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    4種花色苷在Caco-2細胞單層模型的轉(zhuǎn)運吸收規(guī)律

    2022-07-29 09:20:10黨慶玲高瑞昌
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2022年13期
    關鍵詞:電阻值吸收率培養(yǎng)箱

    蘇 麗, 黨慶玲, 高瑞昌

    (1.寧夏賀蘭山東麓葡萄產(chǎn)業(yè)園區(qū)管理委員會,寧夏銀川 753000; 2.江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

    花色苷是自然界中一大類水溶性的植物色素,具有多種對人體有益的健康活性,如改善胰島素抵抗、抗腫瘤、清除體內(nèi)自由基、保護內(nèi)皮細胞等作用。然而,花色苷在體內(nèi)的生物利用度相對較低,其功能特性受到較大限制,因此,闡明花色苷的吸收過程,才能促進其在人體發(fā)揮更大的有益作用。小腸是人體吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要部位,對小腸吸收的研究較多,其中,人結(jié)腸腺癌細胞(Caco-2)最常被使用。Caco-2細胞在體外培育過程中可自發(fā)分化,且在細胞間能緊密地連接成細胞單層,呈微絨毛狀,Caco-2細胞的生化作用與人體小腸極為類似,所以眾多研究人員均將其用作探究小腸吸收的模型。本研究建立Caco-2單層細胞模型,研究Cy-3-G、Dp-3-G、Mv-3-G、Pg-3-G跨膜轉(zhuǎn)運規(guī)律,為評價花色苷的生物利用度提供理論基礎,并為開發(fā)能夠提高不同花色苷生物利用度的轉(zhuǎn)運載體研究提供評價方法和技術支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    Cy-3-G、Dp-3-G、Mv-3-G和Pg-3-G(純度≥90%),購于上海吉至生物化學公司。Caco-2 細胞,購于南京科佰生物科技有限公司。非必需氨基酸、胎牛血清、EDTA-胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、丙酮酸鈉、MEM培養(yǎng)基,購于美國Gibco公司。Hank’s平衡鹽溶液(HBSS),購于美國Hyclone公司。25 cm細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)板(96孔)、細胞培養(yǎng)板(6孔)、1.5 mL凍存管、Transwell板(膜面積4.67 cm),購于美國Corning公司;MTT試劑盒,購于碧云天生物有限公司。乙腈、甲醇、甲酸,色譜級,購于美國Sigma公司;檸檬酸等分析級試劑,購于國藥集團化學試劑上海有限公司。

    HH-A恒溫水浴攪拌器,購于江蘇中大儀器科技有限公司;Millicell ERS-2 細胞電阻儀,購于美國默克密理博公司;CO培養(yǎng)箱,購于美國Thermo公司;Waters2690高效液相色譜儀,購于美國Water公司;0.22 μm過濾器,購于美國Millipore公司;Multiskan MK3 酶標儀,購于芬蘭Thermo Labsystems公司。

    pH值=2.0的檸檬酸溶液:3.84 g/100 mL檸檬酸溶液,微調(diào)pH值至2.0。

    1.2 試驗時間和地點

    本試驗于2019年在江蘇大學食品與生物工程學院實驗室完成。

    1.3 方法

    1.3.1 高效液相色譜條件 根據(jù)Artursson P的方法:色譜柱:C柱,250 mm×4.6 mm×5 μm;流動相:A為1%甲酸水溶液,B為1%甲酸乙腈溶液;檢測波長:525 nm;柱溫:35 ℃;進樣量:20 μL。梯度洗脫程序見表1。

    表1 液相梯度洗脫程序

    1.3.2 標準曲線 稱取1 mg花色苷,采用含10% HCl的甲醇溶液定容至1 mL,配成1 000 μg/mL的儲備液。分別取不同體積上述溶液,采用10% HCl甲醇溶液稀釋,最后得到濃度為10、25、50、75、100和200 μg/mL標準溶液,采用HPLC法,在波長 525 nm 下測定其吸收峰,以濃度和峰面積作標準曲線,橫坐標為濃度,縱坐標為峰面積。

