中以中老年患者多見，且女性患者多于男性，OA已經(jīng)成為嚴重影響身體健康及生活質(zhì)量的骨關(guān)節(jié)病[3]。然而，OA病因及發(fā)病機制尚不明確。目前的藥物治療常使用非甾體抗炎藥，主要是為了改善疼痛癥狀，然而治療效果有限，且有胃腸道及心血管并發(fā)癥風險的副作用。手術(shù)療法包括膝關(guān)節(jié)鏡及膝關(guān)節(jié)置換，然而OA 患者往往身體狀況較差，手術(shù)風險較高[4]。最近有人提倡使用微創(chuàng)干預治療OA，如關(guān)節(jié)腔注射、射頻消融，但治療效果及副作用有待進一步研究。MRI是一種靈敏的無創(chuàng)工具，具有早期檢測骨關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變的能力，并可以直接可視化地關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)進行量化。MRI 已成為評估OA的重要手段[5-6]。其對于OA 的發(fā)現(xiàn)以及診斷有很好的幫助作用,并且還能夠指導后期疾病的治療。

研究發(fā)現(xiàn)40%～80%的OA患者發(fā)病具有遺傳性，與某些基因的突變及表達變化有很強的相關(guān)性[7]。Meyer等[8]發(fā)現(xiàn)細胞周圍基質(zhì)(pericellular matrix，PCM)在表觀遺傳、代謝或生物力學刺激下，通過與軟骨細胞作用參與OA的發(fā)生發(fā)展。Lee等[9]發(fā)現(xiàn)CCL17 參與粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)誘發(fā)OA相關(guān)信號通路，提示CCL17 阻滯劑可作為OA 及疼痛治療的靶點分子。并且目前越來越多學者提倡個體化治療[10]。因此，在個體化遺傳基因方面探索OA的發(fā)病機制，對于預防與治療OA具有重要臨床價值。

生物信息學(bioinformatics)是利用生命科學與計算機科學技術(shù)挖掘分析生物大數(shù)據(jù)并探索疾病發(fā)病原理的一門新學科。而MRI 檢查的結(jié)果能夠顯示關(guān)節(jié)軟骨的病理變化，反映軟骨組織的成分含量，在此基礎上利用生物信息學結(jié)合影像分析和病例的基因分析，有效篩選疾病患者與正常個體間差異表達基因，從而發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點。隨著學科發(fā)展，越來越多研究者使用生物信息學技術(shù)研究各種疾病進程中的差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)，并探索其在生物過程、分子機制和信號傳導通路中的作用[11-13]。

本研究篩選OA 患者與正常人的DEGs，利用基因本體論(gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG) (https://www.kegg.jp/)對DEGs數(shù)據(jù)進行分析，同時用兩組數(shù)據(jù)中所有基因進行基因集合富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)，進而用DEGs構(gòu)建蛋白—蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡，同時篩選PPI網(wǎng)絡中的重要模塊并且鑒定核心基因。初步分析差異表達基因在OA 發(fā)生發(fā)展中的作用，進一步研究P53基因?qū)贛RI的OA間隙狹窄程度的影響。

1 材料和方法

1.1 微陣列芯片數(shù)據(jù)的獲得

GSE55235 基因表達譜數(shù)據(jù)從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Ominibus，GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載。GEO 是一個公共功能性基因組學數(shù)據(jù)倉庫，接受基于數(shù)組和序列的數(shù)據(jù)。GSE55235 的芯片數(shù)據(jù)由10 個OA 樣本和10 個對照樣本的mRNA 表達譜組成。該基因表達譜由Affymetrix HG-U133A chip (Platform GPL96)生成。所有OA樣本均取自OA患者滑膜組織，對照組樣本取自未患關(guān)節(jié)疾病的健康個體正?；そM織。

1.2 差異表達基因的識別

GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)是一個交互式的在線工具，用于從GEO 系列中識別差異表達基因。GEO2R可用于鑒別對照組與OA組滑膜組織標本的差異表達基因。如果一個探針集沒有同源基因，或者一個基因有多個探針集，數(shù)據(jù)將被刪除。篩選標準為P≤0.01，且|log(FC)|≥3。

