人腦膠質(zhì)瘤組織雙色熒光染色圖像質(zhì)量與診斷效能分析

王凱旋，李鵬飛，趙宇，李航，李明，張世淵，吉宏明，胡昌辰，

1山西醫(yī)科大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，太原 030001；2山西省人民醫(yī)院神經(jīng)外科

膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤，WHO將腦膠質(zhì)瘤分為Ⅰ～Ⅳ級，Ⅰ、Ⅱ級為低級別腦膠質(zhì)瘤，Ⅲ、Ⅳ級為高級別腦膠質(zhì)瘤。膠質(zhì)瘤的首選治療方案為最大范圍地安全切除腫瘤[1]。術(shù)中指導(dǎo)技術(shù)有助于臨床醫(yī)生更準確地識別正常腦組織與腫瘤的界限，以確定手術(shù)切緣。目前用于術(shù)中指導(dǎo)的神經(jīng)導(dǎo)航、術(shù)中MRI、術(shù)中冰凍切片等各有優(yōu)缺點，雖然能提高手術(shù)切除范圍，但存在如術(shù)中腦漂移造成導(dǎo)航不準、術(shù)中MRI增加手術(shù)時間、切片組織結(jié)構(gòu)模糊影響病理結(jié)果判斷等問題。BODIPY493/503是一種細胞滲透性親脂熒光染料，可對細胞中的脂質(zhì)進行染色，呈現(xiàn)綠色熒光。DRAQ5是一種紅色熒光染料，僅與DNA結(jié)合，是細胞核熒光染色的特異性染料。激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）可以清楚地顯示細胞中的熒光[2]，圖像分辨率和清晰度高[3]，具有對大樣本進行拼接成像、熒光成像質(zhì)量高等優(yōu)勢，可以進行雙色熒光染色。2020年8月—2022年1月，我們探索了一種術(shù)中新鮮組織雙色熒光染色技術(shù)，使用BODIPY493/503與DRAQ5分別染色脂質(zhì)與DNA，運用LSCM進行雙色熒光成像，并與“金標準”HE染色進行對比，以期能夠快速、準確地識別正常腦組織與膠質(zhì)瘤的界限，幫助神經(jīng)外科醫(yī)師判斷手術(shù)切緣。

1 材料與方法

1.1 組織標本與實驗材料 選擇2020年8月—2021年8月山西省人民醫(yī)院收治的腦膠質(zhì)瘤患者的術(shù)中組織標本71例，均經(jīng)組織病理檢查確診。納入標準：①術(shù)前本院影像檢查提示腦膠質(zhì)瘤可能；②術(shù)后病理診斷為腦膠質(zhì)瘤；③初診，入院前未接受任何抗腫瘤治療；④臨床病理資料完整。將每一份樣本分成2塊組織標本，分別用于雙色熒光染色和HE染色。分別于染色后及染色90 d后由兩名病理科醫(yī)生對雙色熒光染色和HE染色組織圖像進行評估。所有研究對象或其家屬知情同意并簽署知情同意書，本研究經(jīng)山西省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準（批號2019省醫(yī)科倫審字第85號）。BODIPY493/503（Invitrogen公司），DRAQ5（Thermofisher公司），OCT組織包埋劑，中性甲醛，蘇木精染液，1%鹽酸乙醇，1%醇溶性伊紅液。FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司，配備二維電動樣品臺），KF-PRO-005EX數(shù)字切片掃描儀（中國寧波江豐生物公司）。

1.2 雙色熒光染色及圖像采集 BODIPY493/503染色方法：①取一塊1.0 cm×1.0 cm的組織標本，經(jīng)OCT組織包埋劑包埋后于-12℃冷凍3 min，切取約10μm厚切片，貼附于潔凈載玻片上；②BODIPY493/503粉劑用PBS配成10 mg/mL的原液，以1：500比例配成濃度20μg/mL的BODIPY493/503熒光試劑溶液；③丙酮固定10μm厚的腦組織切 片 30 min[4]；④ 用 PBS 沖 洗 3 次 后 滴 加BODIPY493/503熒光試劑[4]；⑤37 ℃溫箱孵育 30 min后用PBS沖洗[4]。DRAQ5染色∶PBS沖洗后直接滴加DRAQ5染色劑[5]，在37 ℃溫箱孵育1 h后反復(fù)PBS沖洗5 min，蓋玻片封片。將雙色熒光染色完成的標本置于FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡載物臺上，進行雙色熒光圖像采集，同時于520、683 nm處采集到綠色和紅色熒光圖像，采集軟件為FV10-ASW Viewer4.2，物鏡放大倍率為20倍，數(shù)值孔徑0.75，大部分標本分辨率設(shè)置為1024×1024像素，適當(dāng)調(diào)整光電倍增管電壓，其余為默認設(shè)置。

