基于網(wǎng)絡藥理學及分子生物學驗證探討畬藥黃荊條黃酮類成分抗類風濕關(guān)節(jié)炎的作用機制

朱珊珊 汪 洋 張 奇 秦路平 張巧艷

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜炎為主要特征的自身免疫性疾病，發(fā)病率0.3%～1.5%。RA 的臨床表現(xiàn)為手腕、足踝等關(guān)節(jié)部位的對稱性疼痛、腫脹和畸形，后期進展為血管炎、神經(jīng)病變甚至是多器官功能障礙[1-2]。臨床上常用抗炎、抗風濕藥物及生物制劑，如非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、甲氨蝶呤和腫瘤壞死因子α 抑制劑、B 細胞抑制劑等治療類風濕關(guān)節(jié)炎，但長期應用會產(chǎn)生肝腎功能損傷等不良反應，也會導致病情反復和加重疾病發(fā)展，存在一定的局限性[3]。畬族人聚居于福建及浙江麗水等地，氣候潮濕，RA 的患病率較高，而畬醫(yī)藥對RA 也有其獨特的治療方法。畬藥黃荊條是馬鞭草科植物牡荊Vitex negundo L.var.cannabifolia（Sieb.et Zucc.）Hand.-Mazz 的根或葉。在畬醫(yī)藥理論體系中黃荊條屬于陽藥，味微苦，辛、溫。黃荊條含有木脂素類、黃酮類和萜類等成分，研究表明，黃荊條的主要黃酮類成分牡荊素對Ⅱ型膠原蛋白誘導的大鼠類風濕性關(guān)節(jié)炎有緩解作用，具有確切的治療類風濕關(guān)節(jié)炎作用[4]；黃荊條的黃酮類成分紫花牡荊素可劑量依賴性地抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠后足爪的腫脹度，顯著降低致炎性細胞因子的水平，提高抗炎性細胞因子的水平[5]。本文應用網(wǎng)絡藥理學方法結(jié)合分子生物學驗證探索畬藥黃荊條中的黃酮類成分抗RA 的作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 試 劑 木犀草素標準品（luteolin，LUT，批號C19N10Q104574，純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號9048-46-8），美國Gibico 公司；DMEM 培養(yǎng)基，美國Gibico 公司；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS，批號12190801），美國SIGMA 公司；一氧化氮（NO）檢測試劑盒（批號011020201014），上海碧云天生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號070721211202），上海碧云天生物科技有限公司；CCK8溶液，上海碧云天生物科技有限公司；MMP9 抗體（批號ZP2808BP08①），上海博士德生物工程有限公司；GAPDH Rabbit 抗體（批號2118S），COX-2 Rabbit（批號12282S），AKT1 Rabbit（75692S），HRP Rabbit（批號7074S），均購于Cell Signaling Techno-logy。黃荊條醇提物（HJT-E）2 g/mL 及水提物（HJT-W）2 g/mL（以生藥量計）由麗水市人民醫(yī)院中藥實驗室制備。

1.2 儀 器 1510 型酶標儀，賽默飛世爾（上海）科技有限公司；ST 16R 高速冷凍離心機，賽默飛世爾（上海）科技有限公司ECLIPSE TS-100F 型倒置熒光顯微鏡，日本Nikon 公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，上海百基生物科技有限公司；GD50202 型化學發(fā)光成像系統(tǒng)，莫納生物科技有限公司；DHG-9123A 型鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 黃荊條黃酮類成分篩選及靶點預測 以“黃荊條”或“牡荊”為關(guān)鍵詞在中國知網(wǎng)、萬方、維普及TCMSP 中檢索篩選黃荊條的黃酮類成分，通過Pubchem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索各化合物對應的SMILES 號，分別導入Swiss ADME 平臺進行藥物相似性預測，導入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/index.php）進行靶點預測，設置物種為Homo sapiens，以Probability*＞0 為條件篩選化學成分的靶基因，獲得黃荊條黃酮類活性成分合集及對應的靶點合集。

1.4 RA 治療靶點的獲取與篩選 以“Rheumatoid Arthritis”為關(guān)鍵詞在Genecards（http://www.genecards/）和CTD（http://ctdbase.org/）數(shù)據(jù)庫中檢索相關(guān)靶點。以Relevance score≥10 為條件對Gene cards中獲得的靶點進行篩選作為RA 治療靶點；對CTD中獲得的靶點以Inference Score 從大到小排序，選取排名前200 位作為RA 治療靶點[6]。將兩個數(shù)據(jù)庫所得到的靶基因進行歸納整理，刪除重復靶點，獲得RA 治療靶點合集。運用Funrich 軟件將黃荊條黃酮類活性成分靶點合集與RA 治療靶點合集進行映射，獲得活性成分-RA 共同靶點，并繪制Venn 圖。

