糖蛋白130在急性肝損傷中負(fù)性調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用及機(jī)制

李霞 李映 何偉 鄧潔 蔣小鈴 姜金蓮 蔣智鋼 程其嬌 劉霞 何毅懷

1遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染科（貴州 遵義 563000）；2遵義醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（貴州 遵義 563099）

糖蛋白-130（glycoprotein 130，gp130）是IL-6（Interleukin-6，IL-6）的重要受體復(fù)合物，兩者相互作用合成多聚體，通過介導(dǎo)下游JAK-STAT、PI3KAKT 和ERK-MAPK 三種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)［1］。gp130 可激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號(hào)通路，在急性期反應(yīng)、肝臟再生、急慢性肝疾病炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等肝病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用［2］。早有研究報(bào)道，特異性基因敲除小鼠肝細(xì)胞gp130 的表達(dá)會(huì)加重急性肝損傷［3］。骨髓細(xì)胞中g(shù)p130 的缺失調(diào)節(jié)IL-6 的釋放，并與更嚴(yán)重的Con A 型肝炎肝損傷有關(guān)［4］。但gp130 對(duì)肝損傷的調(diào)控多涉及調(diào)控炎癥反應(yīng)，在肝損傷中肝細(xì)胞gp130 的表達(dá)變化，及其對(duì)肝損傷的作用不詳。肝細(xì)胞凋亡是肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的共同病理特征之一，故提高肝細(xì)胞抗凋亡反應(yīng)是治療肝病的策略之一。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是一種細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要信號(hào)途徑，各種病因作用于肝臟均會(huì)促發(fā)肝內(nèi)該通路的激活，其本身通過介導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）參與防御反應(yīng)［5］，但持續(xù)或過強(qiáng)的ERS 則誘導(dǎo)凋亡，啟動(dòng)損傷性反應(yīng)［6］。

為探討gp130 在急性肝損傷中表達(dá)的變化及其對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制，故在本實(shí)驗(yàn)中，通過四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘導(dǎo)急性肝損傷模型小鼠，觀察肝內(nèi)gp130 的表達(dá)情況，其次，通過4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，PBA）干預(yù)小鼠，觀察肝內(nèi)gp130 表達(dá)及肝細(xì)胞凋亡情況，最后通過重組8 型腺相關(guān)病毒攜帶的gp130 shRNA 敲減模型小鼠肝內(nèi)gp130 表達(dá)，探討其對(duì)肝損傷、ERS 及肝細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物144只均來源于遵義醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心BALB/c雄性小鼠［6～8周齡，（25±3）g］，在溫度波動(dòng)于20～24 ℃且沒有病原體的環(huán)境中飼養(yǎng)，自動(dòng)12 h 光/暗循環(huán)。該實(shí)驗(yàn)方案通過遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物護(hù)理使用委員會(huì)修訂并批準(zhǔn)（ZMC-LS［2018］28 號(hào)）。

1.2 急性肝損傷小鼠誘導(dǎo)、PBA抑制ERS及gp130病毒敲減小鼠適應(yīng)1 周后，采用隨機(jī)數(shù)表法將小鼠隨機(jī)分組：（1）建立急性肝損傷模型小鼠，48 只小鼠分為：未治療組（正常對(duì)照組；n=12）、溶劑對(duì)照組（橄欖油；n=12）、24 h CCl4組（n=12）、48 h CCl4組（n=12）；（2）用PBA 干預(yù)模型小鼠抑制ERS，48 只小鼠分為：對(duì)照組（PBS + 橄欖油；n=12）、PBA組（PBA+橄欖油；n=12）、PBA+CCl4組（n=12）、CCl4組（PBS+CCl4；n=12）；（3）敲減模型小鼠肝內(nèi)gp130蛋白表達(dá)，48只小鼠分為：對(duì)照組（control shRNA + 橄欖油；n=12）、gp130 shRNA 組（gp130 shRNA + 橄欖油；n=12）、gp130 shRNA +CCl4組（n=12）、CCl4組（control shRNA + CCl4；n=12）。模型組：CCl4與橄欖油按體積比為1∶4 的比例混合，5 mL/kg；對(duì)照組：橄欖油，5 mL/kg。均腹腔注射，給藥1 次，注射前禁飲禁食6 h；前期研究發(fā)現(xiàn)在CCl4給藥后24 h 肝內(nèi)ERS 最明顯，故選擇以24 h 和48 h 為模型組觀察點(diǎn)。PBA 溶于PBS，150 mg/kg，腹腔注射預(yù)干預(yù)2 h，后予CCl4誘導(dǎo)24 h。通過小鼠尾靜脈注射劑量1×1010病毒基因拷貝在100 μL 磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）的重組腺相關(guān)病毒血清型8（rAVV8），分別表達(dá)gp130 shRNA（5′-GCTACATGCCCACCTATTATGCGAACATAATAGGTGGGCATGTAGC-3′；靶點(diǎn)序列：5′-GCTACATGCCCACCTATTATG-3′）或?qū)φ誷hRNA（5′-CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCCGAAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG-3′）。48 h 后，追加注射相同劑量1 次。在gp130 shRNA + CCl4組中，在AVV 轉(zhuǎn)導(dǎo)后6 周開始CCl4建模，36 h 后收集樣品。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)階段結(jié)束時(shí)，通過在4 L 安樂死盒中吸入CO2處死小鼠。小鼠失去知覺后，在維持血液循環(huán)的同時(shí)收集組織和血液樣本。

