稻蟹共作田不同生育期水稻根際土壤細菌群落結構和功能分析

許忠偉 劉春月 石佳悅 邵霞 宋宇

（遼東學院，遼寧 丹東 118003；第一作者：2020358115@qq.com；*通訊作者：763869365@qq.cm）

土壤微生物是自然系統(tǒng)和管理生態(tài)系統(tǒng)的關鍵組成部分[1]。植物可依靠根系和土壤微生物之間的相互作用來促進其營養(yǎng)吸收。根際是根的表面和貼近根的周圍的土層，受植物根系分泌物、脫落物和植物殘體等影響，是植物、土壤和微生物的連接紐帶，內含不計其數(shù)的微生物，是地球上最活躍的界面之一。在農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，根際微生物群對作物生長、營養(yǎng)和健康有著深刻的影響[2]。隨著高通量測序技術的發(fā)展，常規(guī)種植的水稻根際微生物群落得到了一定研究[3]。人們通過在稻田中引入魚、小龍蝦、鱉等生物進行稻田復合種養(yǎng)，不僅改善了農田環(huán)境、滿足了人們對綠色安全稻米的需求，而且還有助于解決長期大量使用化肥農藥所造成的環(huán)境污染、土壤肥力下降和藥物殘留等一系列問題[4-5]。目前對共作稻田的研究主要集中在對稻田水體環(huán)境、病蟲害防治、水稻產量、某個特定生長時期根際微生物群落結構的影響上以及不同稻田共作模式對表層土壤細菌群落結構的影響及多樣性分析等方面[6-12]，對稻蟹共作田根際細菌群落在水稻不同生育期的變化規(guī)律知之甚少。為此，作者設計了本試驗，以期為水稻不同生育期專用菌劑開發(fā)奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗方法

以粳稻品種越光為試驗材料，試驗地點設在遼寧省東港市北井子鎮(zhèn)蓋家壩農場，試驗稻田面積700 m2。水稻于2020 年5 月10 日進行移栽，栽插規(guī)格30 cm×15 cm。于3 月份和7 月份施用日照益康有機農業(yè)科技發(fā)展有限公司生產的海藻生物有機肥，用量均為1.35 kg/hm2。4 月末投放河蟹苗，投放量為 0.5 kg/hm2，10 月末收蟹。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 土壤樣品采集與處理

分別在水稻分蘗期（6 月 29 日）、拔節(jié)期（7 月 31日）、抽穗期（9 月 2 日）和成熟期（10 月 15 日）在稻田上隨機選取5個點，采用破壞性取樣法將水稻整株挖出，勿傷害根系，抖落大塊土壤后用無菌刷刷取根際區(qū)域約5 mm 緊密粘附在根表面的土壤，每5 株為1個重復，每個時期3 次重復?；旌虾蟮臉悠贩殖蓛煞荩环菅b入密封袋，帶回風干處理，用于理化指標分析；一份裝入50 mL 離心管中，于-80℃溫度下冷凍保存，用于微生物多樣性分析。稻蟹共作田的分蘗期、拔節(jié)期、抽穗 期 和成熟 期 分別 用 HXTFN、HXTBJ、HXTCHS 和HXTCS 表示。

1.2.2 土壤理化因子

土壤pH 值采用酸度計法測定；有機質測定采用重鉻酸鉀氧化-分光光度法；速效鉀測定采用氯化鈣浸提-火焰光度計法；速效磷測定采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法；全氮測定采用凱氏定氮法[13]。

1.2.3 土壤樣品總DNA 提取、PCR 擴增及高通量測序

利用FastDNA?Spin Kit for Soil 試劑盒進行基因組DNA 提取，擴增引物為338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG；806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。PCR擴增程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃45 s，27個循環(huán)；72 ℃ 10 min；PCR 產物經鑒定、純化、定量和Miseq 文庫構建后，利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺進行測序。