    C-3-G標準曲線:=88 5308-15 423,=09 999;

    Dp-3-G標準曲線:=29 065+41 918,=09 997;

    Pg-3-G標準曲線:=29 038+7 0074,=09 996;

    Mv-3-G標準曲線:=31 425+48 572,=09 994。

    Cy-3-G、Dp-3-G、Pg-3-G、Mv-3-G濃度與峰面積在10~200 μg/mL線性關系較好。

    1.3.3 細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)的方法參考Ying等的方法稍作修改。選擇10~30代Caco-2細胞培養(yǎng)在以MEM為培養(yǎng)基的25 cm培養(yǎng)瓶中,其中,胎牛血清含量為20%、雙抗(青霉素和鏈霉素)含量為1%、非必需氨基酸含量為1%、丙酮酸鈉含量為1%,置于37 ℃,CO含量為5% 培養(yǎng)箱中。每2 d換1次液。當瓶底長滿細胞約80%時,采用 EDTA-胰蛋白酶消化5~10 min,以1 ∶3進行傳代。

    1.3.4 Caco-2細胞單層模型的建立 細胞模型建立方法參考Zhao等的方法,并稍作修改。采用PBS把生長良好且處于對數(shù)期的Caco-2細胞清洗2遍,后加入EDTA-胰蛋白酶1 mL左右消化5~10 min后,再加入MEM培養(yǎng)基3~4 mL以終止消化,并反復吹打確保細胞呈單個狀態(tài)。采用血球計數(shù)板在100倍的倒置顯微鏡下直接計數(shù)。加入一定體積MEM培養(yǎng)基配制細胞懸液,細胞濃度達5×10cells/mL,然后接種至6孔Transwell板上。頂側(cè)(AP)加入細胞懸液1.5 mL,基底側(cè)(BL)加入培養(yǎng)基2.5 mL,第2天換液。隨后1周內(nèi)每隔1 d換1次液,從第2個星期起每天換液,培養(yǎng)約21 d時至細胞分化完全。

    1.3.5 Caco-2細胞的形態(tài)學觀察 采用倒置顯微鏡直接觀察培養(yǎng)瓶中的Caco-2細胞;接種在Transwell培養(yǎng)板上的Caco-2細胞,在培養(yǎng)14~21 d 后,同樣采用倒置顯微鏡觀察。

    1.3.6 Caco-2細胞膜的電阻值測定 電阻值測定參考丁龍的方法并稍作修改。電極在75%乙醇中浸洗15 min,電極晾干后用HBSS清洗。將Tanswell板中AP側(cè)和BL側(cè)的培養(yǎng)基吸去,采用HBSS清洗細胞層1~2遍。隨后向AP側(cè)加入 1.5 mL HBSS,BL側(cè)加入2.5 mL HBSS。電阻值測定時,將電極短端垂直插入培養(yǎng)小室AP側(cè)(不要觸碰到AP側(cè)細胞膜),長端浸入培養(yǎng)小室BL側(cè)。待示數(shù)穩(wěn)定后,記錄電阻值。計算方法如下:

    (Ω·cm)=(-)× 467。

    (1)

    式中:代表 Caco-2模型的跨膜電阻值,單位為Ω·cm;代表試驗組跨膜電阻,單位為Ω;為空白組電阻,單位為Ω;4.67為6孔Transwell板培養(yǎng)小室的膜面積,單位為cm。

    1.3.7 熒光黃通透性 參照祝倩等的試驗方法稍作修改。Caco-2細胞膜培養(yǎng)21 d后使用預加熱至37 ℃的HBSS洗滌3次,然后再放入培養(yǎng)箱中穩(wěn)定30 min。在AP側(cè)加入由HBSS配制的濃度為0.4 mg/mL的熒光黃,在BL側(cè)加入2.5 mL HBSS,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120 min。每0.5 h從BL側(cè)取500 μL作為待測樣品進行后續(xù)測定,并用HBSS補充BL側(cè)取樣室溶液。采用酶標儀來測定熒光黃濃度,在492 nm下進行檢測。