1.5 活性成分-RA 靶點網(wǎng)絡的構(gòu)建 將黃荊條黃酮類活性成分合集和活性成分-RA 共同作用靶點進行歸納整理，所得數(shù)據(jù)導入到Cytoscape 3.6.1 軟件，構(gòu)建黃荊條的活性成分-RA 靶點網(wǎng)絡。

1.6 靶點蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡的構(gòu)建及網(wǎng)絡拓撲分析 將黃荊條的活性成分-RA 靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫（https://stringdb.org/）構(gòu)建網(wǎng)絡模型，設置物種為Homo sapiens，最低相互作用閾值（medium confidence）為0.4，獲得蛋白相互作用關(guān)系。將結(jié)果進一步導入Cytoscape 3.7.3 軟件進行拓撲分析，并構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡。

1.7 GO 功能和KEGG 通路富集分析 使用R 軟件中的clusterProfiler、enrichplot、ggplot2 等包及自編的R 語言對PPI 網(wǎng)絡中參與相互作用的靶點蛋白進行GO 功能和KEGG 信號通路富集分析。GO 富集分析包括了基因的生物學過程，細胞組分和分子功能。KEGG 富集分析研究靶點參與的主要信號通路，物種均設為“Homo sapiens（人類）”，分別選取前20 條條目繪制氣泡圖（不足20 條的全部選?。?。整理獲得的靶點和信號通路，運用Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建靶點-信號通路網(wǎng)絡模型。

1.8 細胞實驗驗證

1.8.1 細胞及培養(yǎng) 小鼠RAW264.7 單核巨噬細胞（中國科學院細胞庫）接種于含10% FBS、100 U/mL青/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，然后置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，給藥前用含10 μg/mL LPS 的DMEM 培養(yǎng)基刺激4 h。

1.8.2 HJT 及LUT 對LPS 刺激的RAW264.7 細胞增殖的影響 取1.8.1 項下培養(yǎng)的細胞，加入終濃度分別為6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL 的HJT-W 和HJT-E，及2.5、5、10、20、40、80 μM 的LUT。培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL 的CCK8 溶液，37 ℃避光孵育2 h，450 nm 下測定吸光度（OD）值。

1.8.3 HJT-E 及LUT 對LPS 刺激的RAW264.7 細胞NO 生成的影響 取1.8.1 項的細胞加入終濃度分別為12.5、25、50 μg/mL 的HJT-E，及2.5、5、10 μM的LUT，孵育24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)NO 檢測試劑盒操作步驟測定各組細胞NO 的生成。

1.8.4 HJT-E 及LUT 對LPS 刺激的RAW264.7 細胞蛋白表達的影響 取1.8.3 項下經(jīng)HJT-E 及LUT 干預后培養(yǎng)24h 的細胞，根據(jù)蛋白提取試劑盒步驟提取蛋白，并用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，蛋白變性后，-40℃保存用于Western blot 實驗。蛋白表達量用各目的蛋白灰度值與相應內(nèi)參灰度值的比值表示。

1.9 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)均應用SPSS 26.0 進行分析，并以均數(shù)±標準差（）表示，采用單因素方差分析處理比較完全隨機設計的多個樣本均數(shù)；兩組間相互比較：滿足方差齊性時采用LSD 檢驗，不滿足方差齊性時采用T2檢驗；采用雙側(cè)檢驗進行顯著性檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 黃荊條黃酮類成分篩選及靶點篩選 通過檢索各文獻數(shù)據(jù)庫并通過Swiss ADME 平臺預測共獲得潛在黃荊條黃酮類活性成分31 個，通過Swiss Target Prediction 對各成分進行靶點預測，共獲得存在靶點的活性成分30 個，按Mol-1 至Mol-30 進行命名（表1）；共獲得活性成分靶點2103 個，刪除重復靶點后最終獲得309 個靶點。

表1 黃荊條黃酮類活性成分

2.2 黃荊條黃酮類活性成分治療RA 靶點的獲取通過Genecards 和CTD 檢索RA 治療靶點，篩選整理后共獲得RA 治療相關(guān)基因455 個。應用Funrich 對活性成分靶點合集與RA 治療靶點合集進行映射取交集后，共獲得50 個交集基因（見圖1），即黃荊條黃酮類活性成分治療RA 的潛在作用靶點，并獲得可作用于該50 個基因的25 個潛在作用成分。

