普通油茶WOX 基因家族的鑒定及表達分析

趙松子，幸偉年

（江西省林業(yè)科學(xué)院·江西省油茶種質(zhì)資源保護與利用實驗室,江西 南昌 330013）

WOX 基因家族是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)干細胞維持、胚胎發(fā)育、側(cè)生器官發(fā)育、器官再生等生物學(xué)過程，擬南芥（Arabidopsis thaliana）、黃瓜（Cucumis sativus）、水稻（Oryza sativa）分別含有15、11、12 個WOX 基因[1-2]。WUSCHEL（WUS）是WOX 基因家族中與作物產(chǎn)量相關(guān)的重要成員，在頂端分生組織中表達，參與干細胞的維持，WUS 功能缺失突變體wus-1只有1 個雄蕊，沒有心皮[3]；黃瓜中過表達CsWUS可以增加心皮數(shù)[4]；番茄（Solanum lycopersicum）QTL位點lc 位于SlWUS 基因下游1080 bp 后區(qū)域，該區(qū)域的2 個SNP 與心皮數(shù)的變化相關(guān)，從而使番茄心皮數(shù)增加，果實變大[5]；此外，WOX4、WOX5、WOX9 也參與干細胞的維持[6-9]。WOX 基因家族可以分為3 個分支：古分支（包括WOX10、WOX13、WOX14）、中間分支（包括WOX8、WOX9、WOX11、WOX12）、WUS分支（包括WUS、WOX1、WOX2、WOX3、WOX4、WOX5、WOX6、WOX7）[10-12]。普通油茶（Camellia oleifera）是我國第一大木本油料作物，一般所指的油茶為普通油茶，目前對油茶WOX 轉(zhuǎn)錄因子缺乏了解，該研究通過對油茶基因組、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的挖掘，鑒別出18個WOX 基因，并進一步分析了其表達的組織特異性，為深入研究該家族基因的生物學(xué)功能提供了參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

油茶（CON）基因組WOX 基因家族的蛋白質(zhì)序列及CDS序列來自GitHub（https://github.com/Hengfu-Yin/CON_genome_data）；擬南芥WOX 基因家族的蛋白質(zhì)序列來自Phytozome（https://jgi.doe.gov/data-and-tools/phytozome/）；SlWUS 及水稻W(wǎng)OX 基因家族的蛋白質(zhì)序列來自NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）；油茶花芽（CRR274890、CRR274891、CRR274892）、雄蕊（CRR274872、CRR274873、CRR274874）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來自GWH（https://ngdc.cncb.ac.cn/gwh/），葉（SRR5061852、SRR5061853 、SRR5061854）、根（SRR8698748 、SRR8698749、SRR8698750）、 種 仁（SRR10428065、SRR10428066、SRR10428067）、柱頭（SRR8275897、SRR8275898、SRR8275899） 的 轉(zhuǎn) 錄 組 數(shù) 據(jù) 來 自NCBI。

1.2 油茶WUS 的鑒定

利用BLAST 軟件，以擬南芥的WUS 蛋白質(zhì)序列搜索油茶良種贛無1 花蕾轉(zhuǎn)錄組CDS數(shù)據(jù)庫[13]，得到同源基因的部分CDS 序列及其蛋白質(zhì)序列，用Boetie2[14]軟件將轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)單讀段比對到CDS序列，根據(jù)讀段編號用自編的Perl 腳本提取成對的讀段，在默認狀態(tài)下用Cap3 軟件[15]進行序列拼接，獲得同源基因的mRNA 序列；再用Boetie2 軟件將轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)單讀段比對到mRNA 序列，提取成對的讀段，用Cap3 軟件進行序列拼接，獲得新的mRNA序列；重復(fù)上述過程，直到mRNA 序列不再延伸。用油茶WUS 同源基因的mRNA 序列搜索油茶良種贛無1 基因組三代測序數(shù)據(jù)[16]，得到含有油茶WUS 同源基因mRNA 序列的亞讀段；亞讀段經(jīng)過校正后，用Augustus[17]軟件進行基因預(yù)測，得到油茶WUSCHEL同源基因的全長CDS 序列。

1.3 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

利用MEGA7[18]軟件對油茶、擬南芥、黃瓜、水稻等植物WOX 基因家族的蛋白質(zhì)序列進行比對，構(gòu)建WOX 基因家族蛋白質(zhì)系統(tǒng)進化樹(Neighbor-joining法)。

1.4 油茶WOX 基因的表達分析

利用Boetie2[14]軟件將油茶花芽、雄蕊、柱頭、葉、根、種仁等6 種組織（或器官）樣品的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)單讀段比對到油茶WOX 基因CDS 序列，統(tǒng)計匹配的讀段數(shù)，計算基因表達水平RPKM（109×匹配讀段數(shù)/讀段總數(shù)/基因長度）。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶WOX 基因家族的鑒定

