抗除草劑水稻耐藥性及后代篩選方法的研究

鄒 拓， 杜 琪， 耿雷躍， 張 薇， 孟令啟， 張啟星

(河北省農(nóng)林科學院濱海農(nóng)業(yè)研究所/唐山市水稻育種重點實驗室，河北唐山 063299)

水稻(L.)是我國乃至世界上最重要的糧食作物之一。水稻的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)對保障世界糧食安全具有重要意義。近年來，隨著我國新型城鎮(zhèn)化和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，水稻生產(chǎn)正在向集約化、規(guī)模化、機械化發(fā)展，機插秧、直播等輕簡栽培已成為發(fā)展趨勢。隨著機種、機收面積的增加，導致田間的雜草和雜草稻更容易繁殖。

在我國，水稻播種面積中雜草稻實際發(fā)生面積約占20%，產(chǎn)量平均損失在10%左右，年損失超過100億元，被稱為“水稻殺手”。其中，江蘇省為重災區(qū)，發(fā)生量大，危害最嚴重，有的田塊甚至顆粒無收；雜草稻發(fā)生面積66.7萬hm，年損失67萬t，造成的直接經(jīng)濟損失在20億元左右。雜草稻已經(jīng)嚴重危及國家糧食安全。

國內(nèi)主要通過深耕、灌水誘發(fā)滅殺、輪作換茬、人工拔除等方法來防治雜草稻。上述方法存在防治措施成本高、效率低且不易實施等問題。利用除草劑治理雜草稻是一條最有效的途徑。但由于雜草稻與栽培稻的生理過程相似，至今還沒有研究出專門針對雜草稻的選擇性除草劑，使雜草稻的防治難于其他雜草。因此，亟需培育抗除草劑水稻，以便大田雜草稻的控制。

抗咪唑啉酮類除草劑水稻種質(zhì)是由于乙酰乳酸合成酶(ALS)發(fā)生堿基變異，導致ALS 蛋白的結(jié)構(gòu)變化，降低對咪唑啉酮類除草劑的敏感性。此類抗除草劑水稻種質(zhì)是從自然變異株以及人工誘變?nèi)后w中篩選出來的，可以在國內(nèi)生產(chǎn)中應用。咪唑啉酮類除草劑能有效防除一年生禾本科雜草、闊葉雜草及雜草稻，適用于水稻田間雜草的防治。

目前抗咪唑啉酮類除草劑水稻在美國和中南美洲廣泛種植，美國RiceTec 公司目前主推的品種有Clearfield XL729、Clearfield XL745、Clearfield XP756 和Clearfield XP4534，其均為非轉(zhuǎn)基因抗除草劑的雜交水稻。RiceTec 公司的抗除草劑雜交水稻占美國雜交稻市場份額的76%，占中南美洲市場份額的90%。國內(nèi)抗咪唑啉酮類除草劑水稻的育種進度較慢，目前報道較多的為天津市水稻所育成的金粳818，它是利用津稻9618 和津稻1007 雜交經(jīng)多年系譜法選育而成的常規(guī)品種，在水稻資源進行除草劑篩選過程中發(fā)現(xiàn)它具有咪唑啉酮除草劑抗性。對其基因序列進行分析發(fā)現(xiàn)ALS 的基因編碼區(qū)第 1 880 nt 由G 突變?yōu)锳，使第627 位的絲氨酸突變?yōu)樘於０?，導致水稻對咪唑乙煙酸除草劑不敏感，表現(xiàn)為抗除草劑。

目前，非轉(zhuǎn)基因抗除草劑水稻品種遠遠不能滿足我國市場以及大田生產(chǎn)的需要，水稻抗除草劑性狀已愈來愈受到水稻育種家和種業(yè)公司的重視。培育非轉(zhuǎn)基因抗除草劑水稻應是目前水稻育種工作的一個重要部分。為了加速抗ALS 抑制劑類除草劑水稻種質(zhì)在新品種選育過程中的應用，先后有學者開發(fā)了針對這些ALS 突變型的功能標記。但利用分子標記選擇需等雜交分離群體移栽至本田后單株取樣檢測基因，再去除無抗性基因單株后進行選種，費時費力，也容易出現(xiàn)假陽性。