1.3 HE染色及圖像采集 HE染色方法：取同一樣本的另一塊組織標本，切取約1.0 cm×1.0 cm的標本；標本浸于4%甲醛固定18～24 h；標本于梯度乙醇中處理12 h；二甲苯浸泡2～2.5 h；65℃石蠟浸泡3～4 h，自動包埋機包制；取約4μm厚的石蠟片貼于載玻片上；常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇清洗至水化；蘇木精染液浸染10～15 min、水洗；1%鹽酸乙醇分化3 s、水洗、飽和碳酸鋰藍化5～10 s，流水沖洗15～30 min；1%醇溶性伊紅浸染5～15 s；常規(guī)脫水、透明、封片。將HE染色的切片于KF-PRO-005EX數(shù)字切片掃描儀（圖像采集軟件為K-Viewer V1）采集圖像，由病理科醫(yī)生進行評估。

1.4 組織染色圖像質(zhì)量評價 組織樣本的雙色熒光染色與HE染色圖像采集完成后，將雙色熒光染色圖像隨機分給另外兩名病理科醫(yī)生對雙色熒光染色圖像與HE染色圖像進行對比評估，并進行WHO分級。細胞核DNA深染且具有核異常分裂象（細胞核增大、形態(tài)不規(guī)則等）的為星形細胞瘤，如無微血管增生及壞死等高級別膠質(zhì)瘤的特征，則為星形膠質(zhì)細胞瘤（WHO Ⅱ級）；若細胞密度增多，有絲分裂旺盛，則為間變性星形細胞瘤（WHO Ⅲ級）。膠質(zhì)母細胞瘤（WHO Ⅳ級）典型表現(xiàn)為微血管增生及壞死，后者常表現(xiàn)為膠質(zhì)母細胞瘤DNA周圍的柵欄狀壞死。少突膠質(zhì)細胞瘤（WHO Ⅱ級）細胞核均勻大小，呈圓形；間變性少突膠質(zhì)細胞瘤（WHO Ⅲ級）的特征是核DNA分裂頻繁，異常分裂象，伴微血管增生或壞死。室管膜瘤（WHO Ⅱ級）細胞核較小，DNA染色較淡，細胞密度較低，典型表現(xiàn)為細胞在血管周圍花環(huán)狀排列；間變性室管膜瘤（WHO Ⅲ級）細胞數(shù)多，核DNA分裂象多，有微血管增生或柵欄狀壞死。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件。以Cohen's κ統(tǒng)計量衡量雙色熒光染色與HE染色診斷的一致性。κ范圍為-1～1，κ＞0表示觀察一致性大于偶然一致性，κ＝0表示完全偶然，κ＜0表示觀察一致性小于偶然一致性。κ＜0.40表示一致性較差，0.40≤κ＜0.75表示一致性基本滿意，κ≥0.75表示一致性相當(dāng)滿意[6]。計算兩位病理醫(yī)生的診斷準確率、敏感度、特異度。

2 結(jié)果

2.1 雙色熒光染色圖像與HE染色圖像對比 雙色熒光染色的細胞核被DRAQ5熒光試劑染成紅色[7]，BODIPY493/503將脂質(zhì)染成綠色[8]，增加了細胞核與脂質(zhì)的對比。雙色熒光染色的圖像背景清晰，細胞核與脂質(zhì)對比鮮明，組織結(jié)構(gòu)基本完整，可用于診斷膠質(zhì)瘤。雙色熒光染色圖像與HE染色圖像對比，整體組織輪廓相似，但部分存在熒光淬滅現(xiàn)象，使得組織標本顯得不完整；雙色熒光圖像放大后可見膠質(zhì)瘤細胞核增大，形態(tài)不規(guī)則，有的細胞核拉長；高級別膠質(zhì)瘤可見腫瘤細胞周圍核柵欄狀壞死，綠色熒光強。低級別膠質(zhì)瘤的雙色熒光圖像可見細胞核數(shù)量增多，同樣具有核不典型性。高級別膠質(zhì)瘤與低級別膠質(zhì)瘤的雙色熒光染色圖像都可見較強烈的綠色熒光，高級別膠質(zhì)瘤更明顯。雙色熒光染色完整保留了脂質(zhì)，HE染色則去除了細胞中的脂質(zhì)，無法獲取與膠質(zhì)瘤相關(guān)的脂質(zhì)信息。見圖1、圖2。