以擬南芥15 個WOX 基因的蛋白序列為query，利用BLAST 軟件在油茶（CON）全基因組蛋白質(zhì)序列中鑒定出17 個WOX 基因家族同源體（表1），但未得到WUS 的同源基因。

以WUS 序列搜索油茶花蕾轉(zhuǎn)錄組CDS 數(shù)據(jù)庫，得到1 條最佳匹配序列，經(jīng)過序列比對，該條序列為WUS 的同源基因，將轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)單讀段比對到油茶WUS 的同源基因序列，提取成對讀段，用Cap3軟件進行序列拼接，獲得油茶WUS 同源基因的mRNA 序列；用油茶WUS 同源基因的mRNA 序列分別搜索油茶基因組三代測序數(shù)據(jù)，得到1 條亞讀段，亞讀段經(jīng)過校正后，長度為30936 bp（GenBank 登錄號：MW512817），用Augustus 軟件進行基因預(yù)測，得到油茶WUSCHEL 同源基因的全長mRNA 序列、全長CDS 序列及aa 序列，其結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的拼接結(jié)果基本一致，將油茶WUS 同源基因命名為CoWUS（GenBank 登錄號：MW512818）。

2.2 WOX 基因家族蛋白質(zhì)序列進化分析

用WOX 基因家族的45 條蛋白質(zhì)序列構(gòu)建進化樹（表1、圖1），結(jié)果表明，油茶的18 個WOX 基因可以分為3 個分支。CoWUS、CoWOX1A、CoWOX1B、CoWOX1C、CoWOX1D、CoWOX2A、CoWOX2B、CoWOX3A、CoWOX3B、CoWOX4A、CoWOX4B、CoWOX4C、CoWOX7等13 個基因?qū)儆赪US 分支，CoWOX9A 與CoWOX9B屬于中間分支，CoWOX11A、CoWOX11B、CoWOX13等3 個基因?qū)儆诠欧种?。在WUS 分支中，CoWUS 和WUS、SlWUS、OsWOX1 在一個亞支，是WUS 的同源基因，可能參與油茶心皮數(shù)的調(diào)控。

圖1 WOX 基因家族蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進化樹Fig. 1 Neighbor-joining phylogenetic tree of WOX gene family proteins

表1 系統(tǒng)進化樹中WOX 基因家族蛋白質(zhì)及其編號Tab. 1 Proteins from WOX gene family in phylogenetic tree and their accession numbers

2.3 油茶WOX 基因家族的表達譜

用來自油茶花芽、雄蕊、柱頭、葉、根、種仁等6 種組織（或器官）樣品的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對18 個WOX 基因進行表達分析（表2），結(jié)果表明：CoWOX1A 與CoWOX1B 的表達譜比較相似，但CoWOX1B 在柱頭的表達與CoWOX1A 存在較大差異；CoWOX1C 與CoWOX1D 的表達譜基本一致，在柱頭的表達水平最高；CoWOX2A 與CoWOX2B 的表達譜完全一致，在根的表達水平最高，具有較高的組織特異性；CoWOX3A與CoWOX3B 的表達譜基本一致，主要在花芽、雄蕊中表達，具有較高的組織特異性，CoWOX3A 的表達水平高于WOX3B；CoWOX4A 的表達沒有組織特異性，表達水平最高的樣品是根；CoWOX4B 與CoWOX4C 的表達譜基本一致，沒有組織特異性，表達水平最高的樣品是根，最低的是葉片；CoWOX11A與CoWOX11B 的表達譜基本一致，在種仁中表達水平最高，也是18 個WOX 基因中表達水平最高的；CoWOX7、CoWOX9A、CoWOX9B、CoWOX13 的表達沒有組織特異性，CoWOX9A 與CoWOX9B 的表達譜基本一致；CoWUS 的表達沒有組織特異性，表達水平最高的樣品是柱頭，其次是花芽，最低的是葉片和根。

表2 油茶WOX 基因家族的表達譜Tab. 2 Expression pattern of WOXs in Camellia oleifera

3 結(jié)論與討論

該研究從油茶基因組中鑒別出18 個WOX 基因，基因表達分析結(jié)果表明這些基因可能參與不同的生物學(xué)過程；CoWOX11A 與CoWOX11B 在種仁中高水平表達，可能對種仁發(fā)育具有重要作用；果實心皮數(shù)與莖尖CLV-WUS 干細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)[19-22]，蛋白質(zhì)序列進化分析表明，CoWUS 是WUS 的同源基因，在分析的6 種組織（或器官）樣品中，CoWUS 表達水平最高的樣品是柱頭，表明CoWUS 可能參與油茶心皮數(shù)的調(diào)控；未來將圍繞CoWUS 開發(fā)SSR、SNP 分子標記，對油茶種質(zhì)資源群體進行心皮數(shù)的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)可以增加心皮數(shù)的等位基因，為超多心皮、超大果型、超高產(chǎn)普通油茶良種的選育奠定理論與種質(zhì)基礎(chǔ)。