不同方法處理對(duì)梔子屬植物花粉形態(tài)的影響

夏詩(shī)琪，陳宜均，李 婷，李康琴，鄧紹勇★

(1.江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌330013；2.國(guó)家林業(yè)草原梔子工程技術(shù)研究中心，江西 南昌330013)

植物花粉是攜帶大量的遺傳信息的雄性生殖細(xì)胞，是植物生長(zhǎng)、遺傳、變異的基礎(chǔ)[1-2]?；ǚ坌螒B(tài)具有很強(qiáng)的遺傳保守性和穩(wěn)定性，其固有的輪廓，紋飾，萌發(fā)孔數(shù)目、位置等特征反映物種獨(dú)特的生物信息，利用這些固有特征進(jìn)行分類鑒定，具有十分重要的科學(xué)價(jià)值[3-4]。國(guó)內(nèi)外的許多學(xué)者對(duì)肉蓯蓉（Cistanche deserticola）、桉樹（Eucalyptus robusta）、泡桐（Paulownia fortunei）等花粉形態(tài)進(jìn)行了觀察，為品種的分類鑒定、親緣關(guān)系等提供了數(shù)據(jù)支撐[5-7]?；ǚ哿ｓw積小，單純通過普通光學(xué)顯微鏡無法觀察到花粉的外壁紋飾，而外壁紋飾多樣，是植物分類及鑒定的重要性狀[8-9]。因此具有高分辨率、直觀立體的掃描電鏡是研究花粉形態(tài)的重要工具。用掃描電鏡觀察時(shí)，最好用新鮮的花粉制備樣品，但是由于制樣時(shí)間長(zhǎng)，花粉離體時(shí)間太久會(huì)影響花粉的微觀形態(tài)[10-11]，因此選用合適的電鏡樣品制備方法尤為重要。通過查閱文獻(xiàn)，常用的電鏡樣品制備方法有常規(guī)生物電鏡制備、直接干燥法制備、導(dǎo)電雙面膠帶拉斷法、新鮮材料直接噴金等。導(dǎo)電雙面膠帶拉斷法可以觀察到花粉內(nèi)部，但是對(duì)操作人員的技術(shù)要求嚴(yán)格[12]。新鮮材料直接噴金操作簡(jiǎn)單、節(jié)約時(shí)間，然而在樣品制備過程中可能影響花粉形態(tài)[13]。常規(guī)生物電鏡制備、直接干燥法制備最常用，因此該研究采用這兩種方法制備樣品，研究?jī)煞N不同制樣方法處理的效果，以期為相關(guān)研究人員在花粉電鏡樣品制備方法的選擇上提供參考。

全世界梔子屬(Gardenia)植物約250 種，分布于東半球的熱帶和亞熱帶地區(qū)。我國(guó)梔子屬植物種類較少，有6 種、1 變種，其中梔子(G. jasminoides)廣泛分布于長(zhǎng)江以南各省區(qū)，其他種野生分布區(qū)極其狹窄。近年來，本課題組采用數(shù)量分類、分子標(biāo)記等方法對(duì)梔子屬栽培品種與近緣種進(jìn)行分類研究[14-15]，然而，目前國(guó)內(nèi)幾乎沒有對(duì)不同類型梔子花粉的形態(tài)研究。作者以金福水梔（G. jasminoides‘Jinfu’）、狹葉梔子（G. stenophylla）、梔子和荷花梔子（G. jasminoides‘Hehua’）4 種梔子屬植物[16]的花粉為實(shí)驗(yàn)材料，采用常規(guī)生物電鏡制備和直接干燥法制備掃描電鏡樣品，觀察了4 種梔子花粉的微觀形態(tài)，為梔子花粉形態(tài)研究、本屬植物系統(tǒng)分類、親緣關(guān)系和系統(tǒng)演化方式提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

4 種梔子屬植物金福水梔、狹葉梔子、梔子和荷花梔子來自江西省林業(yè)科學(xué)院內(nèi)的梔子種質(zhì)資源基因庫(kù)基地。2020年5 月下旬剪取即將開放的4 種梔子屬植物的花枝，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行隔離水培，待花朵開放后取花粉進(jìn)行后續(xù)處理。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)生物電鏡樣品處理

