葡萄柚嫁接愈合過程中砧穗生理物質特性及其與嫁接親和性的關系

朱太富， 王 赟， 蘇效蘭， 李 欣， 王連春

(1.西南林業(yè)大學園林園藝學院，云南昆明 650224； 2.西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點實驗室，云南昆明 650224)

葡萄柚(Macf.)屬于蕓香科柑橘屬，果實像葡萄一樣一簇一簇地垂掛，故稱之為葡萄柚。葡萄柚的果實品質較好，一般用于鮮食，也可以制做果肉罐頭和果汁。嫁接是葡萄柚苗木繁育的關鍵技術，接穗與砧木的親和性和嫁接后的愈合情況對葡萄柚的生長、開花和結果等均有顯著影響。周洲以紅玉葡萄柚和馬敘無核為接穗，嫁接于9種砧木上，研究發(fā)現(xiàn)不同嫁接組合的愈合情況、花期和果實產量出現(xiàn)顯著差異。王偉軍等研究表明，不同砧穗組合在結果早晚、樹形矮化程度等方面均存在差異。嚴毅等認為，關鍵酶的含量對葡萄柚嫁接苗的愈合具有一定的影響。已有研究表明，可溶性蛋白和碳水化合物對于砧穗組合之間連接的早期生長階段非常重要，嫁接后有大量的高爾基體出現(xiàn)在隔離層細胞中，增加的高爾基體會分泌蛋白質和碳水化合物在接穗和砧木間形成初始黏連。前人對葡萄柚的研究主要集中在葡萄柚果實營養(yǎng)和健康功效、嫁接生理酶活性、組織培養(yǎng)、遺傳育種等方面，而對于葡萄柚嫁接愈合形成過程中接穗和砧木的代謝物質含量變化以及酶活性與嫁接親和性的研究較少。因此，本研究以本地酸柚為砧木，火焰、哈路比、瑞路比和星路比為接穗，通過比較不同嫁接組合砧穗中的生理指標差異，以及分析砧穗中的生理指標與嫁接后的成活率所存在的關系，為研究葡萄柚嫁接親和性的早期預測以及砧木與接穗組合的選擇奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地及材料概括

試驗地為西南林業(yè)大學格林溫室旁的露天試驗地(102°45′E，25°03′N)，年平均氣溫為15 ℃，年平均降水量約為1 000.5 mm，年日照時長為 2 327.5 h。以星路比(Star Ruby)、哈路比(Hudson Foster)、瑞路比(Ray Ruby)、火焰(Flame)4個葡萄柚品種母樹樹冠上部四周一年生健壯枝條作為接穗，以營養(yǎng)袋苗本地酸柚()為砧木，不同砧穗組合的情況及簡寫見表1。

表1 不同砧穗組合情況

1.2 試驗方法

試驗開展于2021年3月26日。選取健壯枝條，剪為3～4 cm長，每一段留1～2個飽滿芽。砧木距離基質土壤表面6 cm處平減，采用劈接法，分別將4種接穗嫁接到砧木上。嫁接完成后，搭建高約1.5 m，50%的遮陽網進行遮陰處理。嫁接愈合前，每隔3 d澆1次水，愈合后每隔5 d澆1次水，澆水時避免水濺濕嫁接口。試驗采用3次重復，隨機區(qū)組設計，共4個砧穗組合，每30株作為一個小區(qū)，共5個小區(qū)，其中一個小區(qū)用于嫁接成活率的統(tǒng)計，另一個小區(qū)用于嫁接愈合情況的觀察，其他3個小區(qū)用于采樣，每個組合共嫁接150株。成活率=嫁接后40 d接穗芽萌動的株數(shù)/嫁接株數(shù)×100%。

