腸桿菌Enterobacteria sp. X57 富集鈾(Ⅵ)的初探

曾 倩，朱 婷,2，李飛澤，楊遠(yuǎn)友，楊吉軍，蘭 圖，廖家莉,*，劉 寧

(1.四川大學(xué) 原子核科學(xué)技術(shù)研究所 輻射物理及技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064；2.四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064)

作為核能利用中最主要的元素之一，鈾(U)具有較強(qiáng)的化學(xué)和放射性毒性[1-3]。相關(guān)研究[4-6]表明，鈾在進(jìn)入生物體后會引起腎功能衰竭、DNA損傷、酶失活等諸多問題。隨著核能與核技術(shù)的開發(fā)，無論是在前端的鈾礦開采，還是后續(xù)的放射性廢物處理處置，鈾都會不可避免地遷移至環(huán)境[2-8]，并隨食物鏈逐漸富集，最終威脅到人類的生命健康[1]。在當(dāng)前眾多的鈾污染環(huán)境修復(fù)方法中，微生物修復(fù)法具有獨(dú)特優(yōu)勢[6-7]。首先，微生物具有比表面積大、生物轉(zhuǎn)化效率高、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，其表面存在豐富的活性位點(diǎn)，可高效富集環(huán)境中的金屬離子[6-10]，被認(rèn)為是替代傳統(tǒng)的物理和化學(xué)材料的一種低廉、環(huán)保且高效的修復(fù)材料[3,6-7]。其次，微生物還可通過生物還原、沉淀以及礦化等更復(fù)雜的機(jī)制直接或間接地改變環(huán)境中鈾的溶解度，實(shí)現(xiàn)對鈾的長期原位固定[10-17]。因此，國內(nèi)外學(xué)者近年來開展了大量關(guān)于微生物與鈾相互作用的研究，以期利用微生物對鈾的富集特性實(shí)現(xiàn)鈾污染環(huán)境的原位修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌、真菌以及單細(xì)胞藻類等絕大部分微生物均具有富集鈾的能力，但不同類型的微生物對鈾的富集行為可能并不一致[10-11]。如Gadd課題組[13]監(jiān)測了A.Niger和P.javanicus等真菌在含鈾培養(yǎng)基中的生長過程，發(fā)現(xiàn)U(Ⅵ)被轉(zhuǎn)化為難溶的晶礦形式沉積在菌絲基質(zhì)上。Suzuki等[14]也發(fā)現(xiàn)Desulfosporosinusspp.可使溶液中的U(Ⅵ)以UO2納米顆粒的形式析出。王鐵山課題組[15]的研究則表明，除吸附作用外，S.cerevisiae還可通過生物代謝活動(dòng)刺激鈾的礦化。本課題組[16-17]在近期開展的鈾與Bacillussp. dwc-2相互作用研究中發(fā)現(xiàn)，該菌可通過調(diào)控生物吸附、還原、礦化沉積等不同的生物機(jī)制實(shí)現(xiàn)多種環(huán)境條件下對U(Ⅵ)的富集。

基于此，本文從某鈾污染場所分離出一株新型腸桿菌Enterobactersp. X57，對其進(jìn)行研究，考察相關(guān)環(huán)境影響因素和微生物活性對其富集鈾行為的影響。在此基礎(chǔ)上，利用動(dòng)力學(xué)分析和傅里葉紅外光譜(FT-IR)、掃描電子顯微鏡(SEM)、透射電子顯微鏡(TEM)、能譜(EDS)及X射線衍射(XRD)等多種分析手段進(jìn)一步探索鈾在Enterobactersp. X57中的富集機(jī)制，以尋找對鈾具有較高耐受性和富集能力的新型微生物。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 主要試劑及儀器

1) 菌體分離與培養(yǎng)

Enterobactersp. X57菌分離自我國西南地區(qū)某鈾污染場所排污口土壤。在鈾的脅迫下，利用改良的Luria-Bertani (LB)瓊脂培養(yǎng)基(5 g/L 酵母粉、10 g/L 胰蛋白胨、10 g/L NaCl、15 g/L 瓊脂以及100～400 mg/L硝酸鈾酰)對土壤中的微生物進(jìn)行培養(yǎng)、分離以及純化。提取純化菌株的基因組DNA進(jìn)行16S rRNA測序分析。序列對比結(jié)果顯示，Enterobactersp. X57與EnterobacterHormaecheisubsp.hoffmannii.菌最接近，相似度約為99.5%。