1.3 Western blot 實(shí)驗(yàn)取50 mg 肝組織加入含50 μL PMSF 的裂解緩沖液5 mL（10 mg/mL）中，4 ℃下進(jìn)行勻漿后使用細(xì)胞超聲破碎儀進(jìn)一步破碎。然后取1 mL 高速離心（12 000 r/min，15 min），抽取800 μL 上清液與200 μL 的蛋白上樣緩沖液混合，在100 ℃的沸水中煮5～10 min，待其冷卻后每個(gè)孔道20 μL將蛋白加入到8%～12%SDS-PAGE 凝膠上進(jìn)行電泳分離蛋白，然后切膠至聚偏氟乙烯膜上進(jìn)行電轉(zhuǎn)。將膜放于含3%～5%脫脂奶粉的TBST 液中并于搖床上封閉至少2 h，然后用TBST洗膜2 次，每次5 min。在4 ℃下，將膜分別用鼠單克隆針對(duì)GAPDH、gp130 和STAT3 的一抗，以及兔單克隆針對(duì)剪切型Caspase-12、Cleaved caspase-3和磷酸化STAT3（p-STAT3）的一抗，孵育24 h 后用TBST 洗5 次，每次10 min。分別用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗小鼠、抗兔IgG 二抗對(duì)相應(yīng)的蛋白孵育過夜，再用TBST 洗5 次，每次10 min。最后使用Image J 軟件進(jìn)行蛋白定量。

1.4 組織病理和免疫組化分析按照壞死面積百分比（%）=壞死組織面積/總組織面積×100 的標(biāo)準(zhǔn)方法，采用5 μm 厚肝切片進(jìn)行蘇木素-伊紅（H&E）染色?；蛘邔⑶衅每筭p130 抗體（sc-376280，1∶100；美國圣克魯斯）進(jìn)行免疫染色，并用DAB 試劑（PV-9002，ZSBIO，中國）檢測陽性染色。使用Image-Pro Plus 6.0 軟件（美國Media Cybernetics Corporation）對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)與分析。

1.5 肝功能檢測通過全自動(dòng)生化分析儀，運(yùn)用速率法檢測血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）水平，運(yùn)用重氮方法檢測血清總膽紅素（total bilirubin，TBil）濃度。