圖1 人腦膠質(zhì)瘤組織雙色熒光染色與HE染色大體圖像對比

圖2 人腦膠質(zhì)瘤組織雙色熒光染色與HE染色細胞核圖像對比

2.2 雙色熒光染色與HE染色診斷的一致性 病理科醫(yī)生A評估雙色熒光染色圖像得到低級別膠質(zhì)瘤21例、高級別膠質(zhì)瘤50例，病理科醫(yī)生B分別為24、47例。有4例HE染色證實WHO Ⅱ級的星形細胞瘤被診斷為間變性星形細胞瘤（WHO Ⅲ級），2位病理醫(yī)生均錯誤判斷；病理科醫(yī)生A將5例少突膠質(zhì)細胞瘤（WHO Ⅱ級）錯誤判斷為間變性少突膠質(zhì)細胞瘤（WHO Ⅲ級），3例室管膜瘤（WHO Ⅱ級）診斷為間變性室管膜瘤（WHO Ⅲ級）；病理醫(yī)生B將2例間變少突膠質(zhì)細胞瘤診斷為少突膠質(zhì)細胞瘤，2例間變性室管膜瘤（WHO Ⅲ級）診斷為室管膜瘤（WHO Ⅱ級）。將病理科醫(yī)生A、B的診斷結(jié)果與HE染色的診斷結(jié)果進行Kappa一致性檢驗，κ值分別為0.48、0.64。染色90 d后，兩位病理科醫(yī)生第二次評估雙色熒光染色圖像，病理科醫(yī)生A診斷低級別膠質(zhì)瘤26例、高級別膠質(zhì)瘤45例，病理科醫(yī)生B分別為28、43例。將病理科醫(yī)生A、B第二次診斷結(jié)果與HE染色診斷結(jié)果進行Kappa一致性檢驗，κ值分別為0.76、0.82。病理科醫(yī)生A第一次診斷敏感度為88%、特異度為57%、診斷準確率為76%，第二次診斷分別為93%、82%、89%；病理科醫(yī)生B第一次診斷敏感度為91%、特異度為71%、診斷準確率為83%，第二次診斷分別為93%、89%、92%。見表1、表2。

表1 兩位病理科醫(yī)生第一次評估雙色熒光染色診斷結(jié)果與HE染色診斷結(jié)果比較（例）

表2 兩位病理科醫(yī)生第二次評估雙色熒光染色診斷結(jié)果與HE染色診斷結(jié)果比較（例）

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是指起源于腦神經(jīng)膠質(zhì)細胞的腫瘤，是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤。我國腦膠質(zhì)瘤的年發(fā)病率為（5～8）/10萬，5年病死率在全身腫瘤中僅次于胰腺癌和肺癌。在治療方面，目前采用以最大范圍安全切除為主，術(shù)后放療、化療為輔的綜合治療方案[1]。膠質(zhì)瘤極易復(fù)發(fā)，即使采取積極的治療措施，預(yù)后仍差。根據(jù)中國膠質(zhì)瘤基因組圖譜統(tǒng)計[9]，低級別膠質(zhì)瘤患者中位總生存期（OS）為78.1個月，間變性膠質(zhì)瘤為37.6個月，膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）患者OS為14.4個月。低級別膠質(zhì)瘤的6個月及1、3、5年OS率分別為99%、94%、79%、67%，間變性膠質(zhì)瘤分別為 88%、75%、51%、36%，GBM為87%、61%、15%、9%。

神經(jīng)外科醫(yī)生在技術(shù)上面臨的挑戰(zhàn)是區(qū)分膠質(zhì)瘤與正常腦組織的界限，手術(shù)指導(dǎo)技術(shù)的進步提高了醫(yī)生對膠質(zhì)瘤與正常腦組織界限的視覺辨別能力[10]。目前用于手術(shù)指導(dǎo)的技術(shù)主要包括基于MRI成像的神經(jīng)導(dǎo)航系統(tǒng)、活體熒光染色成像、術(shù)中MRI及術(shù)中超聲、術(shù)中病理分析等。神經(jīng)導(dǎo)航系統(tǒng)具有手術(shù)切口小的優(yōu)點，但由于導(dǎo)航是基于術(shù)前MRI的，病情的進展可能導(dǎo)致腦漂移從而使導(dǎo)航不準確[10]。活體熒光染色成像可選擇的藥物有5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）、熒光素、吲哚菁綠[10]（ICG），但是，熒光素與ICG除在浸潤性膠質(zhì)瘤與正常腦組織邊界聚集，也常在血腦屏障破壞處累積，5-ALA也有假陽性與假陰性的報道[11]。術(shù)中MRI及術(shù)中超聲對手術(shù)室的基礎(chǔ)設(shè)施有著更高的要求。有報道稱，術(shù)中MRI使手術(shù)時間增加約1 h，麻醉時間延長，增加了潛在的術(shù)中風(fēng)險[12]。術(shù)中進行實時病理檢查，有助于手術(shù)醫(yī)生即時評估手術(shù)切緣范圍，制定精確的手術(shù)策略，從而最大范圍切除腫瘤，常用的方法為術(shù)中冰凍切片。但是，由于腦組織富含水分，易形成冰晶[13]，造成組織結(jié)構(gòu)模糊，辨識難度大，影響病理診斷結(jié)果的準確性。雙色熒光染色與術(shù)中冰凍切片相比，圖像組織結(jié)構(gòu)清晰，診斷準確率高，應(yīng)用前景大。

