大豆硬實(shí)性狀研究進(jìn)展

李一政， 隋 超， 郭尚敬， 孫永旺

(聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城 252000)

我國(guó)是世界排名第一的大豆消費(fèi)國(guó)，隨著人口的不斷增長(zhǎng)和人民生活水平的提高，我國(guó)對(duì)大豆的需求量逐年增加，供需矛盾日益突出。為了解決近20年來我國(guó)大豆對(duì)外依存度過高的問題，育種學(xué)家日益關(guān)注如何培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的大豆新品種，希望由此提高我國(guó)大豆的生產(chǎn)能力。種植大豆大約是5 000年前由一年生的野生大豆人工馴化發(fā)展而來的。在從野生大豆發(fā)展到種植大豆的人工馴化過程中，大豆失去了一大半的遺傳多元性和超過80%的稀有等位基因。當(dāng)前，全球范圍內(nèi)重要的大豆品種類型都具有遺傳基礎(chǔ)狹隘的安全隱患，大部分育成品種類型都出自相同的祖先親本，這不僅嚴(yán)重制約了綜合品質(zhì)與生產(chǎn)總量的提高，更增加了大豆品種應(yīng)對(duì)生物、非生物脅迫的脆弱性。由于沒有受到人為選擇的影響，野生大豆中蘊(yùn)藏著豐富的優(yōu)良基因，具有多莢多粒、蛋白含量高、適應(yīng)力強(qiáng)、繁殖系數(shù)高、抗旱、抗寒、耐貧瘠等優(yōu)點(diǎn)。在大豆品種繁育工作中，作為培育優(yōu)質(zhì)大豆品種重要材料的野生大豆，可以為拓展種植大豆的生物遺傳基礎(chǔ)、供應(yīng)有益生物性狀與基因物質(zhì)資源提供重要材料。野生大豆資源中的高產(chǎn)、高蛋白、抗旱、抗病蟲等優(yōu)良材料已被廣泛應(yīng)用于栽培大豆的性狀改良中。然而，育種實(shí)踐表明，野生大豆的很多優(yōu)良基因不能被有效利用，其中一個(gè)很重要的原因是野生大豆普遍存在硬實(shí)性狀，該性狀會(huì)導(dǎo)致不可忽視的遺傳累贅。