1.3 樣品采集及測定

為探究嫁接愈合過程中相關物質的變化，故在嫁接后0、2、4、6、14、22、30 d分別取1次樣，其中 0 d 取樣時，接穗為剛從母株上隨機取下3 cm長度除去葉片的枝條，砧木取距離基質土壤表面3～6 cm 長度未經嫁接的砧木。取樣時從每個小區(qū)中取2株嫁接苗，死亡萎蔫的不取樣，用枝剪將距離嫁接口3 cm處的砧木和接穗剪下，刀片刮取砧木和接穗的韌皮部，分別剪碎后，用錫箔紙將剪碎的韌皮部分別包裹，將包裹好的韌皮部放入液氮中冷凍后儲藏于超低溫冰箱中。嫁接后40 d時統(tǒng)計成活狀況，接穗芽萌動則表示嫁接成活。砧木和接穗中的可溶性糖與淀粉含量參照張志良等的蒽酮比色法測定，可溶性蛋白含量參照張志良等的考馬斯亮藍染料結合法測定，過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性參照李合生的方法測定。POD酶活單位U：在波長為470 nm下，1 min 1 g葡萄柚韌皮部組織在反應體系中吸光度變化1所需的酶量；PPO酶活單位U：在波長為 420 nm 下，1 min 1 g葡萄柚韌皮部組織在反應體系中吸光度變化0.01所需的酶量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用Excel 2010軟件進行，用Origin 2021進行作圖，采用SPSS 26.0軟件進行方差分析、多重比較和相關性分析(Duncan’s 新復極差法)。

2 結果與分析

2.1 不同嫁接組合愈合情況的觀察

砧穗的親緣關系越近，嫁接后愈合得越好，因此嫁接后的愈合情況可以作為判斷親和性高低的指標。本試驗參照嚴毅等的方法，嫁接后觀察不同嫁接組合砧穗的愈合情況。由表2可知，最先出現(xiàn)愈傷組織的組合為Z3S3和Z4S4，Z2S2、Z1S1組合的形成時間分別為7、8 d。在14 d 時，Z3S3組合的愈合情況最好，形成的愈傷組織植株數(shù)最多。

表2 不同嫁接組合的愈合情況觀察

2.2 不同嫁接組合的成活率

嫁接植株的成活率反映了接穗和砧木之間的親和性，兩者之間存在正相關關系。嫁接后 40 d，對4個嫁接組合的成活率進行統(tǒng)計。由圖1可知，Z3S3組合的嫁接成活率最高為73.33%，Z2S2組合的嫁接成活率最低為46.67%。從顯著性分析可以得出，Z3S3組合的成活率顯著高于其他的嫁接組合，Z2S2嫁接組合的成活率顯著低于其他的嫁接組合，而Z1S1和Z4S4這2個嫁接組合之間的成活率不存在顯著性差異。

2.3 不同嫁接組合的可溶性糖和淀粉含量

由表3可知，在嫁接愈合過程中，接穗中可溶性糖含量都呈降低—升高—降低的變化趨勢，嫁接后前14 d接穗中可溶性糖含量整體逐漸降低，降低了4.83%～64.65%。與其他幾個接穗相比較，S3的可溶性糖含量最先上升，且上升幅度最大。由表3可知，嫁接后不同嫁接組合砧木中可溶性糖的含量整體呈現(xiàn)升高—降低—升高的趨勢。在嫁接后的前4 d，砧木中可溶性糖含量均呈上升趨勢，Z3的可溶性糖含量上升了8.73%，上升幅度最大，可溶性糖含量上升最低的為Z4，上升了5.41%，可見嫁接初期，不同嫁接組合砧木的可溶性糖含量變化不大。4 d以后，不同嫁接組合的砧木中可溶性糖含量變化情況幾乎一致。由顯著性分析可知，不同的采樣時間同一接穗的可溶性糖含量有部分存在顯著差異，對應砧木的情況與接穗相同。同一采樣時間內，同一個嫁接組合接穗和砧木之間的可溶性糖含量全部都存在極顯著差異。

由表3可知，嫁接后接穗中的淀粉含量均呈現(xiàn)下降—上升的變化趨勢。在所有接穗中，S3的淀粉含量下降幅度最大，下降53.90%。6 d后，Z2砧木的淀粉含量開始上升，其余砧木的淀粉含量在14 d后才開始上升。與其他砧木相比，Z3淀粉含量下降最多，下降46.32%。同一取樣時間同一嫁接組合接穗和砧木的淀粉含量均存在極顯著差異，但各嫁接組合的砧木，只有Z3在所有取樣時間所測得淀粉含量存在顯著差異。

