宏基因二代測序在免疫低下宿主中肺炎診斷價值的研究

葉開婷 尤青海

由于癌癥及非惡性腫瘤等免疫低下宿主的生存期延長，免疫低下宿主面臨肺部感染的風(fēng)險人數(shù)正在增加。Harpaz R.等報道美國成年人中3%存在免疫低下[1]。大約20%到30%的CAP住院患者存在免疫低下情況[2-4]。對于免疫低下宿主肺部感染，明確病原體是一項挑戰(zhàn)，迫使臨床醫(yī)師經(jīng)驗性治療需采用廣譜抗生素及多藥聯(lián)合，難以達到精準(zhǔn)治療，也因此面臨多重耐藥、二重感染及不良事件風(fēng)險隨之增加，對于這些患者盡快明確病因?qū)W診斷是必要的。面對這些復(fù)雜疑難感染時，傳統(tǒng)檢查方式如培養(yǎng)，耗時長、陽性率低、診斷正確性有限，導(dǎo)致延誤或漏診。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，宏基因二代測序(mNGS)的價值逐漸被人們所認(rèn)識。對細菌、真菌、寄生蟲和病毒等進行鑒定和基因組特征分析，允許對病原體進行無偏倚的檢測[5]，在本研究中，對21例免疫低下宿主21份BALF樣本mNGS結(jié)果進行總結(jié)，分析病原體特點，通過結(jié)果間的差異來驗證mNGS在免疫低下宿主肺炎中診斷價值。

資料與方法

一、一般資料

回顧性分析2020年4月至2021年4月期間入住安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科患者病歷。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)年齡至少18歲;2)免疫低下宿主;3)因肺炎入住;4)入院48小時內(nèi)接受支氣管鏡檢查送檢BALF mNGS；5)mNGS檢測均送檢同一家檢測公司(本研究病例均送檢華大基因檢測)；6)BALF送檢mNGS同時留取部分標(biāo)本送往本院微生物實驗室進行革蘭染色涂片、抗酸染色、普通細菌培養(yǎng)+藥敏、真菌培養(yǎng)、G試驗、GM試驗等檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：HIV感染引起的免疫低下宿主予以排除。

二、診斷標(biāo)準(zhǔn)

免疫低下宿主定義[6]：活動性惡性腫瘤，不包括局部皮膚癌或早期癌癥患者；腫瘤化療患者；實體器官移植或造血干細胞移植患者；皮質(zhì)類固醇治療，每天20mg潑尼松或等劑量激素，連續(xù)14天，或累積劑量>600mg；生物免疫調(diào)節(jié)劑治療患者；正在使用免疫抑制藥物；CD4+T淋巴細胞絕對數(shù)<200個/ul或百分比小于14%。

mNGS結(jié)果解讀：由于缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，臨床中，當(dāng)滿足以下至少1條標(biāo)準(zhǔn)，可考慮mNGS檢測的微生物為致病原[7-8]：1) 培養(yǎng)或組織病理檢測等與mNGS均提示同種微生物，有關(guān)于該致病原致病性的文獻依據(jù)；2) 在種/屬水平上檢測到細菌、真菌或病毒序列數(shù)≥50，對于序列數(shù)<50的，與患者臨床相符，仍可考慮為致病原；3) 分枝桿菌復(fù)合群至少一個序列數(shù)即可考慮；4) 經(jīng)精準(zhǔn)的抗生素治療后患者病情好轉(zhuǎn)。

臨床綜合診斷：兩名醫(yī)師獨立審核所有患者的病例，首先確定是感染性還是非感染性。其次，根據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)、微生物檢查(培養(yǎng)、病理和mNGS)、抗生素治療反應(yīng)等確定致病原。兩名醫(yī)師之間的任何分歧需通過深入討論解決，如果不能達成共識，則咨詢另一名級別更高醫(yī)師。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用配對卡方檢驗和Fisher確切概率法檢驗mNGS和培養(yǎng)方法，P值<0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計分析使用SPSS 22.0進行。