1.6 TUNEL 法測細(xì)胞凋亡脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛與脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）按一定比例組成的混合物，滴到經(jīng)過脫蠟、脫水、去除組織蛋白、破膜后肝組織切片上，37 ℃及一定濕度環(huán)境下孵育2 h。最后于顯微鏡下采集圖像。正常細(xì)胞核紫外線下呈藍(lán)色，陽性凋亡細(xì)胞核則呈綠色。高倍鏡下每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野觀察，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%則為細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。首先進(jìn)行各組數(shù)據(jù)正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，本實(shí)驗(yàn)各組定量資料均滿足正態(tài)分布，各部分組間的比較應(yīng)為單因素方差分析，兩組之間的比較采用LSD 法，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷24 h 和48 h CCl4的誘導(dǎo)模型組，與未治療組及溶劑對(duì)照組小鼠的血清ALT、TBil 水平和肝組織壞死面積比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1），進(jìn)一步采用LSD 法行事后比較，未治療組與溶劑對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1），24 h CCl4的誘導(dǎo)模型的ALT 水平和肝組織壞死面積高于48 h CCl4的誘導(dǎo)模型組，而TBil 水平低于48 h CCl4的誘導(dǎo)模型組，模型組各指標(biāo)均高于對(duì)照組，（P＜0.05，表1），模型組肝細(xì)胞水腫及壞死明顯（圖1），由此說明CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷模型造模成功；隨后檢測肝內(nèi)gp130蛋白表達(dá)上調(diào)，且于48 h顯著升高；小鼠肝內(nèi)凋亡標(biāo)志蛋白Caspase-12 及Cleaved caspase-3的蛋白水平均顯著升高，并于24 h表達(dá)量最高（P＜0.05，圖2）；此外，免疫組化染色證實(shí)肝內(nèi)gp130 蛋白表達(dá)在肝損傷區(qū)域顯著上調(diào)（圖3）。

表1 CCl4時(shí)間依賴性對(duì)小鼠肝功能及肝組織壞死面積的影響Tab.1 Time-dependent effects of CCl4 on liver function and necrotic area of liver tissue in mice±s

表1 CCl4時(shí)間依賴性對(duì)小鼠肝功能及肝組織壞死面積的影響Tab.1 Time-dependent effects of CCl4 on liver function and necrotic area of liver tissue in mice±s

注：a 與未治療組相比，a1（P＞0.05），a2（P＜0.05）；b 與溶劑對(duì)照組相比，P＜0.05；c 與24 h CCl4組比較，P＜0.05

組別例數(shù)ALT（U/L）TBil（μmol/L）壞死面積（%）未治療組12 44.29±5.35 1.18±0.12 0.73±0.06溶劑對(duì)照組12 43.94±5.18a1 1.24±0.14a1 0.94±0.08a1 24 h CCl4組12 5 932.58±648.38a2.b 5.74±0.45a2.b 41.48±4.61a2.b 48 h CCl4組12 5 294.69±547.68a2.b.c 6.42±0.56a2.b.c 36.37±3.19a2.b.c F 值P 值698.940 629.903 681.718＜0.001＜0.001＜0.001

圖1 不同處理組肝組織病理學(xué)變化（H&E 染色，20×）Fig.1 Histopathological changes of liver in different treatment groups(H&E staining,20×)

圖2 Western blot 法檢測不同組gp130、Caspase-12、Cleaved caspase-3 表達(dá)情況Fig.2 Western blot method to detect the expression of gp130，Caspase-12 and Cleaved caspase-3 in different groups

圖3 CCl4誘導(dǎo)48 h 小鼠的肝組織病理學(xué)改變及相應(yīng)肝內(nèi)gp130 表達(dá)情況（免疫組化）Fig.3 Histopathological changes in the liver of mice induced by CCl4 for 48 h and the corresponding expression of gp130 in the liver（immunohistochemistry）

2.2 PBA 抑制CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞反應(yīng)經(jīng)單因素方差分析示各組間血清ALT、TBil 水平和肝組織壞死面積不全相同（P＜0.05，表2）；與溶劑對(duì)照組相比，單獨(dú)PBA 預(yù)處理沒有影響小鼠的血清ALT、TBil 水平及壞死面積（P＞0.05，表2），但PBA 干預(yù)2 h 顯著降低CCl4誘導(dǎo)模型小鼠的血清ALT、TBil水平和肝組織壞死面積（P＜0.05，表2），且肝細(xì)胞水腫及壞死減輕（圖4）。同時(shí)，PBA 降低CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝內(nèi)Caspase-12、Cleaved caspase-3 及gp130 蛋白表達(dá)（P＜0.05，圖5）。

圖4 PBA 對(duì)模型小鼠肝組織病理的影響（H&E 染色，20×）Fig.4 The effect of PBA on the pathology of liver tissue in model mice（H&E staining，20×）

圖5 Western blot 法檢測PBA 對(duì)模型小鼠肝內(nèi)gp130、Caspase-12、Cleaved caspase-3 表達(dá)的影響Fig.5 The effect of PBA on the expressions of gp130，Caspase-12 and Cleaved caspase-3 in the liver of model mice detected by Western blot