1.3 數(shù)據處理

利用Trimmomatic[14]軟件對MiSeq 高通量測序得到的Raw Data 的雙端序列數(shù)據進行去雜，使用 FLASH（1.2.11）[15]軟件進行拼接。再通過 QIIME（1.9.1）[16]軟件進行質控和usearch[17]軟件去除嵌合體序列即得到優(yōu)質序列。利用Uparse（version 7.1）軟件按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行OTU 聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU 的代表序列。采用RDP classifier（version 2.1.1）貝葉斯算法對97%相似水平的OTU 代表序列進行分類學分析，并分別在各個分類學水平上對比Silva（Release132 數(shù)據庫），統(tǒng)計各樣本的群落物種組成。利用R 軟件生成組間OTU 維恩圖，利用 mothur（1.30.2）軟件計算 α 多樣性指數(shù)[18-20]，利用SPSS 26.0 軟件進行數(shù)據統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同生育期水稻根際土壤理化因子

如表1 所示，稻蟹共作田在不同生長時期根際土壤的理化因子都有所變化，成熟期的pH 值最高，與拔節(jié)期差異顯著。分蘗期和拔節(jié)期速效磷的含量與抽穗期和成熟期差異顯著。速效鉀含量隨水稻的生長發(fā)育逐漸降低，有機質和全氮含量都是抽穗期最高且與成熟期差異顯著。

表1 稻蟹共作田不同生育期水稻根際土壤理化因子

2.2 不同生育期根際土壤細菌群落豐富度和α 多樣性指數(shù)

從表2 可以看出，稻蟹共作田的4個生育期的覆蓋度均超過0.960，接近于1，說明高通量測序到達一定深度，可以說明結果的準確性。稻蟹共作田的4個生育期12個樣本共獲得444 882個有效序列，樣本的有效序列在分蘗、拔節(jié)、抽穗和成熟期分別讀取了28 311 ±3 377、40 166±6 952、44 800±8 099 和 35 017±10 099。獲得6 637個OTU，其中，抽穗期獲得的有效序列數(shù)和OTU 數(shù)均超過另外 3個時期。Chao1 和 Shannon 指數(shù)均可作為α 多樣性指數(shù)的度量指標，Chao1 指數(shù)可用來計算菌群豐度，其值越高，代表菌群的豐度值越大，菌群的物種總數(shù)越多；Shannon 指數(shù)是計算菌群多樣性的指數(shù)，其值越大，說明群落多樣性越高。從表2 可以看出，河蟹稻田4個生育期的Chao1 指數(shù)表現(xiàn)為抽穗期＞拔節(jié)期＞成熟期＞分蘗期，Shannon 指數(shù)4個時期差別不大，說明隨著水稻的生長發(fā)育，根際微生物的物種總數(shù)會發(fā)生變化但菌群的多樣性變化不明顯。

表2 稻蟹共作田不同生育期根際土壤細菌群落豐富度和α 多樣性指數(shù)

2.3 不同生育時期根際土壤細菌群落比較

圖1 為稻蟹共作田不同生育期PCA 分析圖。PCA分析即為主成分分析，可通過樣本間距離的遠近來說明細菌群落的相似性或差異性。PC1 軸和PC2 軸對結果的解釋度分別為38.33%和19.52%，從圖1 可以看出，拔節(jié)期和抽穗期距離較近，說明細菌群落相似性較高，它們和分蘗期及成熟期以及分蘗期和成熟期之間都有一定距離，說明隨著水稻的生長發(fā)育，細菌群落都在發(fā)生變化且有一定差異性。從圖2 可以看出，分蘗期、拔節(jié)期、抽穗期和成熟期的OTU 數(shù)分別為4 690、5 056、5 139 和 5 048。獨有的 OTU 數(shù)分別為 273、294、264 和 328個。4個時期共有的 OTU 數(shù)是 3 122個。隨著水稻的生長發(fā)育，OTU 數(shù)會增加，物種數(shù)量會增加，到成熟期OTU 數(shù)雖有所下降，但特有的OTU 數(shù)即特有的物種數(shù)最多。