結(jié) 果

一、患者基本信息及臨床特征

入組患者21例中男11例，女10例，年齡中位數(shù)61歲(34～93歲)。21例患者均有基礎(chǔ)疾病，惡性腫瘤晚期13例(肺癌5例、食管癌3例、胃癌2例、直腸癌1例、乳腺癌1例、前列腺癌1例)、結(jié)締組織病3例(皮肌炎1例、系統(tǒng)性紅斑狼瘡2例)、腎病綜合征2例、3例長期使用激素(腎上腺腺瘤術(shù)后1例、慢性阻塞性肺疾病1例、間質(zhì)性肺病1例)。病變范圍雙肺病變20例(95%)，單肺病變1例(5%)。呼吸衰竭20例(95.2%)，其中14例接受機械通氣治療。肺部感染19例(90.5%)，其中混合感染11例(57.9%)、非混合感染8例(42.1%)。非感染2例(9.5%)。結(jié)合mNGS結(jié)果，維持原方案2例，停用抗生素2例，更換抗生素17例。經(jīng)治療14例好轉(zhuǎn)，4例放棄治療，3例死亡。患者基礎(chǔ)疾病及臨床特征總結(jié)(見表1)。

表1 患者基礎(chǔ)疾病及臨床特征

二、mNGS檢測結(jié)果

19例感染患者中，mNGS均檢測出病原體。最常見病原體為PJ，其次為煙曲霉、放線菌、CMV、念珠菌等。10例PJ，其中PJ混合CMV及其他真菌2例，PJ混合CMV 1例，PJ混合其他真菌1例，PJ混合真菌、細菌及結(jié)核分枝桿菌1例，PJ混合惠普爾養(yǎng)障體1例，PJ混合放線菌及其他口腔定植菌1例，單純PJ 3例。4例檢測出放線菌，單純放線菌1例，放線菌混合微小微單包菌2例。煙曲霉5例，念珠菌3例。2例非感染患者mNGS結(jié)果陰性。

三、mNGS與培養(yǎng)比較

患者培養(yǎng)及mNGS檢測結(jié)果(見表2)。

表2 患者培養(yǎng)及mNGS檢測結(jié)果

mNGS檢測陽性率與培養(yǎng)相比其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.09，P=0.01)(表3)，其中mNGS陽性率90.5%，培養(yǎng)陽性率38.1% (P=0.01)。餅圖顯示了21例用mNGS法和常規(guī)培養(yǎng)檢測病原體的陽性陰性分布(圖1)。在雙陽性亞群中，完全一致1例(1/21,4.8%)，部分一致4例(檢測中發(fā)現(xiàn)的病原體至少有1種被另一種確認(rèn))(4/21,19.0%)，不一致3例(3/21,14.3%)。而與13例培養(yǎng)陰性(13/21,61.9%)相比，11例(11/21,52.4%) mNGS檢測出致病原(11/13,84.6%)。

表3 mNGS與培養(yǎng)兩種方法比較

圖1 培養(yǎng)與mNGS一致性對比

討 論

mNGS目前臨床主要用于對無菌體液的病原體評估，包括腦脊液、血液和關(guān)節(jié)積液[7]，于痰液、BALF等非無菌體液應(yīng)用數(shù)據(jù)有限，且缺乏關(guān)于mNGS在免疫低下宿主肺炎中的應(yīng)用研究。本研究中免疫低下患者出現(xiàn)肺炎時，多合并呼吸衰竭，病情危重，入院時均已經(jīng)驗性應(yīng)用抗生素，此時獲得最佳下呼吸道標(biāo)本及快速明確病原體，對預(yù)后至關(guān)重要，肺泡灌洗術(shù)耐受性好，操作簡單、安全，BALF與痰或誘導(dǎo)痰相比有以下優(yōu)點：代表肺泡水平的成分；通過精細的支氣管鏡檢查避免口咽菌群的污染；在無咳嗽或干咳的重癥患者中易于獲得[9]。研究表明，肺泡灌洗術(shù)對免疫低下肺炎患者病原鑒定具有價值[10]。 目前大多數(shù)的mNGS平臺都能夠在24～72小時(平均48小時)內(nèi)完成從采樣到最終結(jié)果的分析[11-13]。此外，mNGS受先前已使用抗生素的影響較小[14]。

在本研究中，mNGS在19例感染患者中成功鑒定病原體，且混合感染11例(57.9%)，mNGS陽性率達100%，與 Li Ying等研究結(jié)果一致[8]。檢測出最常見病原體為PJ，因Wright-Giemsa染色涂片未常規(guī)進行，臨床常規(guī)微生物檢查未能檢出該致病原。據(jù)報道，在非艾滋病患者中，耶氏肺孢子菌肺炎患病率從0到11%不等[15]。而在非艾滋病免疫低下宿主，由PJ引起的肺炎發(fā)病率尚不確定。19例免疫低下宿主肺部感染中，PJ占52.6%，引起我們對其在免疫低下宿主中導(dǎo)致肺炎的關(guān)注。此外在混合感染中，以PJ混合CMV或其他真菌為常見共病原體。