1.3 利用GSEA進行GO和KEGG富集分析

GO是一種廣泛應用于生物信息學的本體論，它涵蓋了生物學的三個方面，包括細胞成分、分子功能和生物過程。KEGG是世界上最常用的生物信息數(shù)據(jù)庫之一，旨在了解先進的功能和生物系統(tǒng)。在分子水平上，KEGG專門整合了大量來自高通量實驗技術(shù)的實用程序數(shù)據(jù)庫資源。GSEA可以分析兩個樣本組中的所有測序基因, 它的輸入是一個基因表達矩陣，在這個矩陣中，基因被分成兩組，所有的基因先進行測序，然后用來表示兩組之間基因表達水平的變化趨勢。GSEA分析在序列列表的頂部或底部是否富集了一個先驗定義集的所有基因。利用GSEA軟件對OA 滑膜組織和正?；そM織的所有測序基因進行GSEA分析，在導入基因注釋文件、參考函數(shù)集和GSE55235中OA 滑膜組織和正?；そM織所有基因數(shù)據(jù)之后，GSEA軟件會進行分析并根據(jù)運算法則進行基因測序，從而獲得基因序列表, 后分析基因序列表中所有基因的位置，并將其累加得到富集分數(shù)(enrichment score，ES)，對ES進行標準化處理后，通過功能富集可以全面了解基因的生物學功能。以P值＜0.05為篩選標準。

1.4 PPI網(wǎng)絡和重要模塊的構(gòu)建與分析

將常用的差異表達基因?qū)隨TRING (search tool for the retrieval of interacting genes) (version 10.5)(http://string-db.org)系統(tǒng)后，這一在線工具可以預測和跟蹤PPI網(wǎng)絡。應用免費可視化軟件Cytoscape (version 3.6.1)對PPI 網(wǎng)絡進行可視化?；谕負湓恚珻ytoscape 插件MCODE(Molecular Complex Detection) (version 1.5.1)可以發(fā)現(xiàn)緊密耦合區(qū)域。采用MCODE對PPI網(wǎng)絡的各個模塊進行篩選，篩選標準為degree cut-off=6，node score cut-off=0.2，當設置度≥4時，可挖掘出關(guān)鍵基因。利用R語言軟件制作核心基因的熱圖譜。

1.5 患者資料

選取我院2020 年6 月至2021 年6 月收治的OA 間隙狹窄患者。納入標準：(1)全部患者經(jīng)過MRI 檢查后被診斷為OA 間隙狹窄；(2)臨床資料齊全；(3) 18 歲≤年齡≤80 歲；(4)凝血功能正常。排除標準：(1)具有精神疾病或認知障礙；(2)心、肝、肺功能差。本研究經(jīng)過首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院倫理委員會批準(2018-LHKY-008-02)，所有患者均簽署了書面知情同意書。

1.6 掃描參數(shù)

使用西門子3.0 T Skyra磁共振掃描儀(德國)對全部患者進行MRI檢查。掃描序列和參數(shù)如表1所示。

表1 掃描序列參數(shù)

1.7 診斷標準

根據(jù)患者的臨床資料，按性別(男/女)、年齡(≤60/＞60)、MMP1 (低/高)、VEGFA (低/高)、CXCL8 (低/高)、P53 (低/高)、MRI下OA 間隙狹窄程度(輕/重)進行分類。OA 間隙輕度狹窄：內(nèi)外側(cè)間隙不均衡，伴有輕度骨贅及軟骨下骨硬化，下肢的機械力線輕度內(nèi)移，膝關(guān)節(jié)有輕度內(nèi)翻。OA 間隙重度狹窄：內(nèi)外側(cè)間隙不均衡或者一側(cè)消失，伴有骨贅形成，軟骨下骨硬化明顯，下肢機械力線明顯內(nèi)移，膝關(guān)節(jié)嚴重內(nèi)翻畸形。

應用關(guān)節(jié)鏡診治方法取患者滑膜組織，進行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測，分析MMP1、VEGFA、CXCL8以及P53的表達水平(以均值為界，低于均值水平為低表達，高于均值為高表達)。

1.8 統(tǒng)計學方法

所有的統(tǒng)計分析使用SPSS 21.0軟件。計量資料用均數(shù)±標準差表示。采用Pearson卡方檢驗，分析臨床參數(shù)與OA間隙狹窄程度的關(guān)系。采用Spearman-rho檢驗將臨床資料與OA間隙狹窄程度進行相關(guān)性分析。采用多因素Logistic回歸分析，計算OA間隙狹窄程度各變量的OR值。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 OA差異表達基因的識別

通過GEO2R 對GSE55235 數(shù)據(jù)集的分析，可以看出火山圖中對照組與OA 組滑膜組織的差異。GSE55235 的分析結(jié)果識別出91個差異表達基因(圖1)。