表3 不同嫁接組合的可溶性糖和淀粉含量

2.4 不同嫁接組合的POD和PPO活性

由表4可知，隨著嫁接口的愈合，不同嫁接組合中接穗的POD活性變化為升高-下降趨勢，砧木的POD活性變化趨勢與接穗相同。22 d時，Z3S3組合接穗和砧木的POD活性比Z1S1、Z2S2、Z4S4組合的高，Z3S3組合接穗和砧木中的POD活性分別是嫁接0 d的306.25%、286.45%。從總體來看，Z3S3組合POD活性在不同取樣時間變化最明顯，Z1S1和Z4S4組合次之，Z2S2組合POD活性變化幅度最小。14 d時，用接穗的POD活性剪去砧木的POD活性，所得的差值取絕對值，Z1S1、Z2S2、Z3S3、Z4S4組合的差值分別為0.99、5.64、9.54、8.43 U/g，接穗與砧木間的POD活性存在極顯著差異的嫁接組合為Z2S2、Z4S4。

由表4可知，隨著嫁接口的愈合，4個組合接穗的PPO活性表現(xiàn)為升高-降低的趨勢，砧木的PPO活性表現(xiàn)為降低-升高的趨勢，砧穗的PPO活性變化趨勢不一致。4個組合中，與0 d相比，Z2S2組合接穗的PPO活性升高了41.17 U/g，Z3S3組合接穗的PPO活性僅升高3.74 U/g。整個嫁接愈合過程中，Z3S3組合砧木的PPO活性變化幅度最大，而該組合接穗的變化幅度最小。14 d時，用接穗的PPO活性減去砧木的PPO活性，所得的差值取絕對值，Z1S1、Z2S2、Z3S3、Z4S4組合的差值分別為8.93、16.67、13.7、7.11 U/g，各組合接穗和砧木之間的PPO活性均存在極顯著差異。

表4 不同嫁接組合的POD和PPO活性

2.5 不同嫁接組合的可溶性蛋白含量

由表5可知，0～14 d接穗中可溶性蛋白含量下降10.57%～30.60%，4個組合中，Z3S3組合接穗的可溶性蛋白含量下降最少。14 d時與其他接穗相比，S3的可溶性蛋白含量最先開始出現(xiàn)上升，且可溶性蛋白含量最高。從表5中數(shù)據(jù)可以看出，4個組合所對應砧木的可溶性蛋白含量均整體表現(xiàn)為降低—升高的變化趨勢。此外，同一采樣時間同一組合的接穗和砧木之間可溶性蛋白含量部分存在極顯著差異，Z3S3組合中除2 d外均存在極顯著差異。

表5 不同嫁接組合的可溶性蛋白質量分數(shù)

2.6 不同嫁接組合成活率與其砧穗生理指標的關系

由表6可知，在嫁接愈合過程中，嫁接成活率與砧穗中的可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白含量以及POD和PPO活性存在一定的相關性。嫁接后2 d，嫁接成活率與接穗和砧木可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白含量等指標的相關性不顯著，嫁接后4、22、30 d砧穗的可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白含量均與嫁接成活率無顯著相關性，嫁接后6 d，各組合接穗中的生理指標與嫁接成活率均存在顯著正相關的為可溶性糖和可溶性蛋白含量，與嫁接成活率存在顯著負相關的為淀粉含量。嫁接后6、22、30 d，嫁接成活率與砧穗的POD活性均存在極顯著正相關關系；嫁接后4、6、14、22、30 d，嫁接成活率與砧穗的PPO活性均存在極顯著負相關。

表6 嫁接成活率與砧穗生理指標的相關性分析

3 討論

3.1 嫁接成活率

嫁接作為植物常見的無性繁殖方法之一，被廣泛應用于增強植物抗逆性、良種選育、改善作物農藝性狀等方面的研究。接穗與砧木在分類學上關系越近，嫁接后愈合得越好，成活率越高，楊邵等在研究油茶不同芽苗砧嫁接組合的親和性生理中，也將嫁接成活率和愈傷組織的出現(xiàn)時間作為判斷嫁接親和性的依據(jù)。本研究中，嫁接40 d時Z3S3組合的嫁接成活率為73.33%，顯著高于其他組合，同時，該嫁接組合的愈傷組織最先形成，這些表明Z3S3組合的親和性更高。