1 種子硬實(shí)性狀

形成種子硬實(shí)的主要原因是種子皮比較致密、不透水，造成種子不可以吸脹發(fā)芽，又叫作物理休眠，屬于種子休眠的一種類型。其硬實(shí)性是一種適應(yīng)生態(tài)環(huán)境的可用性性狀，可以保護(hù)種子避免動(dòng)物、微生物的侵害，還可以在高溫多雨等氣候條件下使種胚與外界空氣、水分隔絕以使種子保持長(zhǎng)久活力，隨著外界基本條件的改變，土壤中不同種子的發(fā)芽水平也隨之改變以促進(jìn)物種的延續(xù)和傳播。硬實(shí)生物性狀廣泛存在于綠色植物種子中，在農(nóng)作物中最為普遍的就是豆科農(nóng)作物。與其他植物一樣，野生大豆硬實(shí)種子具有較強(qiáng)的生命活力和較長(zhǎng)的壽命，有利于其適應(yīng)環(huán)境。然而，對(duì)于栽培大豆而言，種子硬實(shí)通常是一個(gè)不利性狀。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，雖然把大豆硬實(shí)種子放在合適的溫度及濕度環(huán)境中進(jìn)行浸泡數(shù)天仍不能使其吸水萌發(fā)，若直接播種會(huì)導(dǎo)致田間出苗率、整齊度降低，很容易產(chǎn)生各類雜草，嚴(yán)重影響播種品質(zhì)并最終降低產(chǎn)量；在連作制度下，硬實(shí)種子如果在下一年萌發(fā)后，還會(huì)與后作大豆種子混雜，從而使產(chǎn)量降低。在大豆食用商品生產(chǎn)加工、制造和使用過程中，硬實(shí)不僅會(huì)直接干擾影響豆芽等豆類食用商品的感官綜合品質(zhì)，而且會(huì)減少大豆原有物質(zhì)材料在豆腐、豆?jié){和醬油等生產(chǎn)加工制造過程中的碾磨綜合品質(zhì)。目前，對(duì)于硬實(shí)度高的大豆品種，人們必須采用機(jī)械劃破、特殊溫濕度處理、藥劑浸泡等方法來使大豆種子獲得吸脹萌發(fā)的一致性，這些方式無疑增加了生產(chǎn)成本。除了對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及種子加工方面的不利影響，種子硬實(shí)性狀在某些農(nóng)業(yè)實(shí)踐方面也表現(xiàn)出較好的利用價(jià)值。硬實(shí)種子外皮阻礙了水分向空氣中擴(kuò)散。在作物成熟收獲前，若遇惡劣天氣條件，硬實(shí)種子可防止種子循環(huán)吸水和干燥；堅(jiān)硬的種皮能延緩種胚對(duì)周圍環(huán)境水蒸氣的吸收，抵抗貯藏過程中由于溫度、濕度波動(dòng)對(duì)種子造成的損害，使種子長(zhǎng)時(shí)間維持萌發(fā)活力，這對(duì)操控種子的睡眠與萌發(fā)及增加種子的儲(chǔ)存壽命具有十分深遠(yuǎn)的影響。因此，深入了解大豆種子硬實(shí)性狀調(diào)控機(jī)制，對(duì)于野生種質(zhì)資源在大豆品種改良和生產(chǎn)實(shí)踐方面的應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。

2 硬實(shí)性狀相關(guān)種皮結(jié)構(gòu)和組分特征

在大豆種子自身特性方面，硬實(shí)性狀與種子的種皮、種臍、氣孔等結(jié)構(gòu)及種皮化學(xué)組分、籽粒大小等因素有關(guān)，其中種皮、種臍和大豆種子硬實(shí)的相互作用最為密切。前人分析得出，大豆種子硬實(shí)度通常與角質(zhì)分布層、柵欄分布層有關(guān)。Ma等觀察了6種大豆種子的種皮結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，硬實(shí)種子和非硬實(shí)種子的種皮縱向結(jié)構(gòu)相似，種子浸水后首先在背側(cè)觀察到種皮褶皺這一典型吸水現(xiàn)象，硬實(shí)種子的角質(zhì)層則沒有裂痕。因此，Ma等認(rèn)為種皮角質(zhì)層是否存在裂痕是決定種子硬實(shí)性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征。Chris等認(rèn)為，大豆種子吸水分為種皮吸水、種胚吸脹2個(gè)階段，剝除大豆種子的種皮后，硬實(shí)、非硬實(shí)種質(zhì)種胚的吸水速率無明顯差異，硬實(shí)種子種皮的透水率比非硬實(shí)種子低，表明種子外皮滲入性是造成種子硬實(shí)生物性狀的重要影響因素。徐亮等發(fā)現(xiàn)，野生大豆硬實(shí)種子表面覆蓋著1層角質(zhì)層，種臍表面有不規(guī)則的龜裂，但觀察不到發(fā)芽孔，種臍處柵欄層細(xì)胞排列緊密。用濃硫酸處理野生大豆硬實(shí)種子后，種皮表面的角質(zhì)層被腐蝕而脫落，種臍裂縫加寬加深，且柵欄層細(xì)胞也被腐蝕，使得發(fā)芽孔外露，從而可以吸水萌發(fā)。由此可見，引起野生大豆種子外皮不透水的主要形成因素，除了角質(zhì)分布層能夠發(fā)揮阻擋水分進(jìn)入的作用外，更深層的原因是柵欄分布層的細(xì)胞鑲嵌排布并且相互之間連接密切，而種臍僅僅作為一種通道控制水分進(jìn)入種子。在柵欄狀細(xì)胞的外端，纖維物質(zhì)和栓化層形成致密區(qū)域，在顯微鏡下觀察時(shí)該結(jié)構(gòu)特別明亮，稱為明線，這一特殊物理結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是最不容易透水的區(qū)域。Yaklich等提出，有中心氣孔的種子外皮普遍具有吸水性，大豆種皮中心氣孔的缺乏會(huì)造成種子硬實(shí)的生物性狀。柵欄層處的細(xì)胞呈緊密排列的狹長(zhǎng)形狀，里面積聚大量鈣鹽或硅酸鹽，還含有不透水的酚類、醌類物質(zhì)，形成緊湊堅(jiān)固的防水保護(hù)層。Zhou等研究了山東省2種大豆種皮中與種子硬度、萌發(fā)相關(guān)的酚類物質(zhì)，從種皮中分離出3種主要的酚類物質(zhì)，其中表兒茶素含量的變化與種子硬實(shí)粒率的變化呈顯著正相關(guān)，因此表兒茶素含量可能與大豆的硬實(shí)性有關(guān)。此外，種皮中果膠、木聚糖、羥基脂肪酸、鈣含量也與種子的硬實(shí)性狀具有密切關(guān)系。Calero等對(duì)少數(shù)大豆材料的研究發(fā)現(xiàn)，種子籽粒的實(shí)際大小與吸水百分比呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。而黃建成等經(jīng)過研究證實(shí)，在吸脹試驗(yàn)中小粒種子在0～3 h 內(nèi)的吸水速度顯著大于大粒種子，表明小粒種子的吸水速率比較高，生命活力較強(qiáng)。Edwards等也研究得出，小粒種子的吸水速度大于大粒種子。綜上，種子硬實(shí)的產(chǎn)生受多種結(jié)構(gòu)因素影響，可能是所用研究材料或生長(zhǎng)條件不一致引起的。

