施茂寅,朱靈芝,黃麗莉,王 峰
(1.江西省林業(yè)科技推廣和宣傳教育中心,江西 南昌 330038;2.江西省林業(yè)科學(xué)院,江西 南昌 330013;3.石藥集團(tuán)江西金芙蓉藥業(yè)股份有限公司,江西 九江 332707)
枳殼為蕓香科柑橘屬植物酸橙(Citrus aurantium)及其栽培變種的未成熟果實,5-6 月收集自落的果稱為“枳實”,7-8 月收集的未成熟果稱為“枳殼”[1]。枳實味苦性涼,歸脾、胃經(jīng),可健脾破氣并能消除積食、祛痰除痞;臨床上經(jīng)常與其他藥物配伍使用,治療胃下垂、食積消化停滯、便秘腹痛不良癥狀[2]。枳殼其辛、苦、酸,性寒,入肺、脾、大腸經(jīng),為臨床常用的理氣藥,具有理氣寬中、行滯消脹等功效;主要用于治療胸脅氣滯、食積不化、高脂血癥等[3-6]?,F(xiàn)代藥理學(xué)表明,枳殼主要有胃腸道調(diào)節(jié)、抗抑郁、抗腫瘤、降血脂等功效,其功效主要與黃酮、生物堿、揮發(fā)油類等活性成分密切相關(guān)[7-11]。
枳殼主產(chǎn)于江西、四川、湖南、重慶、浙江等地,其中以江西枳殼的品質(zhì)為最佳,是江西省四大“道地藥材”之一[12],習(xí)稱江枳殼。枳殼在江西主要品種為贛南香橙果系和贛南臭橙果系。目前對枳殼來源之一的酸橙,主要研究集中在未成熟果實中的化學(xué)成分分析及藥效實驗上。有研究表明,隨著酸橙果實的成熟,酸橙活性成分的含量呈現(xiàn)一定的變化[13]。
良種選育主要考察指標(biāo)之一是遺傳的穩(wěn)定性。目前對于酸橙的研究主要集中在未成熟果實上,考察的主要指標(biāo)成分之一是黃酮類,如新橙皮苷和柚皮苷[1]。將此時的指標(biāo)成分作為良種選育的數(shù)據(jù)有一定的不準(zhǔn)確性。因此研究成熟果活性物質(zhì)的含量變化對于酸橙的良種選育具有重要意義。
該實驗選用贛南香橙果系、贛南臭橙果系幾種酸橙成熟果作為實驗對象,對主要活性成分之一總黃酮含量進(jìn)行分析,以便為酸橙的良種選育提供一定的數(shù)據(jù)支撐。同時通過酸橙中非藥用部位(果肉)的黃酮含量分析將其變廢為寶,提高贛南香橙果系、贛南臭橙果系的附加值;從果品中分離提取出更多的功能性成分,開發(fā)成系列高附加值產(chǎn)品,這些產(chǎn)品不僅用于藥用,也可用于食品、保健品、化妝品等領(lǐng)域。因此,酸橙成熟果的黃酮類含量分析不僅有助于酸橙的質(zhì)量控制和良種選育。也可為酸橙成熟果中化學(xué)成分的開發(fā)、評價等方面提供一定的理論依據(jù)。
蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司,批號:B20771,純度≥98%);甲醇(分析純,西隴科學(xué)股份有限公司);乙酸(AR,西隴化工股份有限公司);亞硝酸鈉(AR,天津市大茂化學(xué)試劑廠);三氯化鋁(AR,天津市大茂化學(xué)試劑廠);氫氧化鈉(AR,天津歐博凱化工有限公司)。實驗涉及其他試劑均為分析純。
實驗樣品共8 批(見表1),1 批酸橙未成熟果(枳殼)作為對照(YCR004),不同品種酸橙成熟果7 批,主要為贛南香橙果系和贛南臭橙果系,均于2021年采自江西道地產(chǎn)區(qū)新干縣黎山林場。
表1 不同酸橙品種信息Tab. 1 Information of different varieties of Citrus
AL104 電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司);KQ-600DB 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);中藥粉碎機(jī)(永康市金穗機(jī)械制造廠);ENXTN 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司);E-3000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA,OSB-2200)。
1.3.1 供試品溶液的制備
將8 個酸橙樣品用清水沖洗,晾干。分離果皮、果肉,用剪刀將果皮和果肉剪碎,置于烘箱中60℃干燥至恒重,粉碎,備用(樣品于室溫下密封避光保存)。
稱取上述各樣品5.0 g(精確到0.0001 g),置具塞錐形瓶中,加入15 mL 80%甲醇溶液,超聲提取1 h,冷卻,再稱重,用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量。將所有提取液置于離心機(jī),設(shè)置轉(zhuǎn)速為5000 r·min-1,溫度為4℃,離心時間為10 min,收集上清液,重復(fù)提取3 次,合并上清液至50 mL 容量瓶中,加80%甲醇溶液定容。移取提取液1 mL 于5 mL 容量瓶中,加80%甲醇至刻度,即得。
1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備
準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(105℃烘至恒重)0.0101 g,用甲醇定容于10 mL 容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度為1000 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)母液后,逐級稀釋,分別配制質(zhì)量濃度為31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 和1000.00 mg·L-1的蘆丁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。
1.3.3 總黃酮含量測定
采用NaNO2-AlCl3-NaOH 顯色法。移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5 mL 于10 mL 具塞干燥試管,加入0.1 mL 5% NaNO2和4 mL 水,搖勻,放置5 min 后,加入0.1 mL10%的AlCl3,放置6 min,加入3 mL 1 mol·L-1NaOH,混勻,10 min 后,分別取適量反應(yīng)后的溶液于比色皿中,在波長510 nm 處測定吸光度。
