基于生物信息學(xué)方法的沙眼衣原體主要外膜蛋白免疫優(yōu)勢表位預(yù)測及分析

李明洋，徐遠久，魯小龍，張雷，蘇惠婷，朱珊麗，張友秀

1四川大學(xué)華西廣安醫(yī)院檢驗科，四川廣安 638000；2溫州醫(yī)科大學(xué)分子病毒與免疫研究所微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室；3四川大學(xué)華西廣安醫(yī)院外圍手術(shù)室

沙眼衣原體是全球細菌性傳播感染和可預(yù)防性失明的主要病原體[1]。近年來，衣原體傳播感染性疾病的發(fā)病率迅速增加，以抗生素為主的治療策略效果不佳。疫苗作為保護和控制傳染性疾病最有效的手段，其既能誘導(dǎo)局部中和抗體以防止細胞外的病原體感染，又能誘導(dǎo)細胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)以靶向受感染細胞[1-2]。衣原體主要外膜蛋白（MOMP）疫苗是迄今為止發(fā)現(xiàn)的保護性最強的亞單位疫苗[3]。MOMP是存在于沙眼衣原體的原體和始體表面的跨膜蛋白，有四個對稱間隔的可變結(jié)構(gòu)域（VDs Ⅰ～Ⅳ），這些結(jié)構(gòu)域序列既是血清分型決定因素，也是中和抗體的體內(nèi)靶位點[4]。研究表明，MOMP的VD Ⅱ、Ⅳ介導(dǎo)沙眼衣原體黏附宿主細胞，具有較強的免疫原性，含多個潛在抗原表位，可作為重要的免疫原刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[5-6]。當沙眼衣原體持續(xù)性感染時，細胞內(nèi)沙眼衣原體部分蛋白表達發(fā)生改變，但MOMP表達量始終保持在較高水平，故MOMP很可能參與維持沙眼衣原體持續(xù)性感染狀態(tài)[7-8]。因此，開展沙眼衣原體MOMP的研究具有重要意義。2022年1月—6月，本研究運用生物信息學(xué)軟件預(yù)測并分析沙眼衣原體MOMP的蛋白結(jié)構(gòu)及免疫優(yōu)勢表位，為沙眼衣原體感染的診斷及高效表位疫苗的研制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 MOMP氨基酸序列獲取及理化性質(zhì)分析 登錄瑞士生物信息學(xué)UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），檢索E型沙眼衣原體MOMP的氨基酸序列信息。應(yīng)用EXPASY服務(wù)器（https：//www.expasy.org/tools）上的 ProtParam 工具，分析MOMP的氨基酸組成、不穩(wěn)定性指數(shù)等理化性質(zhì)。

1.2 MOMP的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 基于EXPASY服務(wù)器上的不同分析方法（SOPMA、GOR），在線預(yù)測MOMP的二級結(jié)構(gòu)，如α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。

1.3 MOMP的B細胞表位綜合分析 基于IEDB（http：//tools.iedb.org/main/bcell/）在線預(yù)測軟件，預(yù)測MOMP蛋白的親水性參數(shù)、表面可及性參數(shù)、抗原性參數(shù)、柔韌性參數(shù)和線性表位參數(shù)。結(jié)合各預(yù)測參數(shù)并用吳玉章等建立的抗原性指數(shù)（AI）[9]綜合分析其B細胞優(yōu)勢表位。

1.4 MOMP的細胞毒性T細胞（CTL）表位綜合分析 基于Net CTL（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/）、SYFPEITHI（http：//www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm）、IEDB（http：//tools.immuneepitope.org/main/）在線軟件，針對HLA-A*02：01、HLA-A*03及HLA-B*07：02類分子預(yù)測MOMP的CTL限制性表位。Net CTL篩選出 COMB＞1.0的九肽，SYFPEITHI篩選出Score＞21的九肽，IEDB篩選出IC50＜50 nmol/L的九肽。

1.5 MOMP的輔助性T細胞（Th）表位綜合分析基 于 SYFPEITHI、RANKPEP（http：//imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html）在線軟件，針對 HLADRB1*01：01、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*0801、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1501類分子預(yù)測MOMP的Th限制性表位。SYFPEITHI中篩選出Score＞21的結(jié)果，RANKPEP選取服務(wù)器默認結(jié)果。