圖1 黃荊條黃酮類成分治療類風濕關(guān)節(jié)炎的靶點Venn 圖

2.3 黃荊條黃酮類活性成分-抗RA 靶點網(wǎng)絡構(gòu)建根據(jù)2.2 項下分析得到的潛在作用靶點及靶點與活性成分之間的關(guān)系，應用cytoscape 軟件構(gòu)建活性成分-抗RA 靶點網(wǎng)絡圖。如圖2 所示，網(wǎng)絡中包含75 個節(jié)點及395 條邊，其中25 個紅色方形節(jié)點表示黃荊條黃酮類活性成分，50 個綠色圓圈節(jié)點表示RA 靶點，395 條邊代表了活性成分與RA 靶點間的相互作用。各活性成分按度值大小進行排序，選取排名靠前8 個活性成分并篩選相對應的靶點構(gòu)建黃荊條黃酮類活性成分-抗RA 靶點的核心網(wǎng)絡。如圖3所示，網(wǎng)絡中包含43 個節(jié)點和173 條邊，其中活性成分節(jié)點8 個，靶點節(jié)點35 個。所涉及的活性成分為Mol-7、Mol-10、Mol-14、Mol-1、Mol-16、Mol-19、Mol-28、Mol-30，這些成分可能是黃荊條治療RA 的關(guān)鍵性活性成分。

圖2 黃荊條黃酮類成分治療類風濕關(guān)節(jié)炎的靶點網(wǎng)絡

圖3 黃荊條黃酮類成分治療類風濕關(guān)節(jié)炎靶點的核心網(wǎng)絡

2.4 靶點PPI 網(wǎng)絡及網(wǎng)絡拓撲分析 黃荊條黃酮類活性成分治療RA 的潛在作用靶點導入STRING 平臺中初步構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡并導出互作數(shù)據(jù)，整理后應用Cytoscape 軟件繪制成一個包含501 個節(jié)點和407 條邊的PPI 網(wǎng)絡圖A。應用CytoNCA（Version 2.1.6）插件，以Degree 值（DC）＞17 進行第一次篩選，得到一個包含18 個節(jié)點和138 條邊的PPI 網(wǎng)絡圖，再以Betweenness（BC）值＞1.67 進行2 次篩選，得到一個10 個節(jié)點和45 條邊的PPI 核心網(wǎng)絡圖B，其過程見圖4。第二次篩選后得到PPI 核心網(wǎng)絡圖C 中包含10個蛋白基因，包括CASP3、MMP9、PTGS2、AKT1、TP53 等，這些靶點與其他靶點關(guān)聯(lián)密切，可能在治療RA 的過程中占據(jù)重要地位。

圖4 黃荊條黃酮類成分防治類風濕關(guān)節(jié)炎的蛋白互作網(wǎng)絡拓撲分析圖

2.5 GO 分類與KEGG 富集分析結(jié)果 應用R 軟件對經(jīng)2 次篩選后得到的PPI 核心網(wǎng)絡圖C 中的10個蛋白基因進行GO 分類富集分析，結(jié)果見圖5，共獲得GO 條目1297 條（P＜0.05），其中BP 條目1223條，CC 條目7 條，MF 條目67 條，以P 值排序，選取排名前20（不足20 條的全部顯示）的路徑（見圖5），繪制氣泡圖。結(jié)果顯示，生物學過程主要涉及活性氧類代謝、氧化應激反應、細胞外結(jié)構(gòu)組織等；細胞成分主要涉及分泌顆粒內(nèi)腔、胞質(zhì)囊腔、囊腔等；分子功能主要涉及金屬內(nèi)肽酶活性、金屬蛋白酶活性、內(nèi)肽酶活性等。這些結(jié)果表明黃荊條黃酮類成分通過調(diào)控多種生物學過程發(fā)揮治療RA 的作用。

圖5 黃荊條黃酮類活性成分治療類風濕關(guān)節(jié)炎的潛在作用靶點GO 分類富集結(jié)果

KEGG 通路分析共獲得KEGG 通路（P＜0.05）118條，結(jié)果見圖6，關(guān)鍵基因涉及的通路主要有AGERAGE 信號通路、IL-17 信號通路、TNF 信號通路、p53 信號通路、PI3K-Akt 信號通路等，涉及了細胞凋亡、炎癥反應、細胞增殖、遷移等功能，表明黃荊條黃酮類活性成分通過作用于多條信號通路發(fā)揮治療RA 的作用。