3 影響大豆硬實(shí)性狀的環(huán)境因素

除了種子自身的結(jié)構(gòu)特性，種子硬實(shí)性狀還受到多種內(nèi)外部環(huán)境因素影響。大豆種子的成熟度會(huì)直接影響硬實(shí)種子的產(chǎn)生，當(dāng)大豆種子達(dá)到一定成熟度后，種子的有效含水總量明顯降低，種子皮外層的柵欄分布層依次加厚，造成種子外皮的生物硬化，形成硬實(shí)種子。前人通過分析得出，不同收期的同類農(nóng)作物與同一收期的同類農(nóng)作物相比，不同植株位置會(huì)直接影響種子硬實(shí)比例，收期越遲，硬實(shí)比例越大；綠色植被下端的種子硬實(shí)比例超過綠色植被上端的種子硬實(shí)比例，表明種子硬實(shí)的產(chǎn)生和種子本身成熟度相關(guān)。干擾大豆種子硬實(shí)形成的外界環(huán)境因素通常包含以下幾點(diǎn)：生長(zhǎng)末期的自然生態(tài)氣候基本條件、貯藏與交通運(yùn)輸?shù)幕緱l件、種子收獲后至長(zhǎng)期儲(chǔ)存期間的環(huán)境條件。Vieira等提出，大豆在鼓粒期與鼓粒滿期(R5、R6)遭遇干旱脅迫，容易造成種子硬實(shí)比例提高；干旱脅迫對(duì)種子硬實(shí)與生產(chǎn)總量都存在干擾作用，在小粒種子中最為明顯，種子實(shí)際有效質(zhì)量與生產(chǎn)總量都明顯降低。除此之外，牛連杰等發(fā)現(xiàn)與秋大豆相比，夏大豆的硬實(shí)比例更低，其根本原因是河南、新疆地區(qū)第二季度高溫多雨，而第三季度則天氣干燥。在大豆整個(gè)生長(zhǎng)過程中，水分的實(shí)際供給情況也會(huì)直接影響種子的硬實(shí)度，例如當(dāng)灌水次數(shù)相同時(shí)，灌水量越小，大豆的硬實(shí)比例越高。陽(yáng)光輻射強(qiáng)度同時(shí)也是影響種子硬實(shí)的因素之一，陽(yáng)光輻射的時(shí)間愈短，作用強(qiáng)度愈小，愈不容易形成硬實(shí)種子。田青種子不管完熟收獲還是枯熟進(jìn)行收獲，陰干處理種子的硬實(shí)比例均比曬干處理種子的低，表明收獲后種子的干燥處理模式也會(huì)直接影響種子硬實(shí)度。在種子貯藏或者運(yùn)輸過程中，當(dāng)實(shí)際環(huán)境濕度偏低時(shí)，也容易形成硬實(shí)種子，譬如草木樨與菜豆在貯藏過程中，當(dāng)種子有效含水量降低時(shí)，種子硬實(shí)率顯著升高。

