安陽市內(nèi)黃縣花生果腐病病原種類鑒定及發(fā)生動(dòng)態(tài)研究

蘆連勇，華福平，王 艷

（安陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 安陽 455000）

花生是河南省的主要油料和經(jīng)濟(jì)作物，播種面積僅次于小麥和玉米，花生是河南省第三大農(nóng)作物?；ㄉ?，俗稱爛果病，最早在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，之后世界許多國(guó)家相繼報(bào)道，在我國(guó)山東、河北、吉林、河南等地發(fā)生，危害嚴(yán)重，尤其是重茬地塊，有逐年加重趨勢(shì)［1］。一般發(fā)病田產(chǎn)量損失達(dá)15%左右，重病田可致絕收。國(guó)內(nèi)外研究表明，花生果腐病是由多種病原菌侵染引起的。病原菌包括絲核菌（Rhizoctoniasp.）、腐霉菌（Pythiumsp.）、冬青麗赤殼菌（Sclerotiumsp.，有性階段）、侵脈新赤殼菌（Neocosmosporasp.，有性階段）、鐮刀菌（Fusariumsp.）等［2］。不同地域和環(huán)境條件下病原菌種類存在較大差異，不同的病原菌引起花生果腐病的癥狀不同［2］。我國(guó)花生果腐病以真菌土傳病菌鐮刀菌侵染為主，腐霉菌次之。該病害主要危害果柄和莢果，罹病果表現(xiàn)出不同程度的褪色，從淺表變褐色到整個(gè)莢果殼完全變成黑色。不同發(fā)育階段的莢果均可受害，果仁也表現(xiàn)出不同程度的腐爛。果柄與莢果的結(jié)合部罹病后果柄與莢果結(jié)合不牢固，不利于機(jī)械化收獲，加大產(chǎn)量損失［1-2］。但是病原菌致病機(jī)制及花生抗病機(jī)制相關(guān)基礎(chǔ)研究進(jìn)展緩慢，不同地域、不同環(huán)境下（土壤類型、溫度、濕度），花生果腐病原菌的侵染及致病力也存在很大差異。

安陽市內(nèi)黃縣、滑縣是河南省花生主產(chǎn)區(qū)，花生常年種植面積在7 萬hm2左右，近年來隨著花生種植機(jī)械化水平和相對(duì)收益率的不斷提高，農(nóng)民種植花生的積極性在不斷提高，種植面積也隨之增大。從2018 年開始，隨著安陽市花生種植面積的逐年擴(kuò)大，花生果腐病有逐年蔓延流行發(fā)生的趨勢(shì)，目前已經(jīng)成為安陽地區(qū)花生主產(chǎn)區(qū)的主要土傳病害之一。2020 年，內(nèi)黃縣高堤鄉(xiāng)、二安鄉(xiāng)等地發(fā)生了花生果腐病，嚴(yán)重情況下，發(fā)病率高達(dá)50%以上，造成了大幅度減產(chǎn)?；ㄉ〉姆乐伪容^困難，目前尚缺乏有效的治理措施。該病的發(fā)生不僅影響花生產(chǎn)量和品質(zhì)，也影響農(nóng)民種植積極性，對(duì)安陽地區(qū)花生產(chǎn)業(yè)發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。為了最大限度降低花生果腐病危害，實(shí)現(xiàn)防病增產(chǎn)，安陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院花生團(tuán)隊(duì)在承擔(dān)安陽市重點(diǎn)研發(fā)與推廣專項(xiàng)——高產(chǎn)、抗果腐病花生新種質(zhì)創(chuàng)制與新品種選育任務(wù)基礎(chǔ)上，從2019 年開始連續(xù)3 a 對(duì)安陽市內(nèi)黃縣的花生果腐病進(jìn)行調(diào)查和取樣，對(duì)致病病原菌進(jìn)行鑒定，同時(shí)對(duì)花生果腐病發(fā)生動(dòng)態(tài)進(jìn)行調(diào)查研究，為防治花生果腐病提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料采集

鑒定果腐病材料樣本均從內(nèi)黃縣二安鎮(zhèn)、高堤鄉(xiāng)、井店鎮(zhèn)、城關(guān)鎮(zhèn)這幾個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)選取，種植品種為豫花37、濮花28、安花3 等品種。

1.2 病原菌分離鑒定

病原菌分離應(yīng)用單孢分離法，并應(yīng)用柯赫氏法則進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.1 病原菌分離 將患果腐病材料樣本用清水沖洗3 h，用無菌水浸泡沖洗5 次，放置于無菌濾紙吸干水分后，在染病與健康交界處帶果仁剪取4 mm×6 mm的染病組織。然后用次氯酸鈉消毒1 min，再用無菌水漂洗后，用無菌濾紙吸干水分，立即放置于瓊脂培養(yǎng)皿中，待菌絲自然長(zhǎng)出后，切取菌絲尖端放置于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，移放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，保持光照12 h、黑暗12 h 條件，待菌落自然形成后，統(tǒng)計(jì)各菌落數(shù)，經(jīng)分離純化后作為供試菌株。