圖6 黃荊條黃酮類活性成分治療類風濕關(guān)節(jié)炎的潛在作用靶點KEGG 富集結(jié)果

2.6 靶點-信號通路網(wǎng)絡模型 將排名前20 的KEGG 信號通路及相對應的靶點導入Cytoscape 3.7.1軟件中構(gòu)建靶點-信號通路”網(wǎng)絡。如圖7 所示，網(wǎng)絡中共包含53 個節(jié)點和171 條邊，其中20 個黃色菱形為信號通路節(jié)點，33 個綠色圓形為靶點節(jié)點，結(jié)果表明黃荊條黃酮類活性成分是通過多靶點、多信號通路共同起到治療RA 的作用。該網(wǎng)絡中度值排名靠前的靶點為AKT1、CASP3、MAPK14、BCL2、TP53 等，分別調(diào)控了多條信號通路，表明該5 個靶點在黃荊條黃酮類活性成分治療RA 的過程中起到了重要的作用。

圖7 黃荊條黃酮類活性成分治療類風濕關(guān)節(jié)炎靶點-信號通路網(wǎng)絡模型

2.7 細胞實驗驗證 以黃荊條提取物以及網(wǎng)絡中的關(guān)鍵成分木犀草素為關(guān)鍵成分代表，并選擇相關(guān)通路中相對應的關(guān)鍵靶點進行細胞實驗驗證。

2.7.1 HJT 及LUT 對LPS 刺激的RAW264.7 增殖的影響 如圖8 所示，HJT-W 對LPS 刺激的RAW 264.7 細胞的增殖無顯著影響（P＞0.05）。HJT-E 的濃度為12.5、25 和50 μg/mL 時能顯著抑制LPS 刺激的RAW264.7 細胞的增殖（P＜0.05）；LUT 以劑量依賴性顯著抑制RAW264.7 細胞的增殖（P＜0.05），因此，選擇2.5、5 和10 μM 進行實驗。

圖8 HJT 和LUT 對LPS 刺激的RAW264.7 細胞活力的影響（n=6，）

2.7.2 HJT-E 及LUT 對LPS 刺激的RAW264.7 細胞NO 生成的影響 如圖9 所示，與空白組比較，LPS 刺激的模型組細胞產(chǎn)生NO 的含量顯著增加，LUT 和HJT-E 均以劑量依賴性方式抑制LPS 刺激的RAW264.7 細胞產(chǎn)生NO，但只有高劑量有顯著性差異（P＜0.05）。

圖9 HJT-E 和LUT 對LPS 刺激的RAW264.7 細胞NO 生成的影響（n=6，）

2.7.3 HJT-E 及LUT 對LPS 刺激的RAW264.7 細胞蛋白表達的影響 如圖10 所示，HJT-E 和LUT 給藥治療后，均能顯著抑制因LPS 刺激而表達增加的MMP9、COX-2 和AKT1 蛋白，以高劑量結(jié)果最顯著（P＜0.05）。

圖10 HJT-E 和LUT 對LPS 刺激的RAW264.7 細胞中MMP9、COX-2 和AKT1 蛋白表達的影響

3 討論

本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法，探討黃荊條黃酮類成分治療RA 的作用機制。通過黃荊條黃酮類活性成分抗RA 靶點預測，得到黃荊條中木犀草素、槲皮素、芹菜素、金合歡素等8 個化合物為抗RA 的活性成分。木犀草素可抑制類風濕關(guān)節(jié)炎大鼠RANLRP3 炎性小體的表達，降低足跖內(nèi)Caspase-1、RANKL、VEGF 和HIF-1α 蛋白表達，增強骨組織內(nèi)骨保護素OPG 蛋白表達，從而發(fā)揮骨關(guān)節(jié)保護作用[7]。槲皮素可通過抑制炎性細胞因子、抗氧化、清除氧自由基、免疫調(diào)節(jié)、抑制MMPs 和滑膜細胞增生等功能對小鼠膠原誘導性關(guān)節(jié)炎發(fā)揮治療作用[8]。芹菜素可抑制CIA 小鼠Th1 型細胞功能亢進及Th1/Th2 平衡，減緩RA 發(fā)生和進展[9]。盡管本研究預測到金合歡素、艾黃素、5，4'-二羥基-6，7，8，3'-四甲氧基黃酮、5-羥基-3，6，7，8，3'，4'-六甲氧基黃酮及5，7，2'，5'-四羥基黃酮也為抗RA 的有效成分，但尚未發(fā)現(xiàn)有相應的文獻報道，有待于進一步的實驗確證。