4 硬實(shí)性狀的遺傳學(xué)分析

遺傳是決定種子硬實(shí)度的關(guān)鍵因素。以往用經(jīng)典遺傳學(xué)方法對(duì)大豆硬實(shí)性狀進(jìn)行遺傳研究發(fā)現(xiàn)，大豆硬實(shí)性狀受少數(shù)基因控制，但關(guān)于其顯隱性及控制該性狀的基因數(shù)存在爭(zhēng)議。Woodworth 提出，非硬實(shí)是一類部分顯性性狀。而Ting卻提出，硬實(shí)性是顯性性狀。Kilen等使用硬實(shí)、非硬實(shí)親本正反交構(gòu)建F代分離群體，發(fā)現(xiàn)硬實(shí)個(gè)體較少，推測(cè)大豆硬實(shí)性狀受3對(duì)隱性基因控制。Shahi等研究發(fā)現(xiàn)，大豆硬實(shí)性狀受1對(duì)基因控制，但顯隱性關(guān)系與品種選擇有關(guān)。亞類間雜交以硬實(shí)種子為優(yōu)勢(shì)種，類間雜交以硬實(shí)種子為隱性種。Verma等用6個(gè)親本正反交產(chǎn)生的15個(gè)雜交組合分析大豆硬實(shí)遺傳特征，以F、F代大豆種子的吸脹情況作為參考，推測(cè)不同品種材料中有 1～4對(duì)隱性基因操控大豆的硬實(shí)性。張?zhí)降韧ㄟ^分析硬實(shí)性大豆品類D86-4448與非硬實(shí)性商用大豆品類A6297的F代群體，提出2個(gè)主要基因操控硬實(shí)生物性狀，并且基因間有累加作用，證明硬實(shí)是顯性生物性狀。上述不同的研究結(jié)果，可能與不同研究人員使用的親本材料相關(guān)，同時(shí)說明大豆硬實(shí)性狀存在較為復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。