傳統(tǒng)HE染色的細胞核與細胞質(zhì)的藍紅對比，在雙色熒光染色圖像中轉(zhuǎn)變成DNA與脂質(zhì)的紅綠對比。高級別膠質(zhì)瘤的雙色熒光染色圖像可見綠色熒光強，提示與脂質(zhì)代謝有關(guān)，而在低級別膠質(zhì)瘤中可見綠色熒光相比高級別膠質(zhì)瘤弱且范圍小，提示可能與脂質(zhì)代謝不如高級別膠質(zhì)瘤活躍有關(guān)。對比高級別膠質(zhì)瘤與低級別膠質(zhì)瘤的雙色熒光染色圖像，都可見較強烈的綠色熒光，高級別膠質(zhì)瘤更為明顯，提示脂質(zhì)代謝與膠質(zhì)瘤分級密切相關(guān)。不同于術(shù)中冰凍及HE染色，雙色熒光染色沒有脫脂步驟，完整保留了腦組織的脂質(zhì)，可以對新鮮腦組織的脂質(zhì)代謝進一步研究。脂質(zhì)代謝改變是惡性腫瘤最突出的代謝改變之一。脂質(zhì)不僅是機體重要的能源物質(zhì)，也是前列腺素、白三烯等不飽和脂肪酸衍生物的前體物質(zhì)，在機體炎癥反應(yīng)、凝血及血栓形成等重要過程中不可或缺[14]。脂質(zhì)參與構(gòu)成生物膜的重要成分，還是體內(nèi)重要的信號分子。膠質(zhì)瘤中脂質(zhì)代謝相關(guān)酶和蛋白，如單?；视王ブ久改芡ㄟ^調(diào)節(jié)PGE2/pLRP6/β-catenin信號通路來誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細胞向M2極化，增強GBM的侵襲性[15]；脂肪酸結(jié)合蛋白7與其配體結(jié)合使得ATP-檸檬酸裂解酶磷酸化和激活，ATP-檸檬酸裂解酶促進乙酰CoA生成，使得膠質(zhì)瘤獲得增殖所需的能量和物質(zhì)[16]；SREBP-2基因促進膽固醇合成并增加細胞外膽固醇的攝取，并促進膠質(zhì)瘤細胞的惡性生物學(xué)行為[17-18]。脂質(zhì)代謝與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，研究脂質(zhì)代謝對于膠質(zhì)瘤治療藥物的開發(fā)有著重要意義。

本研究結(jié)果顯示，人腦膠質(zhì)瘤組織的雙色熒光染色圖像具有類似HE染色的組織學(xué)特點，且能夠完整保留脂質(zhì)，同時與HE染色相比，診斷一致性基本滿意，診斷準確率、敏感度及特異度高。這表明可以通過雙色熒光染色圖像來進行病理組織學(xué)檢查，可以用于術(shù)中實時評估手術(shù)切緣，有助于醫(yī)生制定手術(shù)策略。雙色熒光染色圖像對于病理科醫(yī)生來說容易理解，學(xué)習(xí)曲線短。有研究表明，與HE染色相比，LSCM診斷的前列腺癌的準確率為91%，ROC曲線下面積為0.884，靈敏度和特異度分別為83.33%、93.53%[19]，認為LSCM具有較好的應(yīng)用前景，可以將其作為快速檢查前列腺組織的工具。

綜上所述，我們認為，雙色熒光染色在膠質(zhì)瘤病理診斷中具有較好的應(yīng)用前景，可輔助手術(shù)醫(yī)生更好地制訂手術(shù)策略，提高膠質(zhì)瘤的全切除率及次全切除率，改善患者預(yù)后。同時，研究脂質(zhì)代謝有助于探索膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展、耐藥等機制，雙色熒光染色相對于完全去除了脂質(zhì)的HE染色來說，脂質(zhì)信息保存完整，可以進一步進行脂質(zhì)代謝相關(guān)研究。但雙色熒光染色尚存在熒光淬滅、染色時間長等問題，仍需進一步優(yōu)化技術(shù)，以期早日應(yīng)用于臨床。