基于黃荊條黃酮類活性成分、PPI 網(wǎng)絡及KEGG信號通路富集結(jié)果，提示黃荊條黃酮類成分治療RA的核心靶點包括ALB、CASP3、MAPK14、PTGS2、AKT1、TNF 及MMP9 等。RA 主要病理特點為炎性細胞浸潤及關(guān)節(jié)炎癥損傷[10]。機體炎癥反應引起干細胞損傷可造成白蛋白（ALB）合成減少，同時RA 患者腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平增加也使得機體蛋白分解增加[11]，導致RA 患者ALB 水平明顯降低[12]。ALB水平降低常導致機體免疫力下降，抗感染能力減弱[13]，加劇了RA 的發(fā)生和發(fā)展。CASP3 是調(diào)節(jié)細胞凋亡的重要基因，其表達下降導致細胞增生與凋亡失衡，導致滑膜細胞的過度增生[14]。絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase14，MAPK14）是MAPK 通路的重要組成部分，阻斷MAPK 通路的激活，能夠抑制RA 成纖維樣滑膜細胞的遷移與侵襲，減輕RA 的癥狀[15]。PTGS2 又稱COX-2，RA 患者滑膜組織COX-2 的表達顯著增加，導致PGE2 和炎癥因子產(chǎn)生，引起炎性細胞浸潤、滑膜組織異常增生，導致關(guān)節(jié)腫脹、退變。COX-2 抑制劑可減少PGE2 的合成，減輕RA 炎癥損傷，改善病情[16-19]?；|(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）的功能為降解骨基質(zhì)和軟骨，其在關(guān)節(jié)成纖維滑膜細胞上高表達，使其侵襲力增強，導致骨基質(zhì)和軟骨的破壞[20]。高表達的MMP9 可與VEGF 協(xié)同刺激內(nèi)皮細胞，促進血管再生和血管翳的形成，加劇了對軟骨的侵蝕破壞[21]。本研究結(jié)果顯示，黃荊條黃酮類成分可通過多靶點發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗凋亡和抑制基質(zhì)降解酶活性等作用減輕RA 癥狀，減緩其發(fā)生發(fā)展。

GO 分類富集和KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，黃荊條黃酮類成分主要通過調(diào)控活性氧類代謝、氧化應激反應、細胞外結(jié)構(gòu)組織、膠原分解代謝過程、活性氧代謝過程的調(diào)節(jié)等生物學過程，通過AGERAGE 信號通路、IL-17 信號通路、TNF 信號通路、p53 信號通路、PI3K-Akt 信號通路，進而調(diào)節(jié)細胞凋亡、炎癥反應、細胞增殖等功能發(fā)揮治療RA 的作用。

細胞實驗驗證過程中發(fā)現(xiàn)，HJT-W 對LPS 刺激的RAW264.7 細胞無增殖作用，而黃酮類成分主要存在于醇提物中，這與本文選擇黃酮類成分為研究對象相符。此外，HJT-E 及LUT 均能抑制MMP9、COX-2 和AKT1 蛋白的表達來抑制LPS 誘導的炎癥的發(fā)展，進一步證實了LUT 作為黃荊條黃酮類成分發(fā)揮抗RA 的關(guān)鍵成分，可作用于信號通路中多個炎癥因子發(fā)揮抗炎作用，與預實驗時的分子對接結(jié)果相互佐證，驗證了本研究中系統(tǒng)網(wǎng)絡藥理學篩選結(jié)果和預測分子機制的可靠性和準確性。

總之，本文通過網(wǎng)絡藥理學分析，結(jié)合文獻報道，推測畬藥黃荊條中黃酮類成分木犀草素、槲皮素、芹菜素、金合歡素、艾黃素、5，4'-二羥基-6，7，8，3'-四甲氧基黃酮、5-羥基-3，6，7，8，3'，4'-六甲氧基黃酮及5，7，2'，5'-四羥基黃酮可能通過ALB、CASP3、MAPK14、PTGS2、AKT1、TNF 及MMP9等靶點，調(diào)控AGE-RAGE、IL-17、TNF、p53 和PI3KAkt 信號通路，抑制RA 滑膜細胞增殖、促進細胞凋亡，緩解炎癥反應，最終發(fā)揮治療RA 的作用。