5 硬實(shí)性狀相關(guān)數(shù)量形狀座位(QTL)的定位

找出關(guān)鍵性狀的控制基因或者QTL的準(zhǔn)確定位和克隆，在農(nóng)業(yè)作物相關(guān)研究過程中具有十分深遠(yuǎn)的影響。Keim等以栽培種、大豆野生種大豆構(gòu)建表型分離群體，運(yùn)用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記進(jìn)行大豆硬實(shí)QTL準(zhǔn)確作用的定位分析研究，共檢測(cè)得到5個(gè)與大豆種子硬實(shí)度有關(guān)的標(biāo)記，這些標(biāo)記及標(biāo)記間的上位性能夠解釋71.0%的遺傳變異。Sakamoto等利用野生大豆與栽培大豆配制雜交組合，研究F代至F代單株種皮色與吸脹性的相關(guān)性，經(jīng)過分子標(biāo)記測(cè)試，找出2個(gè)主效QTL、1個(gè)微效QTL與大豆種子硬實(shí)度有關(guān)，其中在2號(hào)遺傳染色體上的簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)標(biāo)記Satt459周圍的QTL對(duì)大豆種子硬實(shí)度貢獻(xiàn)率最大，在F代、F代依次能夠解釋說明23.8%、38.5%的表型變異。Satoshi等使用硬實(shí)、非硬實(shí)的栽培大豆品種構(gòu)建分離群體，發(fā)現(xiàn)3個(gè)與大豆種子硬實(shí)度有關(guān)的標(biāo)記，其中位于6號(hào)染色體，與標(biāo)記Satt489密切連鎖；位于2號(hào)染色體，與標(biāo)記B142密切連鎖；位于8號(hào)染色體，與其密切連鎖的標(biāo)記為Satt367。Liu等用栽培大豆、野生大豆親本構(gòu)建了重組自交系(RIL)群體進(jìn)行定位，在2號(hào)、6號(hào)遺傳染色體上依次定位到2個(gè)大豆硬實(shí)QTLs，其中2號(hào)、6號(hào)遺傳染色體的QTL依次可以解釋超過42.0%、13.0%的表型變異。Singh等發(fā)現(xiàn)，分別位于6號(hào)、8號(hào)、12號(hào)、15號(hào)染色體的4個(gè)標(biāo)記與種皮透性顯著相關(guān)，種皮透性標(biāo)記可單獨(dú)解釋3.9%～4.5%的總表型變異。Kebede等發(fā)現(xiàn)，栽培大豆PI594619中控制一個(gè)大豆種皮硬實(shí)的主效位點(diǎn)處于2號(hào)遺傳染色體Satt202標(biāo)記和Satt459標(biāo)記之間。近年來，很多國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道了大豆硬實(shí)性QTLs，如艾麗娟等鑒定得到了4個(gè)大豆硬實(shí)加性或上位性互作QTLs，陳靜靜等使用集團(tuán)分離分析法(BSA法)發(fā)掘到3個(gè)與大豆種子硬實(shí)有關(guān)的QTLs。

6 硬實(shí)性狀調(diào)控分子機(jī)制

Sun等研究發(fā)現(xiàn)，大豆硬實(shí)性狀受單顯性基因控制，通過精細(xì)定位和功能驗(yàn)證，證明鈣調(diào)磷酸跨膜蛋白編碼基因是關(guān)鍵基因。在非硬實(shí)大豆品種中，基因突變導(dǎo)致其編碼的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變異，種皮鈣素含量降低且柵欄層變薄，從而使種皮產(chǎn)生透水性。雖然基因只是發(fā)生了某個(gè)堿基序列的點(diǎn)突變，卻可以說明該基因也許對(duì)種子透水性具有調(diào)控作用。Jang等通過精細(xì)定位、序列分析和表達(dá)分析，克隆了大豆硬實(shí)數(shù)量性狀位點(diǎn)基因，該基因編碼1，4--葡聚糖內(nèi)切酶，該基因的編碼區(qū)在硬實(shí)和非硬實(shí)品類間存在1個(gè)堿基差異，該堿基變異與硬實(shí)性狀緊密連鎖。在非硬實(shí)大豆品種中，該基因突變?cè)斐?，4--葡聚糖內(nèi)切酶底物結(jié)合區(qū)產(chǎn)生1個(gè)氨基酸替換，導(dǎo)致其編碼的1，4--葡聚糖內(nèi)切酶底物結(jié)合區(qū)產(chǎn)生1個(gè)氨基酸替換，筆者推測(cè)這可能導(dǎo)致其底物結(jié)合能力降低，種皮中1，4--葡聚糖合成量減少，從而產(chǎn)生透水性。上述研究發(fā)現(xiàn)的基因，在大豆基因組中處于同一區(qū)間，且位置相鄰。由此可見，對(duì)于上述2個(gè)基因之間分析得出的差異，還需要進(jìn)一步研究。