3.2 代謝物質

在植物嫁接愈合部位會發(fā)生許多代謝物質含量和酶活性的變化。營養(yǎng)物質是細胞分裂與分化的重要物質基礎和能量來源。本試驗結果表明，嫁接后0～14 d，不同砧穗中的可溶性糖含量整體均呈現(xiàn)降低的變化趨勢，出現(xiàn)這種情況的原因可能是因為嫁接初期，砧穗需要消耗大量的糖維持正常的生理活動，故可溶性糖的含量降低。而14 d以后，嫁接口逐漸愈合完全，砧穗間的物質交換和流通逐步恢復正常，接穗中的可溶性糖含量開始上升，但低于嫁接0 d的含量，而砧木中的可溶性糖含量幾乎維持不變，這與在王瑞等的研究中，可溶性糖的含量變化趨勢相同，也與龔艷箐等對蜜柚嫁接后可溶性糖含量的變化研究結果一致。

淀粉是一種高分子碳水化合物，可在植物中儲存能量，在裂解酶和水解酶作用下淀粉分解為寡糖，為細胞提供能量。本研究發(fā)現(xiàn)，嫁接初期接穗剛脫離母體，需要消耗自身淀粉來維持代謝，這使得接穗中淀粉含量整體呈現(xiàn)下降趨勢。14～22 d，淀粉含量持續(xù)降低，分解補充可溶性糖含量，可溶性糖含量在此階段有所升高，為嫁接口的愈合提供足夠營養(yǎng)。14 d后嫁接口逐漸愈合完全，可溶性糖轉化為淀粉儲存，淀粉含量略微升高。

作為植物組織中的功能性蛋白，可溶性蛋白含量越高，植物體的代謝活動越強。本研究S3中可溶性蛋白含量在6 d后開始升高，而其余接穗中可溶性蛋白含量在14或22 d后才開始上升，可見S3的代謝活動強于其余接穗。接穗中可溶性蛋白含量高，代謝也就越旺盛，營養(yǎng)物質含量也就越高，嫁接口的薄壁細胞分裂迅速，嫁接口愈合得更快。Z3中可溶性蛋白的含量大于其他砧木，可見Z3的生命活動更旺盛，更有利于嫁接成活，曲云峰在大扁杏嫁接研究中也認為可溶性蛋白含量越高，嫁接體愈合越快。

3.3 氧化酶活性

植物抗氧化防御系統(tǒng)中的POD，在砧穗愈合過程中不僅可以清除自由基并抑制膜脂過氧化，同時維管組織的木質化也進一步提高。因此，為了抵御嫁接口產生的過氧化氫等有害物質，在嫁接后的一段時間內，POD活性會增加，后期隨著嫁接口愈合，其活性會逐漸降低。本研究中各嫁接組合接穗和砧木的POD活性均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，這與李娜等的研究結果一致。14 d時，Z3S3組合砧穗的POD活性差異較小。POD活性與嫁接成活率的相關性分析表明，砧穗POD活性越高，嫁接成活率也越高，兩者之間存在正相關關系。在嫁接愈合的初期，PPO主要作用于接穗與砧木間木質素的合成。同時，在嫁接親和性較低的組合中，因PPO將多酚氧化為醌類物質而在嫁接口聚集形成一層膜，從而導致砧穗愈合情況較差。此外，嫁接后PPO過高可引起愈傷組織褐化不利于嫁接成活，通常PPO活性越高的嫁接組合，接穗和砧木親緣關系越遠。本研究表明，嫁接初期各組合接穗的PPO活性變化趨勢相同，砧木的PPO活性變化趨勢也相同，Z3S3組合接穗和砧木的PPO活性比其他組合較低，說明PPO活性越低越有利于嫁接成活，砧穗的PPO活性均與嫁接成活率呈負相關關系。

4 結論

對各嫁接組合嫁接后愈合情況的觀察、愈傷組織出現(xiàn)的時間以及砧穗中內含物質的分析比較可以得出，以本地酸柚為砧木嫁接瑞路比葡萄柚的親和性較高，表現(xiàn)為成活率較高，砧穗中可溶性糖和淀粉含量變化明顯，POD活性較高和PPO活性較低等特點，通過嫁接愈合情況觀察也發(fā)現(xiàn)，以本地酸柚為砧木與瑞路比嫁接后，愈傷組織出現(xiàn)時間較早愈合情況較好?？傊镜厮徼峙c瑞路比葡萄柚的嫁接親和性顯著高于其他嫁接組合，根據(jù)不同采樣時期接穗和砧木中生理指標含量的相關性分析可以得出，葡萄柚嫁接愈合過程中砧穗的營養(yǎng)物質含量變化及POD和PPO活性的高低可以在一定程度上反映出嫁接組合親和性的高低。