表2 PBA 對(duì)模型小鼠肝損傷的影響Tab.2 Effects of PBA on liver injury in model mice

2.3 gp130對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的影響WB法驗(yàn)證gp130 shRNA 下調(diào)模型小鼠肝內(nèi)gp130表達(dá)（圖6）。各實(shí)驗(yàn)組小鼠的血清ALT、TBil 水平、肝組織壞死面積、凋亡指數(shù)經(jīng)單因素方差分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3）；gp130 shRNA+CCl4組小鼠的血清ALT、TBil 水平、肝組織壞死面積、凋亡指數(shù)均高于CCl4組（P＜0.05，表3）。在gp130 shRNA+CCl4組殘存的肝細(xì)胞較CCl4組顯示出更明顯的肝細(xì)胞水腫，H&E 染色也證明gp130下調(diào)增加了CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷（圖7）。此外，gp130下調(diào)降低了CCl4誘導(dǎo)的p-STAT3蛋白的表達(dá)，證實(shí)gp130 shRNA 成功敲減gp130 表達(dá)。同時(shí)肝內(nèi)Caspase-12 和Cleaved caspase-3 蛋白水平增加，說明肝細(xì)胞凋亡加重（圖8）。免疫熒光法提示gp130 下調(diào)加重了肝細(xì)胞凋亡（圖9）。

圖6 Western blot 法檢測gp130 shRNA 組gp130 表達(dá)情況Fig.6 Detection of gp130 expression in gp130 shRNA group by Western blot

圖7 不同處理組肝組織病理學(xué)變化（H&E 染色，20×）Fig.7 Histopathological changes of liver in different treatment groups（H&E staining，20×）

圖8 Western blot 法檢測不同組gp130、Caspase-12、Cleaved caspase-3、STAT3、p-STAT3 表達(dá)情況Fig.8 Western blot method to detect the expression of gp130，Caspase-12，Cleaved caspase-3，STAT3，p-STAT3 in different groups

圖9 不同處理組肝內(nèi)細(xì)胞凋亡表達(dá)情況（免疫熒光染色40×）Fig.9 Expression of intrahepatic apoptosis in different treatment groups（immunofluorescence staining 40×）

表3 gp130 shRNA 對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的影響Tab.3 Effects of gp130 shRNA on CCl4-induced liver injury in mice±s

表3 gp130 shRNA 對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的影響Tab.3 Effects of gp130 shRNA on CCl4-induced liver injury in mice±s

注：a 與對(duì)照組相比，a1（P＞0.05），a2（P＜0.05）；b 與gp130 shRNA 組相比，P＜0.05；c 與gp130 shRNA+CCl4組比較，P＜0.05

分組例數(shù)ALT（U/L）TBil（μmol/L）壞死面積（%）凋亡指數(shù)（%）對(duì)照組12 46.83±5.93 1.32±0.15 0.96±0.8 0.98±0.09 gp130 shRNA 組12 59.82±7.72a1 1.96±0.28a2 2.76±0.33a1 1.43±0.13a1 gp130 shRNA+CCl4組12 6849.75±743.41a2.b 6.49±0.63a2.b 48.6±4.76a2.b 25.42±1.98a2.b CCl4組12 5586.74±632.84a2.b.c 4.84±0.52a2.b.c 40.92±3.18a2.b.c 21.74±1.35a2.b.c F 值P 值596.777 338.839 839.833 1 288.708＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

3 討論

本研究通過小鼠模型研究探討了肝細(xì)胞gp130-ERS-細(xì)胞凋亡調(diào)控軸在急性肝損傷中的調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果顯示在CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷模型小鼠肝內(nèi)細(xì)胞凋亡增加，ERS 激活及gp130表達(dá)上調(diào)，且gp130 的上調(diào)主要發(fā)生于損傷的肝細(xì)胞中。PBA抑制模型小鼠ERS，肝內(nèi)gp130 表達(dá)下調(diào)，肝細(xì)胞凋亡減輕。通過gp130 shRNA 下調(diào)CCl4誘導(dǎo)的模型小鼠肝內(nèi)gp130 表達(dá)，結(jié)果顯示不僅肝損傷加重，并且ERS 及肝細(xì)胞凋亡加劇。ERS 與IL-6/gp130/STAT3 信號(hào)通路均參與肝臟急性期反應(yīng)，兩者間相互調(diào)控影響肝病預(yù)后。綜上結(jié)果，在急性肝損傷中ERS 觸發(fā)肝細(xì)胞gp130 表達(dá)增加；gp130 的上調(diào)可提高肝細(xì)胞抗凋亡能力緩解肝損傷，本實(shí)驗(yàn)提示其機(jī)制可能與負(fù)性調(diào)控ERS 有關(guān)。