與培養(yǎng)陰性相比，mNGS在84.6%培養(yǎng)陰性樣本中識別出致病原；與培養(yǎng)陽性相比，mNGS鑒定出更多的致病原。培養(yǎng)未能檢出這些病原體的可能原因：PJ需要特殊染色，嗜肺軍團菌培養(yǎng)條件苛刻，煙曲霉培養(yǎng)時間較長，微小微單包菌、放線菌屬中衣氏放線菌、牙齒放線菌等為厭氧菌，此外已使用抗生素降低培養(yǎng)敏感性。與培養(yǎng)相比，mNGS在檢測厭氧菌和苛求菌方面具有優(yōu)勢。4例患者中檢出厭氧菌，主要為放線菌、微小微單包菌、斯卡多維菌，常見于人類口腔，與牙周病及齲齒相關(guān)。肺放線菌病國內(nèi)外多有報道，相對放線菌，微小微單包菌引起肺部感染較少報道，Poetter C.等報道了1例微小微單包菌引起的膿胸[16]，F(xiàn)ernando等分析了31例微小微單包菌引起的口腔外其他部位感染包括椎體、心臟瓣膜、關(guān)節(jié)、胸膜、肺等[17]。Sang等報道1例放線菌和微小微單包菌共同感染引起肺膿腫呼吸衰竭，微小微單包菌對青霉素、阿莫西林、克林霉素敏感，明確診斷后抗生素由初始頭孢曲松聯(lián)合克林霉素改為氨芐西林-舒巴坦，患者較前恢復(fù)顯著[18]。因此對于免疫低下宿主，需重視放線菌、微小微單包菌等引起下呼吸道感染。

隨著腫瘤患者免疫治療應(yīng)用，免疫檢查點抑制劑相關(guān)性肺炎隨之增加，以及結(jié)締組織病累及肺，治療需激素及免疫抑制劑，首先需排除感染。本研究中19例感染患者BALF mNGS均陽性，2例非感染患者BALF mNGS均陰性，分別診斷為免疫檢查點抑制劑相關(guān)性肺炎、彌漫性肺泡出血。BALF mNGS檢測具有良好的排除感染價值。

mNGS的應(yīng)用提高了肺部真菌感染診斷敏感性。19例感染患者中mNGS檢出真菌14例(73.7%%)，10例患者檢出PJ、5例檢出煙曲霉、3例檢出念珠菌，常規(guī)培養(yǎng)僅檢出3例念珠菌(14.3%)。Miao Qing等系統(tǒng)比較了mNGS和培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)mNGS在檢測真菌方面具有較高的可行性(OR, 4.0 [95% CI, 1.6～10.3];(P<0.01)[14]。在我們的結(jié)果中，5例煙曲霉感染，經(jīng)mNGS鑒定均為陽性，培養(yǎng)均陰性。5例中4例mNGS檢出煙曲霉序列數(shù)均低于50，考慮煙曲霉細胞壁較硬，在核酸提取過程中，難以溶解，可能導(dǎo)致核酸產(chǎn)率低。因此對于免疫低下宿主，mNGS檢出煙曲霉，即使序列數(shù)較少，仍應(yīng)考慮煙曲霉感染可能。值得注意的是，本研究中20號患者BALF培養(yǎng)為熱帶念珠菌，而mNGS結(jié)果為光滑念珠菌，由于念珠菌不同物種間基因組DNA同源性較高，考慮mNGS檢測的是核酸片段，可能導(dǎo)致mNGS對念珠菌特異性物種的鑒定不準(zhǔn)確，因此在此例患者，以培養(yǎng)結(jié)果為準(zhǔn)。

本研究尚存在的一些不足之處，首先，本研究樣本量較小，其次沒有進行全基因組RNA測序，最后，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)相比，mNGS的一個主要缺點是未能測定致病原的抗生素耐藥性。在可預(yù)見的將來，mNGS的耐藥基因數(shù)據(jù)庫可以解決這一問題。