濃香型白酒正丁醇生成規(guī)律及代謝途徑的研究

孔小勇，曹永楠

（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷 223800）

正丁醇是濃香型白酒重要的芳香組分和呈味物質(zhì)，對(duì)窖香濃郁、綿厚味長(zhǎng)的風(fēng)格形成和舒適的飲用體驗(yàn)起到重要作用。濃香型白酒中正丁醇含量在5～50 mg/100 mL，高于其他香型白酒，適量的正丁醇可提高白酒的濃厚感并增加協(xié)調(diào)性，但含量過(guò)高會(huì)帶來(lái)味苦微澀、醉酒上頭等不良飲用體驗(yàn)。

當(dāng)前研究表明，正丁醇的生成與梭菌的物質(zhì)代謝有關(guān)。窖池作為濃香型白酒的發(fā)酵容器，棲息著種類豐富、數(shù)量眾多的梭菌，是各類微生物進(jìn)行一系列生化反應(yīng)的重要場(chǎng)所。窖泥中某些梭菌屬微生物利用含淀粉、纖維素或糖類物質(zhì)的谷物原料作為主要碳源和能量來(lái)源，代謝生成正丁醇。本研究通過(guò)采集窖內(nèi)不同位置、發(fā)酵時(shí)間節(jié)點(diǎn)的酒醅，分析濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程正丁醇的生成規(guī)律；篩選產(chǎn)正丁醇含量差異顯著的窖泥進(jìn)行微生物分離，分析產(chǎn)正丁醇的主要微生物的種類及能力；跟蹤比較不同生產(chǎn)排次、釀酒車間的生產(chǎn)情況，梳理出影響正丁醇生成的主要工藝因素，為調(diào)控酒中正丁醇含量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

窖泥和酒醅：取自洋河酒廠各釀酒車間，窖泥和出入窖酒醅置于-80 ℃凍存，大曲室溫保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

胰蛋白胨生理鹽水溶液：胰蛋白胨1 %，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%，121 ℃滅菌15 min。

RCM 培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉浸粉1%，氯化鈉0.5 %，葡萄糖0.5 %，酵母浸粉0.3 %，可溶性淀粉0.1 %，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.05 %，121 ℃滅菌15 min。

P2發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖6%，酵母粉0.3%，碳酸鈣0.3%，磷酸二氫鉀0.1%，七水硫酸鎂0.002%，七水硫酸亞鐵0.001 %，氯化鈉0.001 %，對(duì)氨基甲苯0.0001 %，維生素B1 0.0001 %，生物素0.0001 %，121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 試劑

正丁醇標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.1.4 儀器設(shè)備

酒醅取樣器，自制；氣相色譜儀，日本島津公司；高效液相色譜(1200)，美國(guó)Agilent 公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海書俊儀器設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；超低溫冰箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；低溫冷凍離心機(jī)，鹽城市安信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；超純水制備儀，美國(guó)賽默Thermo 公司；漩渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司；pH計(jì)，上海儀邁儀器科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酒醅中正丁醇的測(cè)定

（1）提取條件：50 g 酒醅，17 %vol 乙醇溶劑體積150 mL，餾分體積15 mL。

（2）檢測(cè)條件：載氣N，流速1 mL/min，進(jìn)樣口溫度270 ℃，進(jìn)樣量1 μL，分流比50∶1，cpwax57CB 型（cp-97723A）毛細(xì)管色譜柱，50 m*0.25 mm*0.25 μm；程序升溫，35 ℃保持6 min，6 ℃/min 升溫至60 ℃，保留3 min，再以4.5 ℃/min升溫至80 ℃，保留2 min，9.5 ℃/min升溫至180 ℃，保留2 min，9.5 ℃/min 升溫至210 ℃，保留10 min；FID檢測(cè)器，300 ℃，H30 mL/min，空氣300 mL/min。