取上述4 種梔子的花粉各1 份，分別裝在4 個(gè)離心管中, 各加入1.8 mL 戊二醛溶液(2.5%、pH=6.8)，4℃固定過夜；2000 r·min-1離心30 s，去掉上清液；于室溫條件下，用0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液(pH=7)漂洗沉淀物3 次，每次15 min；然后采用乙醇梯度洗脫法將樣品脫水處理（乙醇濃度分別為30%、50%、70%、80%、90%、100%），每個(gè)濃度處理15 min；用適量純丙酮處理2 次，每次20 min；樣品在通風(fēng)櫥中吹干去除殘留的丙酮；最后將花粉樣品用濾紙密實(shí)包裹，置于干燥器內(nèi)干燥。待花粉完全干燥后，制備電鏡樣品，步驟如下：用大小合適的導(dǎo)電膠帶輕輕粘取少量的花粉，吹掉表面未粘牢的多余花粉，避免花粉堆積影響電鏡觀察。

1.2.2 直接干燥電鏡樣品處理

取金福水梔、狹葉梔子、梔子和荷花梔子4 種梔子的花粉各1 份，將花粉樣品用濾紙密實(shí)包裹，于干燥器中干燥。待花粉完全干燥后，制備電鏡樣品，制備步驟同1.2.1。

1.2.3 電鏡觀察

將導(dǎo)電膠未粘住花粉的一面粘在樣品臺(tái)上，噴金處理后，用JFC-1600 型掃描電鏡觀察花粉的微觀形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.14 種梔子花粉結(jié)構(gòu)形態(tài)分析

花粉形態(tài)和大小比較：植物花粉可以分為單?；ǚ酆蛷?fù)合花粉（包括2 合、4 合、16 合等），梔子屬4 個(gè)種的花粉均為四合花粉，呈正四面體緊密排列（圖1）。極面觀可見1 粒在上，3 粒在下（圖1：A3、C3、E3、G3）；赤面觀兩粒在上，2 粒在下（圖1：A4、C4、E4、G4）。4 種梔子花粉四合體縫均較深，單粒花粉為球形或者近球形，四合花粉的相鄰單粒花粉孔相連，具3孔，呈120°等距離排列，呈裂縫狀，可見溝內(nèi)有萌發(fā)孔（圖1：C5），孔邊加厚。4 種梔子花粉形態(tài)無明顯差異，但是花粉大小和萌發(fā)孔尺寸有差異。狹葉梔子（39.5～40.4 μm×42.0～43.6 μm）花粉粒最大，其次是荷花梔子（35.2～38.6 μm×39.8～41.8 μm）、梔子（33.2～34.6 μm×36.0～41.6 μm）、金福水梔（35.2～36.0 μm×36.8～38.5 μm）。梔子萌發(fā)孔窄且長(zhǎng)，荷花梔子萌發(fā)孔短且寬，金福水梔和狹葉梔子的萌發(fā)孔大小居中。雖然花粉和萌發(fā)孔大小存在差異，但是這種差異不顯著，不足以作為種間和品種間的分類標(biāo)準(zhǔn)。

花粉外壁紋飾差異比較：梔子屬4 個(gè)種的花粉雖然在形狀、結(jié)構(gòu)上極為相似，但是外壁紋飾上存在一定差異。在放大1800 倍的掃描電鏡下，可觀察到花粉表面有細(xì)密瘤狀顆粒突起，形狀大小不一（圖1：A5、C5、E5、G5）；梔子花粉外壁瘤狀顆粒較小、致密、均勻，荷花梔子花粉外壁瘤狀顆粒較大、稀疏、不均勻。

總之，這4 種梔子花粉的形狀、結(jié)構(gòu)很相似，具有屬的共同特性。但是在花粉粒大小，萌發(fā)孔的長(zhǎng)度和寬度、表面瘤狀顆粒大小上存在差異。本研究認(rèn)為，花粉粒大小、萌發(fā)孔的長(zhǎng)度和寬度等差異不顯著，梔子花粉外壁紋飾差異明顯且直觀；外壁紋飾可作為重要的孢粉學(xué)指標(biāo)之一，用于分析梔子屬植物分類情況。