    熒光黃標準曲線繪制參考毛小琴等的方法。按照下列公式測算熒光黃的滲透率以評價模型的通透性:

    (2)

    式中:為表觀滲透系數(shù),cm/s;d/d為單位時間內(nèi)熒光黃的轉(zhuǎn)運量,μg/s;為膜的表面積,cm;為AP側(cè)中熒光黃的初始濃度,mg/mL。

    1.3.8 細胞毒性試驗 參照Lakowicz的方法,稍作修改。將100 μL濃度為4×10細胞/mL Caco-2 細胞懸濁液加入到96孔板中,在CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后除去培養(yǎng)液,然后加入系列濃度的花色苷(50~250 μg/mL,HBSS溶解),再培養(yǎng)24 h。設有空白、陰性和陽性對照試驗組,每組6個復孔。在37 ℃、5% CO條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,然后除去培養(yǎng)液,采用PBS洗滌1遍后,向每孔加入MTT溶液(50 μL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h。采用移液器將孔內(nèi)的培養(yǎng)基小心吸除后加入150 μL二甲亞砜,在搖床上使用低速進行振蕩,充分溶解,15 min后,采用酶標儀測各孔的吸光度(550 nm),細胞的存活率用下列公式進行測算。

    (3)

    式中:為細胞存活率,%;為試驗組吸光度;為空白組吸光度;為陰性對照組吸光度。

    1.3.9 時間對花色苷吸收率的影響 將培養(yǎng)21 d后的Caco-2細胞膜采用預熱的HBSS緩沖液清洗3遍,然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min便于除去膜上的雜質(zhì)。除去上層的HBSS,向AP側(cè)加入 200 μg/L 花色苷1.5 mL,向BL側(cè)加入HBSS緩沖液2.5 mL,在 37 ℃、5% CO條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在30、60、90、120、150、180 min從BL側(cè)吸取0.5 mL液體用于檢測,同時向BL側(cè)加入0.5 mL新的HBSS緩沖液補足體積。樣品中加入pH值為2.0的檸檬酸溶液0.5 mL進行酸化處理,采用HPLC進行定量分析。

    1.3.10 4種花色苷的吸收率比較 當Caco-2細胞在Transwell上分化成完好且緊實的單細胞層時,采用1.5 mL HBSS從AP側(cè)沖洗Transwell板中的各孔室,向BL側(cè)加入HBSS溶液2.5 mL,清洗3遍,然后在37 ℃、5% CO條件下培養(yǎng)箱中孵育 30 min 便于去除膜上的雜質(zhì)。

    4種花色苷濃度為200 μg/mL,從AP側(cè)到BL側(cè)吸收率的測定方法:在AP側(cè)加入1.5 mL花色苷溶液,BL側(cè)加入2.5 mL HBSS,放入CO培養(yǎng)箱中孵育120 min,每0.5 h從BL側(cè)收集0.5 mL的溶液,并用新的等體積HBSS溶液補足,每組設有3個平行。取得的樣品立刻加入pH值為2.0的檸檬酸0.5 mL酸化,然后HPLC測定花色苷的濃度。

    花色苷從BL側(cè)到AP側(cè)吸收率的測定方法:在BL側(cè)加入2.5 mL花色苷溶液,AP側(cè)加1.5 mL的HBSS溶液,放入CO培養(yǎng)箱中孵育120 min,每隔30 min從AP側(cè)收集0.5 mL溶液作為樣品,再補入等體積HBSS,每組設3個平行。隨后立即加入pH值為2.0的檸檬酸0.5 mL進行樣品酸化處理,然后利用HPLC測定花色苷的濃度。

    轉(zhuǎn)運率計算公式如下:

    =(×)/(×)×100%。

    (4)