1.6 MOMP的三級結(jié)構(gòu)分析 基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析服務(wù)器Galaxy（https：//galaxy.seoklab.org/index.html）在線建模分析MOMP的三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 沙眼衣原體MOMP氨基酸序列和理化性質(zhì) 經(jīng)ProtParam軟件分析，MOMP由393個氨基酸組成，分子式C1874H2916N498O583S21，序列編號P17451，氨基酸序列：MKKLLKSVLVFAALSSASSLQALPVGNPAEPSLMID GILWEGFGGDPCDPCTTWCDAISMRMGYYGDFVF DRVLKTDVNKEFQMGDKPTSTTGNATAPTTLTARE NPAYGRHMQDAEMFTNAACMALNIWDRFDVFCTL GASSGYLKGNSASFNLVGLFGDNENQSTVKTNSVP NMSLDQSVVELYTDTAFSWSVGARAALWECGCAT LGASFQYAQSKPKVEELNVLCNAAEFTINKPKGYV GQEFPLALIAGTDAATGTKDASIDYHEWQASLALS YRLNMFTPYIGVKWSRASFDADTIRIAQPKSATAIF DTTTLNPTIAGAGDVKASAEGQLGDTMQIVSLQLNK MKSRKSCGIAVGTTIVDADKYAVTVETRLIDER AAHVNAQFRF。MOMP結(jié)構(gòu)中占比居前四位的氨基酸分別為丙氨酸（Ala）、蘇氨酸（Thr）、亮氨酸（Leu）、甘氨酸（Gly），半胱氨酸（Cys）占比2.9%，易與分子間MOMP形成多聚體形式，維持空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。MOMP不穩(wěn)定性指數(shù)為25.82，蛋白性質(zhì)相對穩(wěn)定。MOMP總平均親水性為-0.088，為親水性蛋白[9]。

2.2 沙眼衣原體MOMP的二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果 應(yīng)用Expasy服務(wù)器上的SOMPA、GOR預(yù)測MOMP的二級結(jié)構(gòu)。SOMPA顯示其二級結(jié)構(gòu)由39.95%的α螺旋、18.83%的伸展鏈、37.40%的無規(guī)則卷曲、3.82%的β轉(zhuǎn)角構(gòu)成；GOR顯示其二級結(jié)構(gòu)由29.77%的α螺旋、18.32%的伸展鏈、51.91%的無規(guī)則卷曲構(gòu)成。綜合預(yù)測MOMP二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲為主，出現(xiàn)在23～31 aa、34～37 aa、44～51 aa、84～89 aa、92～99 aa、148～152 aa、171～178 aa、253～264 aa、305～310 aa、324～327 aa、351～356 aa；α 螺旋出現(xiàn)在 7～14 aa、16～21 aa、69～71 aa、111～127 aa、224～233 aa、266～280 aa、330～335 aa、346～351 aa、373～392 aa；少見β轉(zhuǎn)角。

2.3 沙眼衣原體MOMP B細胞表位分析結(jié)果基于IEDB服務(wù)器上的B細胞表位在線預(yù)測工具，MOMP的親水性系數(shù)、表面可及性參數(shù)、抗原性參數(shù)、柔韌性參數(shù)和線性表位預(yù)測結(jié)果見表1、圖1[10-12]。同時結(jié)合MOMP二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲可能存在的區(qū)段及抗原指數(shù)，綜合分析推測其B細胞表位可能存在的區(qū)域是MOMP的N端GFGGDPCDPCT （42～52 aa）、 DNENQSTVKTNSVPNMSLD（161～179 aa）、TGTKDAS（259～265 aa）和NKMKSRKSCG（349～358 aa）。

表1 沙眼衣原體MOMP B細胞表位的肽段位置預(yù)測結(jié)果

圖1 沙眼衣原體MOMP不同參數(shù)預(yù)測結(jié)果

2.4 沙眼衣原體MOMP限制性CTL表位預(yù)測分析結(jié)果 將MOMP序列輸入3種CTL表位分析軟件（Net CTL、SYFPEITHI、IEDB），選擇HLA-A*02：01、HLA-A*03及HLA-B*07：02類分子三種MHC Ⅰ限制類型，預(yù)測出MOMP的九肽CTL限制性表位。IC50＜50 nmol/L被認為是高親和力，且數(shù)值越低親和力越高[13]。針對每一種表型，篩選出各軟件預(yù)測分值均較高且有意義的肽段用作候選CTL表位，具體序列見表2。

表2 沙眼衣原體MOMP的候選CTL表位序列

2.5 沙眼衣原體MOMP Th表位預(yù)測分析結(jié)果 將MOMP序列輸入2種Th表位分析軟件（SYFPEITHI、RANKPEP），選擇 HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLADRB1*0801、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1501 類分子7種MHC Ⅱ限制類型，預(yù)測出MOMP的9個或15個氨基酸長度的Th限制性表位。針對每一種表型，篩選出各軟件預(yù)測分值均較高且有意義的肽段，用作候選Th表位[14]。具體序列見表3、表4。

表3 SYFPEITHI預(yù)測沙眼衣原體MOMP的候選Th表位序列

表4 RANKPEP預(yù)測沙眼衣原體MOMP的候選Th表位序列

2.6 MOMP三維結(jié)構(gòu)及功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果 綜合上述預(yù)測結(jié)果，選擇兼有多個表位的氨基酸區(qū)域P1（42～65 aa）、P2（155～185 aa）、P3（342～359 aa）作為免疫優(yōu)勢表位（圖2A）。在Galaxy WEB在線分析MOMP三級結(jié)構(gòu)，將上述預(yù)測的免疫優(yōu)勢表位P1、P2、P3標記于MOMP三維結(jié)構(gòu)中（圖2B）。P1區(qū)段氨基酸序列為GFGGDPCDPCTTWCDAISMRMGYY，P2區(qū)段為LVGLFGDNENQSTVKTNSVPNMSLDQSVVEL；P3區(qū)段為 QIVSLQLNKMKSRKSCGI。分析顯示，MOMP與其他孔蛋白相似，為桶狀三維結(jié)構(gòu)，候選表位位于桶狀結(jié)構(gòu)的表面，暴露性較好，易與抗體結(jié)合，在蛋白分子構(gòu)象上符合表位設(shè)計要求。