為了解抗除草劑水稻的耐藥能力及方便抗除草劑水稻育種過程中對后代材料的抗除草劑性狀的篩選，本研究通過比較非轉(zhuǎn)基因抗除草劑水稻與常規(guī)水稻的根、葉和種子對除草劑(咪唑乙煙酸)的耐藥能力，明確抗除草劑水稻與常規(guī)水稻的抗性差異、抗性極限并找到一種利用合適的除草劑濃度浸種和苗期噴施，快速篩選抗除草劑后代材料的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年3—9月在河北省農(nóng)林科學院濱海農(nóng)業(yè)研究所實驗基地智能溫室進行，試驗中藥品配制及數(shù)據(jù)收集和分析在河北省農(nóng)林科學院濱海農(nóng)業(yè)研究所綜合實驗室完成。

本研究中水稻試驗材料為濱稻K1(河北省農(nóng)林科學院濱海農(nóng)業(yè)研究所選育的抗除草劑品系，品種來源為金粳818×墾育60)及墾育60(非抗除草劑水稻)；除草劑為咪唑乙煙酸(5%水劑，商品名為普施特，由巴斯夫歐洲公司生產(chǎn))。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗除草劑水稻與常規(guī)水稻不同部位耐藥性研究 分析抗除草劑水稻與常規(guī)稻的根和葉對不同濃度的咪唑乙煙酸的耐受性，設置0、0.001%、0.003%、0.005%、0.007%、0.009%、0.010%、0.030%、0.050%、0.070%、0.090%、0.900%、1.100%這13個除草劑濃度(在保持除草劑濃度的條件下，加入一定量的水稻營養(yǎng)液)。在培養(yǎng)皿中利用適量濃度的水稻營養(yǎng)液讓種子發(fā)芽，發(fā)芽7 d后把1葉1心的水稻苗移栽入盛有沙土的培養(yǎng)皿中，灌根或噴葉不同濃度的咪唑乙煙酸溶液，噴葉時沙土表面覆蓋塑料薄膜，防止除草劑滴落土中，對根有影響，每天記錄根和葉的生長情況。所有指標最終以生長率作為衡量指標，其計算方法為生長率=(-)×100%。為第7天根或葉的長度，為處理后第幾天根或葉的長度。

1.2.2 除草劑濃度及浸種時間對水稻種子出苗率的影響 為明確不同除草劑濃度和浸種時間對抗除草劑品種與普通品種水稻種子發(fā)芽的影響。設置0、0.000 5%、0.001 0%、0.003 0%、0.005 0%、0.007 0%、0.009 0%、0.010 0%、0.030 0%、0.050 0%、0.070 0%、0.090 0%、0.100 0%、0.300 0%、0.500 0%、0.700 0%、0.900 0%和1.000 0%這18個咪唑乙煙酸除草劑溶液濃度梯度和48、72、96 h的浸種時間梯度進行試驗，計算不同梯度下的出苗率。

2 結(jié)果與分析

2.1 濱稻K1與墾育60的根在不同濃度除草劑浸泡下的生長率

由圖1可知，濱稻K1在不同濃度的除草劑下第8天的生長率為15.99%～68.24%。在所有濃度間，0.001%濃度處理與對照相比，濱稻K1的根在第8天的生長率降低最多，下降14.1%。除草劑濃度在0.001%～0.050%范圍內(nèi)，根的生長率均勻下降，第8天的生長率保持在30%以上，且具有繼續(xù)伸長的勢頭。從0.070%～0.090%濃度下，生長率開始明顯降低，分別為22.6%、16.0%。繼續(xù)增大濃度直至0.900%，抗除草劑水稻的根部幾乎不再生長，施藥后第8天與第2天根的長度無明顯伸長，第8天的生長率小于5%。