    式中:是待測樣品吸收率,%;是BL側(cè)溶液中樣品的峰面積;是BL側(cè)樣品的體積;是AP側(cè)原樣品的峰面積;是AP側(cè)樣品的體積。

    1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

    HPLC的數(shù)據(jù)利用Waters 2695自帶軟件處理。所有數(shù)據(jù)處理均利用SPSS16.0進行,每組試驗最少重復3次,結(jié)果呈現(xiàn)為“平均值±標準差”,用檢驗分析比較每組的差異性,<0.05表示差異顯著,<0.01表示差異極顯著。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 Caco-2細胞單層的形態(tài)學觀察

    在倒置顯微鏡下,Caco-2細胞呈現(xiàn)出不規(guī)則形態(tài),形狀扁平,放大40倍可見細胞整齊且均勻排列。放大200倍,可見細胞生長勢好、邊緣清晰、結(jié)構(gòu)均一。生長5 d后,能達到80%以上融合,呈“鋪路石”狀緊密排列的單層結(jié)構(gòu),單個細胞形狀扁平、呈多角形(圖1)。

    2.2 Caco-2細胞單層模型的緊密性與完整性

    從電阻值的大小可判斷出細胞模型的緊實程度與完整程度。Transwell 6孔培養(yǎng)板中Caco-2細胞模型的電阻值在21 d培養(yǎng)時間內(nèi)不斷增大。電阻在前8 d急速增加,這是由于細胞在這期間快速分裂導致,此時細胞也開始出現(xiàn)小腸上皮細胞的特有結(jié)構(gòu)。16 d開始電阻值增長變慢逐漸平穩(wěn),表明此時Caco-2細胞單層膜已基本分化完成,在后續(xù)的培養(yǎng)時間里細胞膜越來越密實(圖2)。

    細胞的來源、傳代的次數(shù)、培養(yǎng)的條件、實驗操作人員和環(huán)境等均會對Caco-2細胞單層膜的電阻值造成影響,通常情況下電阻參考值在200~1 500 Ω·cm間,本研究中細胞模型的TEER值達到1 058 Ω·cm,說明形成的Caco-2細胞單層模型符合后期轉(zhuǎn)運試驗要求。

    2.3 熒光黃通透性

    本研究測定的熒光黃標準曲線為=0073 5+0004 7,=0.9 994。按照公式計算得到在0~120 min Caco-2細胞膜的表觀滲透系數(shù)(值)均在(0.26~0.69)×10cm/s間,符合常規(guī)要求的(0.1~0.7)×10cm/s范圍,說明Caco-2細胞培養(yǎng)21 d后,能夠形成完整緊密連接的單層細胞,進一步驗證了所建立的細胞模型滿足后期轉(zhuǎn)運試驗要求。

    2.4 細胞毒性

    在0~200 μg/mL范圍內(nèi),4種花色苷對Caco-2細胞活性的影響見圖3。在0~200 μg/mL 濃度范圍內(nèi),Mv-3-G無顯著影響(>0.05)。Cy-3-G 濃度為50 μg/mL時,有極顯著的促進作用(<0.01),但隨著濃度的不斷升高,Cy-3-G對細胞無顯著影響(>0.05)。當濃度等于或低于100 μg/mL時,Pg-3-G和Dp-3-G有顯著促進作用(<0.05);當濃度為 200 μg/mL 時,2種花色苷對細胞活性無顯著影響(>0.05)。綜上,在0~200 μg/mL濃度范圍內(nèi),任一濃度都可用于轉(zhuǎn)運試驗。為檢測方便和準確,本研究以200 μg/mL的花色苷進行后續(xù)研究。

    2.5 時間對花色苷吸收率的影響

    由圖4可知,以Cy-3-G為例,在180 min內(nèi)吸收率逐漸增加,趨于線性??紤]到在沒有培養(yǎng)基條件下,細胞活性本身就會隨時間減弱,花色苷在37 ℃下會隨著時間延長而發(fā)生降解。為確保吸收研究的可信度,所以將轉(zhuǎn)運時間定為150 min。