實(shí)驗(yàn)所需菌體的制備方法如下：將Enterobactersp. X57接種于滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃下培養(yǎng)約20 h，以5 000 r/min、10 min離心收集菌體，并用無菌水多次洗滌。將獲得的菌體等量分為若干份，活菌于4 ℃中保存，死菌則分別通過高溫加熱(85 ℃、30 min)和超聲破碎(70%功率、6 s間隔、3 s脈沖、60 min)兩種方式滅活制得。

2) 鈾溶液配制

將U3O8(純度≥99.5%，湖北楚盛威化工有限公司)在850 ℃下煅燒30 min后密封，存于干燥塔內(nèi)。稱取適量預(yù)處理過的U3O8，用濃硝酸進(jìn)行多次消解，直至固體溶解完全。加入硝酸酸化水稀釋，制成pH=2.00的1 g/L硝酸鈾酰儲備液[23]。其余化學(xué)試劑除特別說明外均為市售分析純。

3) 主要儀器

ZQLY-180GF振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；pHs-3C型pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；TG16G離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；Optima 8000型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)，美國PerkinElmer；IRTracer-100型傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)，日本Shimadzu；SU8000型掃描電子顯微鏡(SEM)、HT7700型透射電子顯微鏡(TEM)，日本Hitachi；XRD-6100型X射線衍射儀(XRD)，日本Shimadzu。

1.2 鈾富集

將1 g/L的硝酸鈾酰儲備液稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度，添加10 mmol/L 甘油磷酸鈉(C3H6NaO7P，SGP)作為菌體生存的唯一磷源和碳源。隨后，用0.1 mmol/L NaOH或HCl溶液調(diào)整溶液pH值。溶液經(jīng)真空膜過濾法滅菌后，在無菌環(huán)境中添加1 g/L(干重)的菌體，進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)。為扣除其他非生物因素對鈾富集的影響，另設(shè)了對照組，對照組中除不添加菌體外，其余條件均與實(shí)驗(yàn)組一致。分別考察接觸時(shí)間(t)、初始pH值、初始U(Ⅵ)濃度(c0)、溫度(T)、無機(jī)離子及生物活性對Enterobactersp. X57富集鈾的影響。

培養(yǎng)一定時(shí)間后，以10 000 r/min離心分離固液相。用ICP-OES測定上清液中U(Ⅵ)的濃度(ct)。對離心收集的菌體用無菌純水洗凈后，分別進(jìn)行真空冷凍干燥和3.0%戊二醛溶液低溫固定處理。

1.3 表征

對于冷凍干燥后的菌體，將其置于瑪瑙研缽中研磨成粉后進(jìn)行FT-IR和XRD分析。對于經(jīng)戊二醛預(yù)固定處理的菌體，用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇對其進(jìn)行梯度脫水，每次10 min。然后用超臨界CO2干燥樣品，采用SEM對其進(jìn)行分析。用于TEM分析的菌體在預(yù)固定后還需進(jìn)行包埋、切片、染色以及干燥處理。

1.4 數(shù)據(jù)處理

按照式(1)、(2)計(jì)算菌對U(Ⅵ)的富集率R以及富集量qt：

R=(c0-ct)/c0×100%

(1)

qt=(c0-ct)/ccell

(2)

式中：ct為t時(shí)刻的U(Ⅵ)濃度，mg/L；qt為t時(shí)刻菌體對鈾的總富集量，mg/g(干重)；ccell為溶液中添加的菌體濃度，g/L(干重)。

采用Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析；采用Visual MINTEQ 3.1軟件模擬鈾的存在形態(tài)。