圖2 沙眼衣原體MOMP的免疫優(yōu)勢表位及三維結(jié)構(gòu)

3 討論

沙眼衣原體是一種專性細胞內(nèi)細菌，主要感染泌尿生殖系統(tǒng)和眼上皮細胞。在一些受感染的女性中，沙眼衣原體遷移到上生殖道，導(dǎo)致慢性無癥狀感染。目前還沒有用于預(yù)防沙眼衣原體的商業(yè)化疫苗，部分原因在于對感染期間沙眼衣原體引發(fā)特異性免疫反應(yīng)的認知不夠深入[2-3]。

沙眼衣原體MOMP能夠與宿主蛋白相互作用并抑制吞噬體與溶酶體融合，是疫苗開發(fā)的主導(dǎo)方向。MOMP是一類富含半胱氨酸的跨膜蛋白，具有孔蛋白功能，預(yù)測有天然的三聚體結(jié)構(gòu)，拓撲模型為β桶結(jié)構(gòu)。因此，很難獲得具有完整天然構(gòu)象表位形式的MOMP。最近報道，基于MOMP VD4區(qū)域開發(fā)的候選疫苗沙眼衣原體H522可誘導(dǎo)小鼠和人體產(chǎn)生中和抗體。但中和抗體是否足以為女性泌尿生殖道沙眼衣原體感染、發(fā)揮保護作用還有待觀察[15]。因此，設(shè)計表位疫苗最好能覆蓋沙眼衣原體的B細胞、CTL、Th表位，不僅可以解決免疫優(yōu)勢問題，還可以產(chǎn)生廣泛的免疫應(yīng)答。

B細胞被認為是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的核心組成部分，因為其具有識別和提供長期保護免受感染性病原體或腫瘤細胞侵襲的能力，通過產(chǎn)生抗體來執(zhí)行這些功能。我們通過IEDB服務(wù)器中的BepiPred2.0算法對沙眼衣原體MOMP抗原序列進行預(yù)測，結(jié)合其二級結(jié)構(gòu)、親水性等，從構(gòu)象及線性表位進行評估，推測沙眼衣原體MOMP可能的B細胞表位主要集中在MOMP的N端第42～52 aa、161～179 aa、259～265 aa、349～358 aa區(qū)段。這些區(qū)段多位于無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)中，發(fā)生扭曲、折疊的幾率較高，易與抗體嵌和[16]。

T細胞免疫療法可以識別并殺死受沙眼衣原體感染的細胞，為了實施這種療法，需要考慮到等位基因MHC Ⅰ（HLA）限制性，以更好地滿足絕大部分種族群體的抗原識別[17]。我們通過不同算法的MHC Ⅰ類分子在線預(yù)測工具，選擇了HLA-A*02：01、HLA-A*03、HLA-B*07：02類分子3種MHC Ⅰ限制類型，篩選出預(yù)測分值較高且有意義的沙眼衣原體CTL表位。最終獲得4個分值較高的HLA-A*02：01限制性表位（177～185 aa、280～288 aa、282～290 aa、318～326 aa）、4個分值較高的HLA-A*03限制性表位（57～65 aa、72～80 aa、342～350 aa、347～355 aa）、1個分值較高的HLA-A*03限制性表位（27～35 aa）。

同樣，為了使預(yù)測的Th表位有更好的受眾性，我們選擇亞裔抗原頻率較高的HLA-DRB1*01：01、HLA-DRB1*1501、HLA-DRB1*0801、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLADRB1*1101類分子，共7種MHC Ⅱ限制類型[18-20]。通過RANKPEP和SYFPEITHI兩種MHC Ⅱ類分子親和肽預(yù)測工具，分別預(yù)測9個、15個氨基酸長度的Th細胞表位。不同長度的候選Th表位肽中，兩種方法預(yù)測結(jié)果范圍比較接近。SYFPEITHI預(yù)測的表位數(shù)目較多，且涵蓋大部分RANKPEP所預(yù)測的九肽，僅在HLA-DRB1*0801表型，RANKPEP單獨預(yù)測出具有意義的Th細胞表位。

總之，本研究通過生物信息學(xué)方法對沙眼衣原體MOMP免疫表位進行預(yù)測分析，獲得3個免疫優(yōu)勢表位，位于蛋白N端的42～65 aa、155～185 aa區(qū)段和C端的342～359 aa區(qū)段，為沙眼衣原體篩選新的診斷抗原分子和候選疫苗抗原、拓寬免疫保護范圍提供了參考，但上述候選表位肽的實際應(yīng)用效果還有待于具體實驗確認。