圖1 使用GEO2R 對微陣列數(shù)據(jù)(GSE55235)進行分析，火山圖顯示了對照組與骨關(guān)節(jié)炎組滑膜樣本的差異。

2.2 對OA中差異表達基因進行GO和KEGG通路富集分析

GO富集分析顯示OA中有2126/4081個基因組上調(diào)，323個基因組在名義P值＜0.05時顯著富集，107個基因組在名義P值＜0.01時顯著富集。此外，OA中1955/4081個基因組下調(diào)，481個基因組在名義P值＜0.05時顯著富集，212個基因組在名義P值＜0.01時顯著富集。此外，KEGG富集分析表明OA組與正常組滑膜樣本相比，有101/168個基因組上調(diào)，18個基因組在名義P值＜0.05時顯著富集，9個基因組在名義P值＜0.01時顯著富集。OA組中67/168個基因組下調(diào)，11個基因組在名義P值＜0.05時顯著富集，5個基因組在名義P值＜0.01時顯著富集。OA相關(guān)的差異表達基因主要富集在“GO_CELLULAR_RESPONSE_TO_HYDROGEN_PEROXIDE”和“KEGG_P53_SIGNALING_PATHWAY”(圖2)。

圖2 利用基因集合富集分析(GSEA)對微陣列數(shù)據(jù)(GSE55235)中骨關(guān)節(jié)炎組與正常組滑膜樣本間差異表達基因進行功能富集分析的2個顯著富集圖。2A：GO_CELLULAR_RESPONSE_TO_HYDROGEN_PEROXIDE富集圖；2B：KEGG_P53_SIGNALING_PATHWAY富集圖。

2.3 網(wǎng)絡的構(gòu)建及重要模塊和關(guān)鍵基因的識別

構(gòu)建PPI網(wǎng)絡，識別顯著性模塊，PPI網(wǎng)絡可以得出OA相關(guān)的差異表達基因之間具有交錯復雜的關(guān)系(圖3A)，重要模塊中有26條邊和8個節(jié)點(圖3B)。以Degree≥4為判斷標準。通過Cytoscape 鑒定出了4 個關(guān)鍵基因：MMP1、CXCL8、VEGFA 和JUN(圖3C)。熱圖顯示關(guān)鍵基因基本可以將OA滑膜樣本與正?；颖緟^(qū)分開。與正常組對比，MMP1在OA組中高表達，CXCL8、VEGFA和JUN在OA組中低表達(圖4)。

圖3 使用Cytoscape構(gòu)建差異表達基因的PPI(蛋白—蛋白互作)網(wǎng)絡、重要的模塊及核心基因網(wǎng)絡。3A：PPI 網(wǎng)絡；3B：使用MCODE 鑒定的重要模塊；3C：核心基因網(wǎng)絡。

圖4 微陣列數(shù)據(jù)(GSE55235)中對照組與骨關(guān)節(jié)炎(OA)組滑膜樣本關(guān)鍵基因的層次聚類熱圖。X 軸表示樣本符號(從左至右為10 個對照組滑膜組織樣本和10個OA組滑膜樣本)，Y軸表示差異表達探針。低表達：淺藍色；中表達：淺紫色；高表達：紫色。

2.4 Pearson卡方檢驗OA間隙狹窄程度與臨床參數(shù)的相關(guān)性

MRI 觀察OA 間隙狹窄影像如圖5 所示。通過Pearson 卡方檢驗顯示了OA 間隙狹窄程度與相關(guān)臨床因素的關(guān)系。在個體中，P53 (P=0.003)與OA 間隙狹窄程度顯著相關(guān)。然而，性 別(P=0.536)、年 齡(P=0.258)、MMP1 (P=0.402)、VEGFA (P=0.768)、CXCL8 (P=0.555)和OA 間隙狹窄程度之間沒有顯著的相關(guān)性(表2)。

圖5 MRI 觀察下骨關(guān)節(jié)炎間隙狹窄影像。5A：女，49 歲，膝關(guān)節(jié)不適半年，冠狀位FS T2WI 示內(nèi)外側(cè)關(guān)節(jié)間隙不等，內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)間隙輕度狹窄；5B：女，79 歲，膝關(guān)節(jié)疼痛1 年，冠狀位FS T2WI 示內(nèi)外側(cè)關(guān)節(jié)間隙不等，內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)間隙重度狹窄。