圖1 不同生育期PCA 分析圖

圖2 不同生育期根際土壤細菌群落OTU 韋恩圖

2.4 不同生育期根際土壤細菌群落結構分析

如圖3 所示，基于高通量測序，所有樣品中綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門(Actinobacteriota)、變形菌門（Proteobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteriota）所占比例較大，分別為 18.96%～28.44%、13.28%～22.90%、12.35%～19.52%和11.43%～14.20%，是稻蟹共作田根際土壤的主要菌群。此外，樣品中還檢測到擬桿菌門（Bacteroidota）、脫硫桿菌門（Desulfobacterota）、厚壁菌門（Firmicutes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirota）、Myxococcota、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）、MBNT15、疣微菌門（Verrucomicrobiota）和髕骨菌門（Patescibacteria）等。綠彎菌門的相對豐度隨著水稻的生長發(fā)育呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，分蘗期最低，抽穗期最高；放線菌門則呈現(xiàn)逐步下降的趨勢，分蘗期最高而成熟期最低；變形菌門是逐漸下降又升高的態(tài)勢，抽穗期最低而成熟期最高；酸桿菌門則呈現(xiàn)先升高又下降的趨勢，分蘗期最低而拔節(jié)期最高；脫硫桿菌門的相對豐度呈現(xiàn)先下降再逐步升高的趨勢，拔節(jié)期最低而成熟期最高；芽單胞菌門的相對豐度在分蘗期最高而成熟期最低；髕骨菌門的相對豐度則在分蘗期最低而成熟期最高。如圖4 所示，樣品中檢測到的優(yōu)勢菌屬（相對豐度＞1%）有31個。在所有菌屬中norank_f_norank_0_norank_c_KD4-96 的相對豐度最高，其隸屬于綠彎菌門KD4-96 綱，在水稻4個生育時期中，其抽穗期相對豐度最高而成熟期最低。norank_f_norank_0_SBR1031 隸屬于綠彎菌門厭氧繩菌綱，分蘗期的相對豐度最低而抽穗期最高。norank_f_Bacteroidetes_VadinHA17 隸屬于擬桿菌門擬桿菌綱，分蘗期的相對豐度最低而成熟期最高。基于樣品中群落豐度數(shù)據，運用Kruskal-Wallis 秩和檢驗方法檢測不同樣本微生物群落中表現(xiàn)出的豐度差異的物種，結果顯示，基于細菌群落門水平上，綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門 (Actinobacteriota)、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）、脫硫桿菌門（Desulfobacterota）、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）和髕骨菌門（Patescibacteria）在稻蟹共作田4個生育期內的豐度差異顯著（圖5）。在優(yōu)勢菌屬中，norank_f_norank_0_norank_c_KD4 -96、norank_f_norank_0_SBR1031、norank_f_Bacteroidetes_VadinHA17 等3個菌屬的豐度差異顯著（圖 6）。

圖3 不同生育期根際土壤門水平細菌群落組成

圖4 不同生育期根際土壤屬水平細菌群落組成

圖5 細菌群落門水平Kruskal-Wallis 秩和檢驗圖

圖6 細菌群落屬水平Kruskal-Wallis 秩和檢驗圖

2.5 不同生育期根際土壤PICRUSt 功能預測

針對KEGG pathway, 運用PICRUSt 軟件獲得稻蟹共作田不同生育期根際土壤的3個水平信息及其豐度，Pathway level 1 有 7 條代謝通路，Pathway level 2 有46 條代謝通路，Pathway level 3 有371 條代謝通路。在稻蟹共作田的不同生育期細菌群落的代謝通路都相似，但代謝通路的豐度值不同。其中有269 條代謝通路的豐度值是抽穗期高于其他3個時期。有50 條代謝通路存在顯著差異（圖7），尤其在氨基酸生物合成（Biosynthesis of amino acids）、 碳 代 謝（Carbon metabolism）、核糖體 （Ribosome）、ABC 轉運器（ABC transporters）、嘌呤代謝（Purine metabolism）、群體感應（Quorum sensing）等方面差異更為顯著，說明抽穗期具有較強的代謝能力。