1.2.2 產(chǎn)正丁醇微生物的分離純化與鑒定

（1）分離：稱取10 g 窖泥與100 mL TPS 緩沖液混合，80 ℃處理10 min 以殺死非芽孢狀態(tài)的菌體及其他營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，室溫放置20 min 富集菌體，再置于80 ℃處理10 min，待冷卻至30～40 ℃時(shí)，以10 %的接種量轉(zhuǎn)移至乙酸鈉液體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧富集培養(yǎng)7 d。取1 mL 菌液稀釋涂布于RCM 固體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)2～5 d。觀察培養(yǎng)皿中微生物生長(zhǎng)情況，挑取不同形態(tài)的菌落劃線分離3次及以上，得到菌株的純培養(yǎng)物。

（2）鑒定：使用DNA 提取試劑盒提取分離到的細(xì)菌基因組DNA，對(duì)獲得的總基因組DNA 進(jìn)行16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增，將測(cè)序結(jié)果提交至Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，鑒定種屬。

（3）產(chǎn)正丁醇能力評(píng)價(jià)：挑取單菌落接入RCM液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置厭氧培養(yǎng)24 h，以10%接種量接種至P2 培養(yǎng)基，37 ℃厭氧發(fā)酵3 d，測(cè)定正丁醇含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 濃香型白酒釀造過(guò)程正丁醇的變化規(guī)律

2.1.1 不同生產(chǎn)排次正丁醇變化規(guī)律

通過(guò)對(duì)比濃香生產(chǎn)全周期中4 個(gè)排次原酒正丁醇的變化（圖1），可知頭排酒發(fā)酵周期最長(zhǎng)，達(dá)到150 d，原酒正丁醇含量相對(duì)最高，在超長(zhǎng)期壓窖時(shí)期里，窖內(nèi)進(jìn)入以厭氧細(xì)菌生長(zhǎng)代謝為主導(dǎo)的半固液態(tài)發(fā)酵階段，正丁醇含量不斷累積，為正丁醇的生成提供時(shí)間上的優(yōu)勢(shì)。隨著排次流轉(zhuǎn)，原酒正丁醇逐漸降低，四排酒生產(chǎn)結(jié)束后再進(jìn)入超長(zhǎng)期壓窖，正丁醇升高，循環(huán)往復(fù)，規(guī)律明顯。

圖1 濃香工藝中不同排次原酒中正丁醇含量比較

2.1.2 窖內(nèi)不同醅層正丁醇的分布

在酒醅發(fā)酵結(jié)束、出池環(huán)節(jié)采集窖內(nèi)不同位置酒醅和黃水樣品，窖內(nèi)自上而下依次是回缸醅、小米查醅、大米查醅、雙輪底。正丁醇含量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2，不同位置的酒醅和黃水中正丁醇含量分布差異明顯，黃水中正丁醇含量最高，雙輪底長(zhǎng)期與窖底泥接觸，浸沒(méi)在黃水之中，正丁醇含量?jī)H次于黃水，大米查醅位于窖池中下層，正丁醇含量低于雙輪底，小米查醅位于窖池中上層，正丁醇含量最低，回缸醅位于窖內(nèi)最上層，與封泥直接接觸，回缸醅中正丁醇含量高于大米查、低于雙輪底，介于兩者之間，窖內(nèi)整體呈現(xiàn)“上下高、中間低”的規(guī)律，說(shuō)明與窖泥充分接觸可促進(jìn)正丁醇的生成。

圖2 窖內(nèi)不同位置醅層正丁醇含量差異比較

以入池酒醅作為培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱內(nèi)模擬發(fā)酵，對(duì)比有無(wú)窖泥參與發(fā)酵的情況下酒醅中正丁醇的含量，結(jié)果見(jiàn)圖3，在相同的培養(yǎng)條件下，有窖泥參與的模擬發(fā)酵酒醅中正丁醇含量均高于無(wú)窖泥參與的酒醅樣品，且隨著窖泥接種量的增加，酒醅中正丁醇含量也呈逐漸升高趨勢(shì)。綜上可知，窖泥是濃香型白酒中產(chǎn)正丁醇微生物的重要載體，這為后續(xù)篩選分離產(chǎn)正丁醇微生物的研究指明方向。