2.5 Spearman 相關(guān)性分析進一步檢驗OA 間隙狹窄程度與臨床參數(shù)的關(guān)系

為了確認相關(guān)臨床參數(shù)對OA 間隙狹窄程度的作用，本研究進行了進一步的相關(guān)性分析。Spearman 相關(guān)系數(shù)顯示P53 (ρ=-0.422，P=0.002)與OA 間隙狹窄程度顯著相關(guān)。然而，性別(ρ=-0.088，P=0.545)、年齡(ρ=0.160，P=0.267)、MMP1(ρ=0.119，P=0.412)、VEGFA (ρ=-0.040，P=0.774)、CXCL8 (ρ=-0.084，P=0.564)、P53 (ρ=-0.422，P=0.002)與OA 間隙狹窄程度無顯著相關(guān)性(表2)。

表2 Pearson卡方檢驗、Spearman相關(guān)性分析骨關(guān)節(jié)炎間隙狹窄程度與臨床參數(shù)的相關(guān)性

2.6 多因素Logistic回歸分析OA間隙狹窄程度的相關(guān)因素

應用多因素Logistic回歸描述研究對象在多因素水平上的OR 和95%CI，回歸分析顯示，P53 (OR=0.112，95%CI: 0.025～0.495，P=0.004)與OA間隙狹窄程度顯著相關(guān)，而性別(OR=0.584，95%CI：0.130～2.610，P=0.481)、年 齡(OR=3.498，95%CI：0.814～15.028，P=0.092)、MMP1 (OR=2.030，95%CI：0.479～8.597，P=0.336)、VEGFA (OR=0.564，95%CI：0.139～2.292，P=0.423)、CXCL8 (OR=0.487，95%CI：0.109～2.186，P=0.348)與OA間隙狹窄程度無顯著相關(guān)性(表3)。

表3 多因素Logistic比例回歸分析骨關(guān)節(jié)炎間隙狹窄程度的相關(guān)因素

3 討論

本研究通過生物信息學分析廣泛用于篩選疾病患者與正常個體間差異表達基因與分子，從而為選擇治療靶點提供可靠方法及依據(jù)。通過提取OA患者與正?；颖鹃g的差異表達基因，利用MRI技術(shù)，對組織樣本進行鑒別，滑膜和軟骨都與OA有著緊密的聯(lián)系，然而在本研究中對于滑膜組織的分析并不能完全取代關(guān)節(jié)軟骨。本研究通過OA的基因表達譜，利用生物信息學分析篩選了DEGs。DEGs基因集富集分析全面概述了OA的一些主要病理生理機制：細胞對過氧化氫的反應、P53信號通路。臨床統(tǒng)計結(jié)果表明P53與OA間隙狹窄程度顯著相關(guān)，而性別、年齡、MMP1、VEGFA、CXCL8與OA間隙狹窄程度無顯著相關(guān)性。為OA的治療發(fā)展提供了P53這一潛在靶點。

3.1 MRI檢查對早期OA治療的優(yōu)勢

OA是一種以疼痛及骨關(guān)節(jié)功能退化為主要表現(xiàn)的臨床慢性疾病[14]。目前OA發(fā)病機制尚未闡明，治療主要針對疼痛癥狀，然而治療效果不理想，且耗費大，嚴重影響了OA患者的生活質(zhì)量和預期壽命。另外OA的相關(guān)機制研究及治療假說仍需要進一步研究。隨著MRI檢查技術(shù)的不斷發(fā)展完善，其在OA的診斷當中顯示出巨大作用[15]。在大多數(shù)國家，MRI檢查多在疑似OA患者中進行[16]。MRI具有高分辨率、多參數(shù)、多平面的優(yōu)勢。它不僅能夠直接、全面地顯示關(guān)節(jié)及其軟骨的早期微小病變，而且對于軟組織的分辨率高，能夠清晰地顯示關(guān)節(jié)周圍的軟組織，比如關(guān)節(jié)囊、韌帶、滑膜等的早期病變[17-18]。MRI檢查尤其對液體極為敏感，能夠發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)腔內(nèi)的少量液體[19]。MRI檢查可以更準確地發(fā)現(xiàn)韌帶滑膜的早期損傷，對OA的早期診斷有很大幫助[20]。因此，探討OA發(fā)生發(fā)展的分子機制，有利于OA患者的早期篩查、診斷及治療，是降低OA發(fā)病率的有效方式之一。