gp130 不僅在多種腫瘤性疾病中上調(diào)，在非腫瘤性肝病中同樣也表現(xiàn)出上調(diào)［7］。先前的研究表明，gp130 的表達(dá)受到多個(gè)環(huán)節(jié)及水平的調(diào)控。gp130 可以識(shí)別微環(huán)境中的細(xì)胞因子并允許信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的傳遞，隨之自身內(nèi)吞抑制持續(xù)激活［8］。繼細(xì)胞因子-膜表面受體相互作用后，gp130 可以被下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子直接激活，從而增強(qiáng)gp130的轉(zhuǎn)錄［9］。此外，gp130 的磷酸化、泛素化和各種轉(zhuǎn)錄后修飾也可以調(diào)節(jié)gp130 蛋白膜的穩(wěn)定性，從而通過溶酶體或蛋白酶體途徑降解gp130［10-11］。gp130 的活性決定后續(xù)gp30/STAT3 信號(hào)途徑介導(dǎo)的生物學(xué)功能。gp130 被認(rèn)為是維持肝細(xì)胞完整性和控制肝臟再生的基本細(xì)胞因子，多項(xiàng)研究已證實(shí)IL-6/gp130/STAT3 信號(hào)軸可在肝損傷中觸發(fā)肝臟保護(hù)性作用。肝臟受損時(shí)激活急性期反應(yīng)、ERS 等反應(yīng)保護(hù)受損肝細(xì)胞，以維持肝臟正常結(jié)構(gòu)及功能［12］。本研究結(jié)果示，CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷模型小鼠發(fā)生顯著ERS，且肝內(nèi)gp130 表達(dá)升高，結(jié)合前期研究發(fā)現(xiàn)［13］，ERS 可通過激活核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）上調(diào)多耐藥蛋白2（Multidrug-resistance protein 2，MRP2）緩解肝損傷，gp130 與MRP2 均屬于膜蛋白，故推測肝內(nèi)gp130 上調(diào)可能受ERS 調(diào)控。為驗(yàn)證肝內(nèi)gp130表達(dá)上調(diào)的機(jī)制，進(jìn)一步行PBA 抑制ERS，結(jié)果示肝內(nèi)gp130 表達(dá)減少，表明ERS 可增加肝損傷時(shí)肝內(nèi)gp130 的表達(dá)，其次肝細(xì)胞凋亡減輕，說明急性肝損傷時(shí)發(fā)生的肝細(xì)胞凋亡ERS 參與了介導(dǎo)。免疫組化顯示gp130 主要在損傷的肝細(xì)胞區(qū)域表達(dá)上調(diào)，提示急性肝損傷后肝細(xì)胞上調(diào)gp130 表達(dá)，可能直接影響肝細(xì)胞抗損傷能力，故本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步行模型小鼠肝內(nèi)gp130 敲減實(shí)驗(yàn)探討gp130 表達(dá)上調(diào)的意義及作用機(jī)制。