試驗中不同濃度的除草劑下，墾育60的根在施藥第8天的生長率范圍是0.2%～30.3%。所有除草劑濃度間，0.001%濃度處理與對照相比，墾育60的根在第8天的生長率變化最大，下降16.4%。在除草劑濃度為0.001%～0.005%的條件下，墾育60的根仍具有一定的伸長量，在第8天的生長率分別為13.9%、12.1%、9.1%。在0.010%～0.090%的除草劑濃度下，墾育60的根幾乎不再生長，根部開始潰爛死亡，施藥后第8天與第2天根的長度無明顯伸長，第8天的生長率均小于2%(圖2)。

2.2 抗除草劑水稻與墾育60的葉片在不同除草劑濃度噴施下的生長率

濱稻K1在試驗設定濃度下，葉片在第8天的生長率從118.1%降至26.5%，濱稻K1葉片的生長率在0.001%～0.007%、0.009%～0.030%以及0.050%～0.090%這3個除草劑濃度區(qū)間內(nèi)均勻下降。所有濃度間，0.007%與0.009%相比，濱稻K1葉片的生長率下降最大，降低24.1%。在除草劑濃度為0.090%時，濱稻K1的葉片仍具有一定的生長勢頭，施藥后第8天較第2天伸長12.0%。繼續(xù)增加除草劑濃度到1.1%后，濱稻K1的葉片停止了生長(圖3)。

試驗中利用不同濃度的除草劑對水稻葉面進行噴施，墾育60的葉片在施藥后第8天生長率從171.6%降至16.9%。所有濃度間，0.001%處理濃度噴施下葉片的生長率與對照相比在第8天下降最快，降低了77.1%。在除草劑濃度為0.001%、0.003%時，墾育60的葉片仍有較強的伸長勢頭，施藥第8天比第2天分別伸長58.5%、48.3%。在除草劑濃度大于0.070%后，葉片不再生長，葉片黃死，0.070%、0.090%濃度處理施藥第8天較第2天葉僅伸長了6.6%、4.2%(圖4)。

2.3 不同濃度的咪唑乙煙酸溶液及時間浸種對抗除草劑水稻與普通水稻出苗率的影響

對濱稻K1和墾育60使用不同濃度的咪唑乙煙酸溶液浸種48 h。播種20 d后(對照苗長至3葉1心時)計算出苗率。墾育60在除草劑濃度為0.001 0%時出苗率開始降低，在0.050 0%的濃度下已經(jīng)不再出苗，可認定種子全部失活。濱稻K1在除草劑濃度為0.050 0%時，出苗率開始下降，直至濃度大于0.100 0%時，出苗率已經(jīng)小于50%，增大除草劑濃度直至1.000 0%，抗除草劑水稻仍有1%的種子可以出苗(表1)。觀察2種水稻長勢，普通水稻在除草劑濃度大于0.005 0%，抗除草劑水稻在除草劑濃度大于0.070 0%時，水稻秧苗與對照相比明顯變矮并出現(xiàn)黃葉(圖5)。

表1 不同濃度浸種下2個水稻品種出苗率

0.700 00150.900 0031.000 001

進一步利用0.01%、0.03%、0.05%、0.07%等4 個濃度的咪唑乙煙酸進行浸種48、72、96 h，分析不同浸種時間對出苗率的影響。結(jié)果(表2)表明，利用0.03%的咪唑乙煙酸浸種72 h，普通品種全部不出苗，抗除草劑品種出苗正常、整齊，秧苗無黃葉及變矮現(xiàn)象。

表2 4個濃度梯度3個時間梯度下2個水稻品種的出苗率

2.4 2種水稻的種子及根和葉對咪唑乙煙酸的耐藥性分析

濱稻K1與墾育60在不同濃度除草劑溶液下浸種48 h，2種水稻種子分別在0.050 0%、0.001 0% 的濃度下開始降低出芽率，普通水稻的種子對除草劑的敏感度是抗除草劑水稻種子的50倍。在大于0.050 0%的濃度下墾育60不再出苗，種子全部失活，而抗除草劑水稻品種濱稻K1在1.000 0%濃度下仍有1%左右的種子出苗，因此抗除草劑水稻的種子最大耐藥量分別是常規(guī)水稻的20倍以上。