圖3 不同窖泥接種量下酒醅中正丁醇含量差異

2.1.3 窖內(nèi)不同發(fā)酵時(shí)期正丁醇的生成規(guī)律

采集窖內(nèi)不同位置、不同發(fā)酵時(shí)間節(jié)點(diǎn)酒醅進(jìn)行正丁醇檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4，大米查、小米查和回缸在入池環(huán)節(jié)正丁醇基本檢測(cè)不到；在入池14～21 d 之后，正丁醇呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)。雙輪底因上一輪未蒸燒而直接入池，故正丁醇在初始階段含量高于其他醅層，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，正丁醇含量逐漸升高?？梢缘弥黪瑢又姓〈己孔兓厔?shì)基本一致，均是隨著發(fā)酵周期的延長(zhǎng)而逐漸升高，這是因?yàn)樵诎l(fā)酵的前14 d中，主要是大曲微生物（如芽孢桿菌、酵母、霉菌等好氧或兼性厭氧細(xì)菌）在有氧條件下進(jìn)行淀粉質(zhì)原料的糖化和蛋白質(zhì)的水解，同時(shí)伴隨著氧氣的消耗；發(fā)酵14 d 后窖內(nèi)氧氣基本消耗完畢，窖泥中的厭氧功能微生物逐漸活躍，正丁醇開(kāi)始形成。隨著濃香抽黃水作業(yè)的進(jìn)行，出池醅中正丁醇含量有所下降，黃水對(duì)酒醅中正丁醇有較好的洗脫效果。

圖4 窖內(nèi)酒醅中正丁醇含量隨發(fā)酵周期的變化趨勢(shì)

2.2 正丁醇生成途徑的解析

2.2.1 窖泥中產(chǎn)正丁醇微生物的篩選分離

采用RCM 培養(yǎng)基從窖泥中共分離得到8 株梭菌，通過(guò)16S rRNA 序列比對(duì)鑒定分別為拜氏梭菌（）、楔形梭菌（）、巴布利丁酸梭菌）、腸梭菌（）、丁酸梭菌（）、預(yù)耳蝸梭菌（）、酪丁酸梭菌（）、第三梭菌（），采用P2 培養(yǎng)基考察上述8 株梭菌產(chǎn)正丁醇能力的差異，如表1 所示，其中產(chǎn)丁醇能力最強(qiáng)（1027.7 mg/100 mL），產(chǎn)丁醇能力最弱（14.2 mg/100 mL）。

表1 濃香型白酒窖泥中梭菌的分離與鑒定

2.2.2 窖泥中拜氏梭菌的定量分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證拜氏梭菌（）是濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中正丁醇合成的主要微生物，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)原酒正丁醇含量高中低分類（H、M、L）的3 個(gè)窖池窖泥進(jìn)行的生物量檢測(cè)。結(jié)果顯示，3 份窖泥樣品中的含量存在顯著性差異，不同窖泥中含量與原酒中正丁醇含量規(guī)律一致，即原酒正丁醇含量高的窖池窖泥含量也高，這也進(jìn)一步證實(shí)是參與正丁醇合成的主要微生物。

2.2.3 正丁醇生成途徑解析

根據(jù)高級(jí)醇兩條經(jīng)典代謝途徑——氨基酸分解代謝途徑（Ehrlich 途徑）和糖代謝合成途徑（Harris 途徑），參與正丁醇生成的前體物質(zhì)有糖、有機(jī)酸和氨基酸三大類。設(shè)計(jì)添加試驗(yàn)比較各類前體物質(zhì)的貢獻(xiàn)程度，分別選擇3種糖類葡萄糖、麥芽糖和甘油作為前體碳源，3種有機(jī)酸乙酸、乳酸和丁酸作為前體有機(jī)酸，3種氨基酸谷氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸作為前體氨基酸，選擇RCM 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加相同量的9種前體物質(zhì)，考察各前體物質(zhì)對(duì)正丁醇生成的影響。如圖5所示，各類前體物質(zhì)中對(duì)正丁醇生成量影響由高到低分別是丁酸、葡萄糖、乙酸、麥芽糖、谷氨酸、天冬氨酸、甘油、乳酸、蘇氨酸，其中添加丁酸和葡萄糖顯著高于其他前體，丁酸試驗(yàn)組正丁醇生成量高達(dá)1865 mg/100 mL，較對(duì)照高出3.4 倍，葡萄糖試驗(yàn)組正丁醇生成量1668 mg/100 mL，較對(duì)照高出3 倍。氨基酸的種類對(duì)正丁醇的生成量有較大影響，其中谷氨酸和天冬氨酸對(duì)正丁醇的生成有明顯促進(jìn)作用，添加蘇氨酸生成的丁醇含量與對(duì)照相當(dāng)，可知蘇氨酸不是合成正丁醇的主要底物。綜上，梭菌主要通過(guò)糖代謝合成途徑（Harris 途徑）合成正丁醇，其中葡萄糖和丁酸是影響正丁醇產(chǎn)量的最重要的前體物質(zhì)。