2 結(jié)果與討論

2.1 Enterobacteria sp. X57富集U(Ⅵ)的影響因素

1) 接觸時(shí)間

c0=100 mg/L、ccell=1 g/L、初始pH=7.00、T=303 K條件下，接觸時(shí)間對Enterobacteriasp. X57富集U(Ⅵ)的影響示于圖1。由圖1可知，對照組中鈾的濃度幾乎沒有變化，而實(shí)驗(yàn)組的富集率隨時(shí)間增大，說明實(shí)驗(yàn)組中U(Ⅵ)濃度的降低全部歸因于菌體對鈾的富集。Enterobacteriasp. X57對U(Ⅵ)的富集率隨接觸時(shí)間的增加而不斷增加。在最初的4 h內(nèi)，溶液中的U(Ⅵ)被菌體快速富集，隨后富集速率逐漸減慢，約在20 h時(shí)逐漸趨于表觀平衡。此時(shí)菌體對U(Ⅵ)的富集率約為96.58%。Enterobacteriasp. X57對U(Ⅵ)的富集過程較為緩慢，這可能與微生物對鈾的應(yīng)激響應(yīng)機(jī)制有關(guān)[11]。已有研究表明，微生物與U(Ⅵ)接觸后，會自發(fā)啟動(dòng)一系列生物響應(yīng)機(jī)制以抵抗或緩解鈾的毒性，從而在一定程度上對U(Ⅵ)產(chǎn)生排斥[1]。但隨著菌體自身防御性能的逐漸減弱，溶液中的U(Ⅵ)仍不可避免地緩慢富集在細(xì)胞上。

圖1 接觸時(shí)間對Enterobacteria sp. X57富集鈾(Ⅵ)的影響Fig.1 Effect of contact time on U(Ⅵ) enrichment by Enterobacteria sp. X57

為進(jìn)一步了解Enterobacteriasp. X57對U(Ⅵ)的富集過程，采用準(zhǔn)一級動(dòng)力學(xué)模型、準(zhǔn)二級動(dòng)力學(xué)模型和粒內(nèi)擴(kuò)散模型對該過程進(jìn)行評估，相關(guān)方程的線性表達(dá)式示于式(3)～(5)：

ln(qe-qt) =lnqe-k1t

(3)

(4)

qt=kdit1/2+Ci

(5)

式中：qe為平衡時(shí)對鈾的富集量，mg/g；k1(min-1)和k2(g/(mg·min))分別為準(zhǔn)一級和準(zhǔn)二級動(dòng)力學(xué)模型的速率常數(shù)；Kdi為粒內(nèi)擴(kuò)散模型速率常數(shù)，mg/(g·min0.5)；Ci為邊界層厚度決定的常數(shù)，mg/g。

Enterobacteriasp. X57富集U(Ⅵ)的準(zhǔn)一級動(dòng)力學(xué)和準(zhǔn)二級動(dòng)力學(xué)模型擬合參數(shù)列于表1。由表1可見，其相關(guān)系數(shù)R2分別為0.927 3和0.999 8，且準(zhǔn)二級動(dòng)力學(xué)模型的理論富集量qe,cal與實(shí)驗(yàn)測得的富集量qe,exp非常接近，表明準(zhǔn)二級動(dòng)力學(xué)模型可更好地描述Enterobacteriasp. X57對U(Ⅵ)的富集過程。通常情況下，準(zhǔn)二級動(dòng)力學(xué)模型假設(shè)反應(yīng)速率由固體表面未被占有的反應(yīng)空位數(shù)的平方值決定，即整個(gè)過程由化學(xué)反應(yīng)控制[8-9]，因此可認(rèn)為Enterobacteriasp. X57與U(Ⅵ)之間發(fā)生了電子共用或電子轉(zhuǎn)移。

表1 Enterobacteria sp. X57富集U(Ⅵ)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetics parameter of U(Ⅵ) enrichment by Enterobacteria sp. X57

注：qe,cal和qe,exp分別為理論和實(shí)驗(yàn)富集量

粒內(nèi)擴(kuò)散模型的擬合結(jié)果示于圖2。由圖2可見，該生物對U(Ⅵ)的富集過程由3條不過原點(diǎn)的線性部分構(gòu)成，各部分依次代表溶液中的U(Ⅵ)與菌體快速絡(luò)合的傳質(zhì)階段、U(Ⅵ)在菌體中的跨膜擴(kuò)散階段以及U(Ⅵ)在胞內(nèi)的緩慢反應(yīng)階段。這一結(jié)果表明粒內(nèi)擴(kuò)散不是控制U(Ⅵ)在Enterobacteriasp. X57上富集的唯一限速步驟。