目前，除了大豆中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的基因，其他近緣植物中發(fā)現(xiàn)的硬實(shí)調(diào)控基因及分子調(diào)控機(jī)制也可以為大豆硬實(shí)性狀研究提供借鑒。蒺藜苜蓿具備基因組小、生長(zhǎng)時(shí)間短、遺傳轉(zhuǎn)化處理工作效率高等優(yōu)勢(shì)，是豆科的模式植物，正常的蒺藜苜蓿籽粒為典型的硬實(shí)性狀。Chai等通過篩選苜蓿反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子突變體庫(kù)，找到具有種子快速吸水能力的突變體。表型分析結(jié)果顯示，該突變體種皮角質(zhì)層中脂質(zhì)單體組分發(fā)生改變，導(dǎo)致角質(zhì)層出現(xiàn)許多個(gè)微小裂縫，從而增強(qiáng)了種皮透水性。通過分析轉(zhuǎn)座子的插入位置，發(fā)現(xiàn)突變體中編碼KNOTTED-like homeobox蛋白的基因(基因序列號(hào)：Medtr5g011070)轉(zhuǎn)錄異常，功能互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)該基因突變是導(dǎo)致突變體種子產(chǎn)生快速吸水性狀的關(guān)鍵原因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)控脂肪酸羥化酶基因(基因序列號(hào)：Medtr8g030590)來調(diào)節(jié)角質(zhì)層組分的合成路徑。菜用大豆是一種重要的豆科作物，野生菜用大豆種子普遍存在硬實(shí)現(xiàn)象，而栽培菜用大豆種子容易吸脹。為了研究決定菜用大豆種子硬實(shí)性狀的調(diào)控基因，Soltani等以硬實(shí)、非硬實(shí)菜豆品系為親本建立重組自交系，利用集團(tuán)分離分析法找到了控制硬實(shí)性狀的主效QTL位點(diǎn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)編碼果膠乙酰酯酶的基因可能是控制菜用大豆硬實(shí)性狀的關(guān)鍵基因。與硬實(shí)品系相比，吸脹品系中果膠乙酰酯酶的基因由于發(fā)生了移碼突變而喪失功能。基于以上結(jié)果，筆者擴(kuò)大了硬實(shí)和吸脹品系的調(diào)查范圍，發(fā)現(xiàn)硬實(shí)品系中該基因序列正常，而77%的栽培品系中存在突變型的等位基因，表明該基因在菜豆馴化過程中受到了正向選擇。

7 討論與展望

硬實(shí)是植物種子中常見的休眠特征，主要是由于種皮缺乏透水性。野生大豆普遍存在的硬實(shí)性狀嚴(yán)重限制了其在大豆遺傳改良中的應(yīng)用，解析該性狀產(chǎn)生的生理、分子機(jī)制對(duì)大豆育種工作具有重要意義。對(duì)于該性狀產(chǎn)生的生理及分子機(jī)制，不同研究者得出了不同結(jié)論，可能由于所用材料不同，同時(shí)說明硬實(shí)性狀存在非常復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。雖然目前已經(jīng)克隆到2個(gè)大豆硬實(shí)調(diào)控基因，但是由于硬實(shí)性狀產(chǎn)生的復(fù)雜性，其生理及分子調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。筆者認(rèn)為，今后應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)野生大豆硬實(shí)性狀的調(diào)查和研究，對(duì)于特異的硬實(shí)種質(zhì)，應(yīng)采用經(jīng)典遺傳學(xué)分析和高通量測(cè)序相結(jié)合的手段，加快硬實(shí)調(diào)控基因的克隆；此外，還應(yīng)注意加強(qiáng)其他植物，尤其是其他豆科植物種子硬實(shí)性狀調(diào)控機(jī)制的研究，通過大豆中的同源基因加速大豆硬實(shí)性狀調(diào)控機(jī)制的解析。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，尤其是以基因編輯技術(shù)為代表的基因工程技術(shù)的進(jìn)步，硬實(shí)調(diào)控基因的挖掘與應(yīng)用將加快大豆育種工作進(jìn)程，為大豆品種改良提供科學(xué)指導(dǎo)。