    2.6 4種花色苷的吸收率

    4種花色苷在Caco-2細胞模型中的雙向轉(zhuǎn)運情況見圖5、圖6。由圖5、圖6可知,4種花色苷能以完整的形式被Caco-2細胞迅速吸收。由圖6可知,相同濃度下4種不同苷元結(jié)構(gòu)的花色苷在 Caco-2 細胞層從AP-BL側(cè)的吸收率隨時間延長而增加,吸收率:Mv-3-G>Pg-3-G>Cy-3-G>Dp-3-G。150 min內(nèi)4種花色苷吸收率分別為Mv-3-G(41.01%)、Pg-3-G(38.39%)、Cy-3-G(34.73%)和Dp-3-G(30.93%)。4種花色苷之間吸收差異顯著(<0.05)。由苷元結(jié)構(gòu)分析,羥基數(shù)目越多,花色苷吸收率越低,4種花色苷苷元結(jié)構(gòu)中羥基數(shù)目:Dp(6個)、Cy(5個)、Pg(4個)、Mv(4個)。此外,Dp沒有OCH基團,Mv有2個OCH基團?;ㄉ赵贑aco-2的吸收與它們的分子結(jié)構(gòu)、本身所帶羥基數(shù)量以及分子量等都有較大關系。試驗結(jié)果進一步證明了苷元結(jié)構(gòu),特別是親水和疏水基團,對花色苷的生物利用度有重要影響。

    結(jié)果表明,在150 min內(nèi),200 μg/mL的Dp-3-G、Cy-3-G、Pg-3-G、 Mv-3-G從AP側(cè)到BL側(cè)和從BL側(cè)到AP側(cè)的轉(zhuǎn)運量均隨著時間的延長而呈線性增長。Dp-3-G、Cy-3-G、Pg-3-G和Mv-3-G從BL側(cè)到AP側(cè)的外排率分別7.81%、7.68%、7.58%和6.04%。Dp-3-G與其他3種花色苷的外排率相比有顯著性差異(<0.05),Cy-3-G、Pg-3-G和Mv-3-G之間無明顯差異。

    對于花色苷吸收機制研究認為,花色苷結(jié)構(gòu)中含有葡萄糖,其腸吸收機制可能與葡萄糖吸收相似,可能共用相同的載體。最新分子模擬研究報道葡萄糖在鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運載體(SGLT1)結(jié)構(gòu)中由羥基與N78、H83、E102、K321、Q457、Y290和W291配位,并通過疏水殘基(L84、F98和F453)和內(nèi)部溶液(部分由Y290)接觸。根據(jù)分子模擬發(fā)現(xiàn),葡萄糖與人源葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(GLUT1)蛋白分子結(jié)合,結(jié)合能Δ為-6.6 kcal/mol。但花色苷與GLUT1的結(jié)合能低于葡萄糖與GLUT1的結(jié)合能,可能與花色苷B環(huán)上的疏水/親水基團或花色苷的空間位阻有關。Cy-3-G和Dp-3-G分子與SGLT1受體的相互作用比Mv-3-G更強,其原因可能是前2個花色苷中存在大量的羥基,可以與受體周質(zhì)側(cè)的氨基酸產(chǎn)生氫鍵相互作用。半縮酮形式的對接溶液都能通過葡萄糖或B環(huán)結(jié)合到GLUT1的周質(zhì)側(cè),表明這2個單元在花色苷的入口中均起關鍵作用。氫鍵發(fā)生在花色苷的羥基和glu380、asn317、asn411、asn415、tyr292和thr30殘基的側(cè)鏈之間。已經(jīng)證實了花色苷環(huán)與人腸細胞的GLUT1蛋白(phe379、trp412、trp388、phe72、phe291、his160)周質(zhì)側(cè)的大量芳香殘基之間存在許多疏水作用(-相互作用的疊加效應)。所有這些相互作用強烈地促進了花色苷和人腸細胞的GLUT1之間形成的復合物的高穩(wěn)定性。glu380可通過最短的氫鍵與所有花色苷相互作用,并且在分子對接模擬期間具有很高的占用時間,表明這種殘基在花色苷轉(zhuǎn)運中起著關鍵作用。