圖2 Enterobacteria sp. X57富集U(Ⅵ)的粒子內(nèi)擴(kuò)散模型擬合結(jié)果Fig.2 Fitting plot of U(Ⅵ) enrichment by Enterobacteria sp. X57 with intra-particle diffusion model

2) pH值

c0=100 mg/L、ccell=1 g/L、T=303 K、t=1 440 min條件下，溶液初始pH值對Enterobacteriasp. X57富集U(Ⅵ)的影響示于圖3。由圖3可見，初始pH=7.00時(shí)，Enterobacteriasp. X57對U(Ⅵ)的富集率最高，溶液偏酸或偏堿均不利于Enterobacteriasp. X57對U(Ⅵ)的富集，且在酸性條件下，pH值的影響更顯著。

圖3 pH值對Enterobacteria sp. X57富集鈾(Ⅵ)的影響Fig.3 Effect of pH on U(Ⅵ) enrichment by Enterobacteria sp. X57

3) 溫度

c0=100 mg/L、ccell=1 g/L、pH=7.00、t=1 440 min條件下，溫度對Enterobacteriasp. X57富集U(Ⅵ)的影響示于圖5。由圖5可見，在293～313 K溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，Enterobacteriasp. X57對U(Ⅵ)的富集速率以及富集量均顯著提升。當(dāng)溫度由293 K升至303 K時(shí)，菌體中U(Ⅵ)的富集量增加了約18.37 mg/g，而當(dāng)溫度進(jìn)一步提高至313 K時(shí)，平衡時(shí)間由20 h縮短至6 h左右，但對U(Ⅵ)的富集量無顯著提升。富集效果的提升可能是由于較高的溫度增強(qiáng)了細(xì)胞的表面活性和溶液介質(zhì)的動(dòng)能[16]。為貼近環(huán)境溫度并保證菌體活性和對鈾的富集效果，后續(xù)研究仍在303 K下進(jìn)行。

4) 初始鈾濃度

ccell=1 g/L、pH=7.00、T=303 K、t=1 440 min條件下，初始U(Ⅵ)濃度對Enterobacteriasp. X57富集U(Ⅵ)的影響示于圖6。由圖6可見，初始U(Ⅵ)濃度對Enterobacteriasp. X57富集U(Ⅵ)的影響呈兩個(gè)不同的變化趨勢。在一定范圍內(nèi)，初始鈾濃度的升高可能增加了鈾與單位質(zhì)量菌體之間相互作用的機(jī)會，使得鈾的富集量不斷升高。因此當(dāng)初始濃度為25～200 mg/L時(shí)，菌體中U(Ⅵ)的富集量也隨鈾濃度的升高而不斷增加。但過量的鈾可能會引起物生物的急性應(yīng)激響應(yīng)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或致菌體死亡[1,11,20]。因此當(dāng)U(Ⅵ)濃度高于200 mg/L時(shí)，Enterobacteriasp. X57對U(Ⅵ)的生物富集能力隨濃度的升高而顯著下降。U(Ⅵ)濃度為200 mg/L時(shí)，Enterobacteriasp. X57對鈾的最大富集量約為175.52 mg/g(干重)。該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的Bacilluscereus12-2[12]、Bacillusthuringiensis016[21]、Kocuriasp.[22]等天然細(xì)菌在相同U濃度條件下對U的富集容量(170～200 mg/g)相當(dāng)。整體上，Enterobacteriasp. X57具備較好的U污染環(huán)境修復(fù)的潛力。

圖6 初始鈾濃度對Enterobacteria sp. X57富集鈾(Ⅵ)的影響Fig.6 Effect of initial uranium concentration on U(Ⅵ) enrichment by Enterobacteria sp. X57

5) 共存離子

圖7 共存離子對Enterobacteria sp. X57富集鈾(Ⅵ)的影響Fig.7 Effect of coexistence ion on U(Ⅵ) enrichment by Enterobacteria sp. X57