gp130/STAT3 信號(hào)通路在多種肝臟疾病的發(fā)病中發(fā)揮不同的作用機(jī)制。肝細(xì)胞特異性基因敲除小鼠gp130 表達(dá)的缺乏促進(jìn)了急性肝損傷［3］。IL-6/gp130信號(hào)通過穩(wěn)定Mcl-1和阻止p53激活來防止DNA 損傷時(shí)的肝細(xì)胞凋亡［14］。靶向IL-6/gp130信號(hào)通路的抑制劑可能對(duì)治療肝癌有益［15］。此外，在沒有NF-κB 激活的情況下，僅肝細(xì)胞特異性gp130 激活就足以觸發(fā)強(qiáng)大的先天免疫應(yīng)答保護(hù)肝細(xì)胞［16］。相反，在免疫性肝炎這樣的情況下，IL-6/gp130信號(hào)傳導(dǎo)可加重肝臟損害［17］。由此說明不同病因的肝損傷存在復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，不同細(xì)胞膜上gp130 的表達(dá)譜可能存在差異。STAT3 是gp130/JAK 的下游信號(hào)之一，它可以通過與TNF-α，RIP1、RIP3 和NF-κB 的相互調(diào)節(jié)來影響凋亡。p-STAT3 是IL-6 信號(hào)通路激活的重要標(biāo)志，IL-6 可以通過維持多種抗凋亡因子的表達(dá)來減少肝細(xì)胞的凋亡，其次p-STAT3 是肝臟受損傷后急性期反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，可進(jìn)一步參與促進(jìn)肝細(xì)胞再生［18］。早有研究已發(fā)現(xiàn)IL-6 通過gp130/STAT3 在肝細(xì)胞中觸發(fā)關(guān)鍵的下游事件，從而保護(hù)肝損傷，缺乏STAT3 激活的肝臟細(xì)胞中觀察到更多的凋亡［19］。gp130/STAT3 信號(hào)通路不僅在急性肝損傷中通過誘導(dǎo)急性期反應(yīng)，參與肝損傷修復(fù)，同時(shí)可增加ERS 介導(dǎo)的防御反應(yīng)，提高肝細(xì)胞抗損傷的能力。在本研究中，gp130 shRNA 引起的模型小鼠肝內(nèi)gp130 下調(diào)，并顯著降低了CCl4誘導(dǎo)的STAT3 磷酸化，提示gp130 shRNA 成功敲減肝內(nèi)gp130 表達(dá)。gp130 的敲減引起CCl4誘導(dǎo)的小鼠血清ALT、TBil 水平、壞死面積增加，說明gp130 的敲減加重肝損傷，由此證實(shí)在急性肝損傷中肝細(xì)胞gp130 的上調(diào)有利于減輕肝細(xì)胞損傷。

細(xì)胞凋亡是肝細(xì)胞受到損傷刺激的基本機(jī)制之一，主要由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）與非caspase途徑介導(dǎo)［20］。Caspase-3 是細(xì)胞發(fā)生凋亡過程中標(biāo)志性的末端剪切酶，活化的Caspase-3 能夠通過酶化多聚ADP-核糖聚合酶使蛋白質(zhì)中與DNA 結(jié)合的鋅酯的結(jié)構(gòu)被分離，最終導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)變化從而進(jìn)展為細(xì)胞凋亡［21］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在肝細(xì)胞中的含量豐富，許多肝臟疾病與ERS 有關(guān)。ERS 被認(rèn)為是除線粒體及死亡受體途徑外，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一種獨(dú)立信號(hào)通路，當(dāng)ERS 過度激活時(shí)，將觸發(fā)ASK1-JNK 信號(hào)通路、Caspase-12 和CHOP 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［22］。盡管目前多項(xiàng)研究提示IL-6/gp130/STAT3通路可抗細(xì)胞凋亡及保護(hù)肝損傷，但具體機(jī)制不詳，且研究甚少。在本研究中，敲減gp130的模型小鼠與急性肝損傷小鼠相比較：Caspase-12、Cleaved caspase-3 表達(dá)上調(diào)均更明顯，免疫熒光結(jié)果提示凋亡指數(shù)更高，且兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明缺乏gp130 的小鼠ERS 顯著，且更易發(fā)生肝細(xì)胞凋亡，更可能導(dǎo)致各類肝病的病情進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn)［23］，p-STAT3 可以通過增加抗凋亡蛋白的表達(dá)來提高細(xì)胞的存活率，p-STAT3 抑制通過降低ATF6α 和p-IRE1α 的表達(dá)破壞UPR 的促生存功能。此外，p-STAT3 抑制通過促進(jìn)CHOP、p-JNK 和procaspase-12 的表達(dá)激活ESD。由此說明上調(diào)肝內(nèi)gp130 可能通過參與調(diào)控ERS 介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡緩解了肝損傷，其機(jī)制與下游分子STAT3 負(fù)反饋?zhàn)饔糜贓RS 有關(guān)。因此，此項(xiàng)研究說明ERS 過度應(yīng)激時(shí)也在通過負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制維持自身的保護(hù)機(jī)制，gp130 與STAT3 可能是未來調(diào)控ERS 穩(wěn)態(tài)的潛在治療靶點(diǎn)。

在急性肝損傷中ERS 上調(diào)肝細(xì)胞gp130 表達(dá)。gp130 的上調(diào)可能通過STAT3 信號(hào)負(fù)反饋調(diào)控ERS 介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡減輕肝損傷。