濱稻K1與墾育60的根分別在除草劑濃度為0. 900%、0.010%下停止生長，濱稻K1根的耐藥能力是墾育60的90倍。2種水稻的葉片分別在1.100%、0.070%的除草劑濃度下逐漸死亡，濱稻K1葉片的耐藥能力是墾育60的15.7倍。

通過以上數(shù)據(jù)的比較可以得出，同一種水稻中葉的耐藥能力高于根的耐藥能力，種子的耐藥能力介于根和葉片之間。利用濃度為0.03%的咪唑乙煙酸溶液浸種 72 h 或0.07%的咪唑乙煙酸溶液對稻苗進行噴施可殺死全部不抗除草劑的材料，抗性材料可以正常生長。

3 討論與結(jié)論

咪唑啉酮類除草劑是目前應用較廣泛的一類除草劑，具有殺草譜廣、用量低、除草效率高等優(yōu)點，深受廣大農(nóng)戶喜愛。目前絕大部分抗ALS抑制劑作物的抗性機制是源于基因堿基突變造成氨基酸殘基位點變異，引起ALS抑制劑(除草劑)與ALS蛋白結(jié)合性降低，從而使得突變體對該除草劑體現(xiàn)為不敏感或耐受性。

對具有基因抗除草劑水稻，前人大多開展了基因分子標記的開發(fā)、堿基突變位點變異等分子方面的研究。鮮有針對抗除草劑水稻對比常規(guī)水稻對咪唑啉酮類除草劑耐藥性表型的研究。本研究通過設定一系列的除草劑濃度梯度對2種水稻的種子、根和葉片進行浸種或噴施，發(fā)現(xiàn)抗除草劑水稻與常規(guī)水稻的種子、根和葉片對除草劑的反應是一致的，耐藥能力均為葉片>種子>根。2種水稻之間，抗除草劑水稻的種子、根和葉片對除草劑的耐藥能力分別是常規(guī)水稻的20、90、15.7倍?？钩輨┧痉N子、根和葉片對咪唑乙煙酸的耐力極限分別為1.000%、0.900%、1.100%，因此在田間施藥過程中注意不要超過此濃度，以防水稻出現(xiàn)藥害。

近年來我國育種家不斷通過誘變等方法篩選具有變異基因的抗除草劑種質(zhì)，例如深圳興旺生物種業(yè)有限公司用甲基磺酸乙酯(EMS)誘變黃華占和黃絲占，以咪唑啉酮類除草劑篩選，獲得3 個抗性突變體。江蘇省農(nóng)業(yè)科學院利用甲咪唑煙酸篩選經(jīng)EMS 誘變的多個粳稻、秈稻品種，獲得多個抗除草劑突變體。但是育成品種的數(shù)量及類型仍然不能滿足種子市場及水稻生產(chǎn)的需要，急需加快抗除草劑水稻品種的選育。利用除草劑溶液浸泡作物種子驗證其是否對應除草劑具有抗性的方法前人已經(jīng)在棉花和谷子上進行了嘗試，效果明顯。

本研究利用抗除草劑水稻與常規(guī)水稻種子、根和葉片對除草劑耐藥性的差異，在種子萌發(fā)期及苗期通過表型篩選快速完成對具有抗除草劑基因后代材料的選擇。主要方法為利用0.03%咪唑乙煙酸溶液浸種72 h，或用0.07%咪唑乙煙酸溶液在水稻3葉1心期噴施，可全部殺死不具有除草劑抗性的后代材料。此種方法較目前流行的分子標記輔助選擇具有更高的效率，在正常的播種育秧期間即可完成對抗性材料的篩選。本研究結(jié)果規(guī)范了除草劑的使用劑量以防止田間藥害的產(chǎn)生，加速抗除草劑水稻后代群體抗除草劑性狀的鑒定及篩選，提高了抗除草劑水稻的育種效率。