6) 微生物細(xì)胞活性

c0=100 mg/L、ccell=1 g/L、pH=7.00、T=303 K、t=1 440 min條件下，U(Ⅵ)在不同生物活性Enterobacteriasp. X57中的富集行為示于圖8。由圖8可見，與活菌相比，滅活后的菌體對鈾的富集量有所降低，且不同滅活處理的菌體對U(Ⅵ)的富集行為存在一定差異。菌體經(jīng)高溫?zé)釡缁詈螅?xì)胞出現(xiàn)了少量的自溶，導(dǎo)致菌體對U(Ⅵ)的富集量一定程度降低，且由于細(xì)胞完全失活，不再具備抵抗外界脅迫的作用，使得U(Ⅵ)在菌體中快速富集，約4 h達(dá)到平衡。已有研究也證實(shí)，微生物對金屬離子的生物吸附不依賴細(xì)胞的代謝活性[15]，相反，對于具有相同完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低活或死亡菌體，其表現(xiàn)出的吸附性能更佳[7,9,11]。而對于超聲滅活的菌體，絕大部分菌體被瓦解成細(xì)胞碎片，其對鈾的富集量也隨之降低?？紤]到超聲處理后，胞內(nèi)流出物仍保留了一定的生物活性，這些物質(zhì)也可能與U(Ⅵ)絡(luò)合形成可溶性的化合物[12]，一定程度上影響了細(xì)胞碎片對U(Ⅵ)的富集。

圖8 細(xì)胞活性對Enterobacteria sp. X57富集鈾(Ⅵ)的影響Fig.8 Effect of activity of Enterobacteria sp. X57 on U(Ⅵ) enrichment

2.2 Enterobacteria sp. X57富集U(Ⅵ)的機(jī)理分析

1) FT-IR分析

圖9 Enterobacteria sp. X57的FT-IR譜Fig.9 FT-IR spectrum of Enterobacteria sp. X57

2) 電鏡分析

為進(jìn)一步掌握U(Ⅵ)在Enterobacteriasp. X57中的分布以及富集過程中菌體的形貌變化，采用SEM、TEM和EDS對富集鈾前后的菌體進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖10所示。從圖10a、d可看出，富集前菌體細(xì)胞表面光滑，呈飽滿桿狀。富集后，細(xì)胞質(zhì)皺縮、細(xì)胞結(jié)構(gòu)塌縮，且在細(xì)胞周質(zhì)空間和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)觀察到長為100～200 nm的針狀沉積物(圖10b、e)。EDS能譜證實(shí)，這些沉積物中含有U、P、C、O、N等元素(圖10c、f)，表明Enterobacteriasp. X57具有將U(Ⅵ)胞內(nèi)沉積的能力。鈾作為一種非生命必需元素，目前尚無研究表明微生物中存在鈾的受體[1,11]。因此，普遍認(rèn)為U(Ⅵ)是通過其生物毒性破壞了細(xì)胞膜的選擇通透性，從而擴(kuò)散至胞內(nèi)。

a,d——富集前SEM與TEM圖像；b,e——富集后SEM與TEM圖像；c,f——富集前后EDS分析結(jié)果

3) 鈾沉積物的XRD分析

利用XRD進(jìn)一步分析細(xì)胞中鈾沉積物的結(jié)構(gòu)及組成，Enterobacteriasp. X57的XRD譜示于圖11。由圖11可發(fā)現(xiàn)菌體在富集鈾后出現(xiàn)了幾個(gè)主要的晶體衍射峰，通過與ICDD數(shù)據(jù)庫的標(biāo)準(zhǔn)卡片對比可知，相關(guān)衍射峰可歸屬為磷銨鈾礦(NH4UO2PO4·3H2O, PDF #33-0085)。這一結(jié)果表明，Enterobacteriasp. X57細(xì)胞中的針狀沉積物極有可能為鈾-磷酸鹽礦物，即除表面絡(luò)合和靜電吸附外，Enterobacteriasp. X57還可通過磷酸鹽礦化富集溶液中的U(Ⅵ)。在微生物誘導(dǎo)鈾礦化的研究中，微生物的磷酸鹽代謝被視為細(xì)胞對鈾的解毒機(jī)制之一[11]，但其具體過程及機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

圖11 Enterobacteria sp. X57的XRD譜Fig.11 XRD pattern of Enterobacteria sp. X57

3 結(jié)論