    2.7 花色苷的表觀滲透系數(shù)

    Caco-2細胞模型值越大,其通透率越高。若藥物可以完全吸收,則它的滲透系數(shù)比較大(>1×10cm/s),如若吸收不完全則滲透系數(shù)較低(<1×10cm/s)。

    由表2可知,4種花色苷從AP側(cè)到BL側(cè)的吸收滲透系數(shù)(PAB)均較小,其中,Mv-3-G(8.784×10cm/s)>Pg-3-G(8.221×10cm/s)>Cy-3-G(7.436×10cm/s)>Dp-3-G(6.621×10cm/s),表明B環(huán)上2個甲氧基的花色苷(Mv-3-G)吸收要大于B環(huán)上2個H的花色苷(Pg-3-G),且大于B環(huán)上含羥基的花色苷(Cy-3-G、Dp-3-G)。結(jié)構(gòu)上的差異可能會導致花色苷與轉(zhuǎn)運載體間的相互作用發(fā)生變化,導致其轉(zhuǎn)運途徑和速率產(chǎn)生差異。4種花色苷從BL側(cè)到AP側(cè)的滲透系數(shù)即分泌滲透系數(shù)(PBA)大于吸收滲透系數(shù),外排比(PBA/PAB)依次為Mv-3-G(0.682)、Pg-3-G(0.914)、Cy-3-G(1.024)和 Dp-3-G(1.168)。

    表2 4種花色苷的表觀滲透系數(shù)與外排比率

    (5)

    以上結(jié)果表明,4種花色苷的吸收滲透系數(shù)均不大(<1×10cm/s),說明吸收轉(zhuǎn)運效率較差,這可能是它們生物利用度不高的原因之一。若組分是經(jīng)過小腸頂側(cè)膜內(nèi)的轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運或外排的,則體現(xiàn)為從BL到AP側(cè)的則會顯著高于從AP到BL側(cè)的。本研究表明,4種花色苷的分泌滲透系數(shù)是吸收滲透系數(shù)的1倍左右,因此顯示這4種花色苷在吸收過程中存在腸道轉(zhuǎn)運蛋白的外排現(xiàn)象,這也可能是導致其生物利用度不高的另一個因素。

    根據(jù)PBA/PAB比值與1的大小關系推測出花色苷在小腸吸收中的轉(zhuǎn)運方式。由表2可知,Dp-3-G 和Cy-3-G PBA/PAB均大于1,表明這2種花色苷在Caco-2單層細胞AP側(cè)的轉(zhuǎn)運為主動轉(zhuǎn)運。Pg-3-G和Mv-3-G PBA/PAB小于1,表明二者在Caco-2單層細胞AP側(cè)的轉(zhuǎn)運主要是被動轉(zhuǎn)運。因此,轉(zhuǎn)運方式的不同也可能是導致了其吸收效率存在差異的重要原因。

    3 結(jié)論

    在200 μg/mL濃度下,4種不同苷元結(jié)構(gòu)的花色苷在Caco-2細胞層模型中從AP-BL側(cè)的吸收率隨時間的增加而增加,吸收率表現(xiàn)為 Mv-3-G>Pg-3-G>Cy-3-G>Dp-3-G。4種花色苷的吸收表觀滲透系數(shù)均不高(<1×10cm/s),還存在外排現(xiàn)象,雙向轉(zhuǎn)運均對時間有顯著依賴性,且主動和被動運輸共存。Dp-3-G和Cy-3-G這2種花色苷在Caco-2細胞單層AP側(cè)上轉(zhuǎn)運時主要是主動轉(zhuǎn)運機制,而Pg-3-G和Mv-3-G在Caco-2細胞單層AP側(cè)上轉(zhuǎn)運時主要是被動轉(zhuǎn)運機制?;ㄉ誃環(huán)結(jié)構(gòu)中的甲氧基和羥基的差異可能是導致其轉(zhuǎn)運吸收差異的根本原因,但還需進一步研究。另外對于花色苷的腸細胞轉(zhuǎn)運載體還需進一步深入研究。

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