1.3.4 數(shù)據(jù)處理與分析
酸橙果皮和果肉中總黃酮含量采用“1.3.3 項”下方法測得吸光度,平行3 份,取平均值。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮含量。
根據(jù)“1.3.3 項”下方法測量蘆丁的吸光度,結(jié)果如表2 所示,并根據(jù)表中數(shù)據(jù)作圖(圖1)。
表2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab. 2 Standard curve of rutin
圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of rutin
根據(jù)表2 作圖,利用最小二乘法作線性回歸方程,得到吸光度A 與蘆丁濃度C (mg·L-1)之間的關(guān)系式,即A=0.0004C+0.0303,其中相關(guān)系數(shù)R2=0.9916。表明本測定方法中蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和吸光度在所示范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)性,故可作為總黃酮的測定方法。
吸取125.00 mg·L-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5 mL,一式6 份,按“1.3.3”項下測定方法進(jìn)行測定,在510 nm處測定吸光度,計算RSD值為1.67%,表明儀器精密度良好。
取XC002 的果皮粉末6 份,按“1.3.1”項下方法分別制備供試品溶液,按“1.3.3”項下測定方法分析,結(jié)果總黃酮平均含量為0.67%,計算出RSD為0.84%,說明該方法重復(fù)性良好。
取XC002 的果皮粉末1 份,按“1.3.1”項下方法分別制備供試品溶液,分別于溶液制備后的0、2、4、6、8、12、24 h 后按“1.3.3”項下測定方法分析;計算出RSD為2.53%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
稱取已知含量的XC002 果皮粉末,分別加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液各3 mL,平行3 份,按“1.3.1”項下方法制備供試品溶液,按“1.3.3”項下測定方法分析測定,計算各成分的加樣回收率及RSD,結(jié)果見表3,表明該方法準(zhǔn)確度良好。
表3 加樣回收率實驗結(jié)果Tab. 3 The results of recovery test
按“1.3.3”項下方法進(jìn)行測定,結(jié)果見表4。結(jié)果發(fā)現(xiàn):對同一品種而言(YCR004),未成熟果果皮和果肉中的黃酮含量均高于成熟果。不同品種成熟果酸橙果皮中總黃酮含量由高到低順序為:YTJ004>YCR004>ZX006>有刺-4>XC002>有刺-6>刺香橙,YTJ004 的果皮中總黃酮含量最高(1.72%),刺香橙果皮中總黃酮含量最少(0.06%);不同品種成熟果酸橙果肉中總黃酮含量由高到低順序為:有刺-6>XC002>YTJ004>刺香橙>YCR004>ZX006>有刺-4,有刺-6 果肉中總黃酮含量最高(1.08%),有刺-4 果肉中總黃酮含量最少(0.10%)。
表4 酸橙果皮、果肉中總黃酮的含量Tab. 4 Content of total flavonoids in peel and pulp of Citrus
贛南臭橙果皮總黃酮含量為0.56%~1.17%,果肉含量為0.46%~1.08%;贛南香橙果皮總黃酮含量為0.06%~1.72%;果肉含量為0.40%~0.49%。
利用SPSS 21.0 分析軟件進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果見圖2,同一品種酸橙中,果皮、果肉中總黃酮的含量均有顯著性差異(P<0.05)。對不同品種酸橙而言,果皮、果肉中黃酮類化合物含量也有差異,部分品種之間差異性顯著(P<0.05)。除品種XC002、有刺-6、刺香橙外,其余酸橙樣品果皮中總黃酮含量均比果肉中總黃酮含量多;尤其是YTJ004 成熟果中,果皮總黃酮含量顯著高于其他品種。
圖2 酸橙果皮和果肉中總黃酮含量Fig. 2 Content of total flavonoids in peel and pulp of Citrus
實驗表明,總黃酮含量在不同品種的酸橙之間具有較大差異,部分品種之間差異性顯著(P<0.05)。對同一品種而言,不同采集時間的總黃酮含量差異也較大。且隨著酸橙果實的成熟,總黃酮含量呈現(xiàn)一定的下降趨勢。這與現(xiàn)有文獻(xiàn)報道相符合[14-15]。
黃酮類成分是酸橙植物中主要的成分之一,也是枳殼發(fā)揮理氣寬中等作用的的重要活性成分之一[14]。該實驗通過對不同品種酸橙成熟果總黃酮含量分析比較發(fā)現(xiàn),同一品種酸橙中,果皮、果肉中總黃酮的含量均有顯著性差異(P<0.05)。不同品種酸橙中果皮、果肉中黃酮含量也有差異。酸橙果皮中總黃酮含量最高的品種為香橙系列的YTJ004,含量為1.72%,酸橙果肉中總黃酮含量最高的品種為臭橙系列的有刺-6,為1.08%。品種YTJ004、YCR004、有刺-4、ZX006 果皮中總黃酮的含量均高于果肉。酸橙主要入藥部位為皮,選擇果皮中總黃酮含量更高的品種可以作為優(yōu)良品種選育的數(shù)據(jù)來源之一。
通過比較酸橙成熟果中果皮和果肉的總黃酮含量發(fā)現(xiàn),即使是成熟果,其黃酮含量依然較高,開發(fā)成熟果中黃酮的相關(guān)產(chǎn)品具有一定的理論可行性。后期可繼續(xù)對不同品種酸橙進(jìn)行研究,對其含有的黃酮類化合物進(jìn)行具體定性分析,為黃酮活性成分提供來源。