3.2 細胞對過氧化氫的反應與OA的發(fā)生發(fā)展關(guān)系

細胞對過氧化氫的反應作為細胞重要功能參與機體多種生理活動。Tiku等[21]發(fā)現(xiàn)活性氧通過影響軟骨細胞脂質(zhì)過氧化氫參與OA 發(fā)病。Jovanovic 等[22]發(fā)現(xiàn)一氧化氮能作用于過氧化氫等氧化物質(zhì)誘導關(guān)節(jié)滑膜細胞死亡進而誘發(fā)OA。Khan用過氧化氫處理關(guān)節(jié)軟骨發(fā)現(xiàn)，高水平的氧化應激能引起軟骨組織局部基因表達改變，這些異常表達的基因與關(guān)節(jié)退化和關(guān)節(jié)炎相關(guān)，提示氧化刺激在OA 發(fā)病中扮演重要作用[23]。另外Goutas 等[24]發(fā)現(xiàn)OA 軟骨細胞對氧化損傷的自噬反應降低，提示過氧化氫等氧化刺激引起OA 的機制仍待進一步研究。與上述研究結(jié)果一致，本研究通過生物大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)OA軟骨組織中細胞對過氧化氫的反應表達明顯上調(diào)。我們推測氧化刺激通過某些信號通路促進了OA 的發(fā)生發(fā)展，并可能作為潛在的治療靶點，相關(guān)分子機制值得進一步探索。

3.3 P53作為OA治療過程潛在靶點的驗證

P53信號通路是機體相當重要的一條信號通路，參與機體多種生理活動。Slattery等[25]發(fā)現(xiàn)P53信號通路激活可引起某些miRNAs異常表達，進而通過影響細胞周期、凋亡、血管生成參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Yang等[26]同樣發(fā)現(xiàn)P53信號通路在調(diào)節(jié)細胞周期、維持機體正常免疫應答、組織修復及器官功能等方面具有重要作用。Seemayer等[27]發(fā)現(xiàn)P53信號通路激活參與類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞(RASF)體內(nèi)和體外的功能反應。另外，Yan等[28]發(fā)現(xiàn)P53乙?；癄顟B(tài)改變參與miR-34a對SIRT1/P53信號通路的直接調(diào)控，進而影響OA的發(fā)生發(fā)展。Yang等[29]通過對OA患者軟骨組織測序發(fā)現(xiàn)，lncRNA-ROR在mRNA和蛋白水平上均抑制P53的表達；進一步研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-ROR通過HIF1α和P53調(diào)控軟骨細胞的凋亡和自噬；有研究提示lncRNA-ROR在OA發(fā)病機制中起重要作用并能作為潛在的治療靶點，P53在其中扮演的具體作用值得進一步研究。最近有研究報道透明質(zhì)酸(HA)和富血小板血漿(PRP)關(guān)節(jié)腔注射對OA的個體化治療效果好，Chiou等[30]發(fā)現(xiàn)ROS、P53、MMP1在治療過程中發(fā)揮重要作用。Li等[31]發(fā)現(xiàn)硫酸軟骨素鎂(MGCS)能有效地促進OA軟骨細胞的增殖，減少軟骨細胞的凋亡，在此過程中凋亡相關(guān)基因P53表達下調(diào)起到重要作用。有研究表明，P53 的上調(diào)在OA 誘導的持續(xù)性疼痛中也起著重要作用[32]。軟骨細胞衰老被認為在OA的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而P53的激活被認為是衰老調(diào)控的重要步驟[33]，可能對于OA具有治療作用[34]。與上述研究結(jié)果一樣，本研究通過對比OA患者軟骨組織與正常組織發(fā)現(xiàn)，OA 患者軟骨組織KEGG_P53_SIGNALING_PATHWAY的表達明顯下調(diào)，提示P53信號通路很可能參與了OA的發(fā)生與發(fā)展，并能作為潛在的治療靶點。

3.4 本研究的不足及展望

盡管本研究進行了嚴謹?shù)纳镄畔W分析，但仍有不足。本文僅是進行了生物信息學數(shù)據(jù)分析和臨床樣本驗證，沒有進行動物實驗的綜合驗證。在今后的研究中，應增加生物信息學技術(shù)的臨床樣本種類和數(shù)量，另外進行動物實驗相關(guān)的綜合驗證，增加研究的可信度。

綜上所述，生物信息學技術(shù)可作為預測OA 進展、探討OA發(fā)生發(fā)展機制的有效工具。MRI有利于OA患者早期的診斷與治療，并降低OA 發(fā)病率。另外，OA 患者與正常人軟骨組織之間存在差異表達基因，其可能參與OA 發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制，特別是“細胞對過氧化氫的反應、P53 信號通路”能為OA 的診斷和治療提供新的研究靶點。P53 在OA 患者中低表達，可能作為其預測和治療的潛在靶點。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明沒有利益沖突。