2.2 兩種不同方法處理的效果分析

整體上，可以看到兩種不同方法處理的梔子屬植物花粉結(jié)果存在明顯差異。采用常規(guī)生物電鏡樣品制備方法制備的梔子屬花粉粒飽滿、無皺縮變形，萌發(fā)孔清晰可見，外壁瘤狀顆粒均勻，紋飾明顯（圖1：A1-A5、C1-C5、E1-E5、G1-G5）。采用直接干燥處理的梔子屬花粉粒仍具有四面體結(jié)構(gòu)，極面觀1 粒在上，3 粒在下（圖1：B3、D3、F3、H3），赤面觀2 粒在上，2 粒在下（圖1：B4、D4、F4、H4）。然而單?；ǚ勖黠@塌陷、皺縮、變形，四合體縫加深，萌發(fā)孔由于擠壓呈閉合狀態(tài)，外壁瘤狀顆粒變大、粗糙且不均勻。

圖1 不同方法處理下4 種梔子花粉形態(tài)掃描電鏡結(jié)果Fig. 1 SEM images of pollens of 4 Gardenia species under different treatments

3 討論

被子植物的種類遠(yuǎn)較裸子植物的多，因而花粉類型也更為多樣化，根據(jù)花粉粒的存在形式，有無萌發(fā)孔，以及萌發(fā)孔的形態(tài)、位置、數(shù)目等特征，可分為復(fù)合花粉、具多孔溝、具散孔等十幾種[17]。本研究經(jīng)掃描電鏡觀察，4 種梔子屬植物金福水梔、狹葉梔子、梔子和荷花梔子的花粉形態(tài)為四合花粉，正四面體結(jié)構(gòu)，花粉為近球形或球形，具3 孔，表面具瘤狀顆粒突起，其輪廓形態(tài)特征基本一致。植物花粉形態(tài)通常是由基因控制，受到環(huán)境各因子的影響很小，相對(duì)比較穩(wěn)定。本研究4 種梔子花粉外觀形態(tài)無明顯差異，差異體現(xiàn)在花粉大小上，該差異較小，無法作為分類標(biāo)準(zhǔn)，究其原因，一是所測(cè)量的種和個(gè)體較少，無法代表群體表現(xiàn)，二是電鏡拍攝花粉的極面不完全一致，三是與花粉新鮮程度、處理時(shí)間長(zhǎng)短、處理方式有關(guān)。然而梔子花粉外壁紋飾差異明顯，可以通過外壁紋飾分析梔子屬植物分類情況。因此，外壁紋飾可作為重要的孢粉學(xué)指標(biāo)之一，這與張雅瓊[18]等人的研究結(jié)果一致。

掃描電鏡由于具有高分辨率，圖像立體直觀等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛運(yùn)用于植物孢子微觀形態(tài)的觀察[19]。對(duì)花粉的干燥處理是樣品制備的關(guān)鍵，直接影響掃描電鏡的結(jié)果。對(duì)于某些外壁較厚且含水量低的花粉，采用操作簡(jiǎn)單的干燥處理法即可滿足研究需要。而本研究中，相比于常規(guī)生物電鏡樣品制備方法，直接干燥方法處理發(fā)現(xiàn)花粉形態(tài)、萌發(fā)孔、外壁紋飾均有不同程度的變形，會(huì)嚴(yán)重影響觀察者對(duì)花粉真實(shí)形態(tài)及差異性的分析。梔子屬花粉外壁薄且含水量高，直接干燥過程中水分會(huì)迅速流失，受到表面張力的作用，其表面結(jié)構(gòu)易發(fā)生塌陷、皺縮和變形[7]。常規(guī)生物電鏡樣品制備方法能將脫離了植物體的花粉及時(shí)用戊二醛固定處理，消除表面張力的影響，避免失水變形，以更好的維持花粉的微觀結(jié)構(gòu)[20]。不同種類植物花粉的外壁厚度和含水量差別較大，掃描電鏡樣品制備應(yīng)根據(jù)花粉的自身特性個(gè)性化制定，某些壁軟且薄的花粉容易變形，建議大批量制備電鏡樣品前，用常規(guī)生物電鏡樣品制備方法制樣觀察對(duì)比有無變形，避免實(shí)驗(yàn)材料的浪費(fèi)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差。