圖5 添加不同前體物質(zhì)對(duì)正丁醇生成的影響

3 結(jié)論與展望

本研究以濃香窖內(nèi)不同位置、不同發(fā)酵時(shí)間節(jié)點(diǎn)的酒醅中正丁醇含量為研究對(duì)象，分析了酒醅中正丁醇的生成和分布規(guī)律，明確了濃香型白酒4 個(gè)生產(chǎn)排次中正丁醇從頭排酒至四排酒逐排下降，循環(huán)往復(fù)，規(guī)律明顯；窖內(nèi)酒醅中正丁醇主要于發(fā)酵中后期14～21 d 之后開(kāi)始快速生成；靠近窖泥的酒醅中正丁醇含量相對(duì)較高，具體表現(xiàn)為黃水＞雙輪底＞回缸＞大米查＞小米查，整體大致呈現(xiàn)“上下高、中間低”的規(guī)律，說(shuō)明與窖泥充分接觸能夠促進(jìn)正丁醇的生成，窖泥是濃香型白酒中產(chǎn)正丁醇微生物的重要載體。

表2 不同窖泥理化指標(biāo)與C.beijerinckii含量

針對(duì)篩自窖泥的拜氏梭菌、巴布利丁酸梭菌和酪丁酸梭菌等8 株梭菌進(jìn)行產(chǎn)正丁醇能力評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，產(chǎn)丁醇能力最強(qiáng)；以熒光定量PCR 法分析不同窖泥中的生物量，進(jìn)一步證實(shí)是濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中正丁醇合成的主要微生物；通過(guò)設(shè)計(jì)添加糖、有機(jī)酸和氨基酸等三類9 種物質(zhì)，得知丁酸和葡萄糖試驗(yàn)組顯著高于其他組，說(shuō)明了糖代謝合成途徑（Harris途徑）是合成正丁醇的主要途徑。

本研究?jī)H對(duì)正丁醇的生成規(guī)律和代謝途徑做了初步研究與驗(yàn)證，尚未涉及產(chǎn)正丁醇梭菌的生長(zhǎng)代謝特性、利用微生物擾動(dòng)調(diào)控正丁醇技術(shù)的研究，這也是后續(xù)工作的重要研究方向。濃香型白酒生產(chǎn)工序繁多、工藝參數(shù)匹配復(fù)雜，難以用絕對(duì)的、統(tǒng)一的工藝參數(shù)去調(diào)控正丁醇的生成，例如生產(chǎn)過(guò)程中入池水分過(guò)大，窖內(nèi)黃水液位升高，窖內(nèi)提前進(jìn)入?yún)捬醐h(huán)境，為具有運(yùn)動(dòng)性的產(chǎn)正丁醇梭菌創(chuàng)造空間和時(shí)間上的優(yōu)勢(shì)。此外雙輪底留取數(shù)量過(guò)多，相當(dāng)于在酒醅入池階段就接種了大量梭菌，進(jìn)而影響到整個(gè)窖內(nèi)正丁醇的含量，雙輪底自身經(jīng)過(guò)多排次發(fā)酵，正丁醇含量會(huì)繼續(xù)升高，若使用不合理，會(huì)將更多的正丁醇富集到原酒中。這需要我們尊重傳統(tǒng)工藝，全面深刻的認(rèn)識(shí)微生物特性及代謝規(guī)律，靈活應(yīng)用到釀酒生產(chǎn)中，科學(xué)制定并嚴(yán)格執(zhí)行工藝參數(shù)，促進(jìn)整個(gè)窖內(nèi)發(fā)酵系統(tǒng)的良性循環(huán)。