圖7 代謝通路熱圖

3 討論與結論

本研究利用Illumina MiSeq 高通量測序技術通過對16SrRNA 基因的V3～V4 高變區(qū)的測序分析，成功獲得了稻蟹共作田4個生育期根際土壤細菌群落較全面的菌群信息。樣本共得到444 882個有效序列，6 637個OTUs，測序讀長在401～440 bp 之間，平均測序長度在 415 bp 左右。可分為 54個門，171個綱，381個目，600個科，1 028個屬，2 162個種。其中，分蘗期的 OTU數(shù)最少，為4 690個，分別比拔節(jié)期、抽穗期和成熟期減少7.80%、9.57%和7.63%。Venn 圖表明稻蟹共作田4個生育期根際土壤細菌群落之間共有的OTU 數(shù)是3 122個，分蘗和拔節(jié)期共有的OTU 數(shù)是3 828個，分蘗期和抽穗期共有的OTU 數(shù)是3 901個，分蘗期和成熟期共有的OTU 數(shù)是3 717個，拔節(jié)期和抽穗期共有的OTU 數(shù)是4 121個，抽穗期和成熟期共有的OTU 數(shù)是4 021個，說明抽穗期和拔節(jié)期共有的細菌類群最多。α多樣性分析表明在稻蟹共作田的4個生育期的Shannon 指數(shù)差異不明顯，抽穗期的Chao1 指數(shù)高于其他3個時期，說明抽穗期的細菌物種總數(shù)最多而4個時期種群的豐富度差異不大。PCA 分析表明，拔節(jié)期和抽穗期細菌群落相似度高，但這2個時期和其余2個時期的細菌群落都有一定差異。

研究表明，植物根際中存在的大量微生物是參與根際微域活動的主要成員[21]。它們和植物相互作用，可調控土壤微生物的群落結構和豐度的變化[22]。稻蟹共作田不同生育期的土壤根際細菌優(yōu)勢門（相對豐度＞10%）、優(yōu)勢屬（相對豐度＞1%）基本相同。土壤細菌優(yōu)勢門（相對豐度＞10%）是綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteriota），優(yōu)勢菌屬（相對豐度＞1%）有 31個。有研究證實，稻田中含氮量提升后可使綠彎菌門的豐度上升[23]，稻蟹共作田4個生長時期水稻根際土壤的全氮量是抽穗期最高，綠彎菌門的相對豐度在抽穗期也最高。吳晶[24]研究表明，放線菌門與稻田中速效鉀含量正相關。本研究中，水稻根際土壤中速效鉀的含量隨著水稻的生長發(fā)育逐漸下降，放線菌門的相對豐度也呈現(xiàn)相同的趨勢，分蘗期豐度最高、成熟期最低。王寧等[25]研究證實，變形菌門與pH 值正相關，成熟期的pH 最高，變形菌門的相對豐度也是在成熟期最高。研究證實，酸桿菌門與pH 值負相關[26]，拔節(jié)期的pH 值最低而酸桿菌門在拔節(jié)期的相對豐度最高。

土壤微生物通過參與土壤有機質分解和礦化等過程來影響土壤養(yǎng)分循環(huán)，并調節(jié)土壤的功能[27]。利用PICRUSt 方法對菌群代謝功能預測, 稻蟹共作田不同生育期在3個代謝水平通路上都是相似的，有50 條代謝通路存在顯著差異，269 條代謝通路的豐度值是抽穗期高于其他3個時期。高通量測序結果顯示，抽穗期獲得的有效序列數(shù)、OTU 數(shù)和Chao1 指數(shù)在4個生育時期中最多，說明該時期的物種總數(shù)最多，而且群落門水平的柱形圖顯示，綠彎菌門在抽穗期的豐度最高，研究已證實綠彎菌的營養(yǎng)方式極為多樣，可涵蓋已知的所有類型。化能異養(yǎng)是綠彎菌門微生物的主要營養(yǎng)方式，除此之外還包括化能自養(yǎng)、光能自養(yǎng)、光能異養(yǎng)及混合營養(yǎng)型。同一物種可隨外界條件的改變切換所需要的不同營養(yǎng)模式，因此使得綠彎菌門可以驅動自身各種代謝與外界物質交換來獲取和利用能源、碳源等來參與了C、N、S 等一系列重要生源元素的生物地球化學循環(huán)過程[28]。所以抽穗期的代謝功能最強。

稻蟹共作田不同生育期水稻根際土壤細菌群落結構和功能分析結果表明，抽穗期的細菌物種數(shù)目最多且代謝功能最強。