1.2.2 病原菌鑒定 將分離純化后的供試菌株移植到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上，放入25 ℃恒溫箱黑暗環(huán)境條件下培養(yǎng)，4 d 后供試菌株長(zhǎng)出菌絲，在光照12 h、黑暗12 h 的條件下培養(yǎng)8 d，每天觀察記錄菌絲生長(zhǎng)狀況和菌株的形態(tài)特征及分生孢子形態(tài)。利用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。采用《真菌鑒定手冊(cè)》［3］中的方法進(jìn)行鑒定，確定病原菌種類。

1.2.3 不同氮源條件下病原菌落生長(zhǎng)直徑變化測(cè)定 利用相同量的硫酸銨、草酸銨、硝酸銨、酵母膏、花生餅、蛋白胨作為氮源，均以查彼克培養(yǎng)基為基礎(chǔ)對(duì)照，置于27 ℃恒溫箱培養(yǎng)6 d。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.2.4 不同碳源條件下病原菌落生長(zhǎng)直徑變化測(cè)定 利用相同量的葡萄糖、蔗糖、木糖、果糖、乳糖、麥芽糖作為碳源，均以查彼克培養(yǎng)基為基礎(chǔ)對(duì)照，置于27 ℃恒溫箱培養(yǎng)6 d。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.2.5 病原菌絲最高致死溫度測(cè)定 將6 個(gè)離心管中均盛入3 mL 滅菌水，然后每個(gè)離心管中均放入4枚4 mm 的菌絲塊，恒溫水浴箱分別設(shè)置50、55、60、65、70 ℃，共5 個(gè)溫度處理，加熱1 min 后，放入菌絲塊，再分別加熱5 min 和10 min 后，取出菌絲塊，移植到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上，放入25 ℃恒溫箱培養(yǎng)6 d，調(diào)查菌絲死亡情況，確定菌絲最高死亡溫度。

1.2.6 病原菌落在不同pH 值下的生長(zhǎng)直徑測(cè)定 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基用1.2 mol/L NaOH 無菌溶液和1.2 mol/L HCl 無菌溶液調(diào)節(jié)pH 值，分別將pH 值設(shè)為5～10，根據(jù)每個(gè)pH 值制作對(duì)應(yīng)的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板，每個(gè)平板均接種7 mm 菌落塊，放入25 ℃恒溫箱黑暗環(huán)境條件下培養(yǎng)8 d。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.3 花生果腐病發(fā)生動(dòng)態(tài)調(diào)查

2019—2021 年的5 月中上旬至9 月中上旬，連續(xù)3 a 在安陽市最具代表性的花生主產(chǎn)區(qū)內(nèi)黃縣城關(guān)鎮(zhèn)陳營(yíng)村、二安鎮(zhèn)李草坡村等8 個(gè)村開展花生果腐病發(fā)生動(dòng)態(tài)調(diào)查。調(diào)查方法為隨機(jī)選取10 戶裸地花生種植地塊，采用單對(duì)角線式取樣法，每點(diǎn)取樣100 株，觀察記載病株數(shù)，計(jì)算病株率：病株率=病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%。調(diào)查從出苗開始到收獲結(jié)束，調(diào)查周期為15 d。

花生果腐病病情指數(shù)調(diào)查方法為首先采用單對(duì)角線五點(diǎn)取樣法對(duì)花生果腐病病株進(jìn)行調(diào)查，每點(diǎn)調(diào)查100 株，然后統(tǒng)計(jì)發(fā)病株數(shù)，根據(jù)發(fā)病株數(shù)進(jìn)行病害分級(jí)。計(jì)算病情指數(shù)：病情指數(shù)=∑（各級(jí)病株數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)值）×100［4］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析采用Excel 2019 和SPSS 12.0 軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌種類鑒定

通過對(duì)內(nèi)黃縣二安鎮(zhèn)、高堤鄉(xiāng)、井店鎮(zhèn)、城關(guān)鎮(zhèn)采集到的60 個(gè)果腐病典型病株純化分離病原菌，共得到195 個(gè)菌落。在顯微鏡下觀察，菌絲顏色呈灰白色至淡黃色，呈疏松狀；有2 種形態(tài)不同的分生孢子，大型分生孢子形狀為稍彎曲鐮刀形，有5 個(gè)左右隔膜；小型分生孢子形狀為卵圓形至長(zhǎng)橢圓形，生長(zhǎng)在分生孢子梗上，呈彎曲或直狀，有1 個(gè)隔膜或無隔膜。根據(jù)菌落形態(tài)特征鑒定出4 種不同的病原菌（表1）。由表1 可知，茄鐮刀病原菌占比71.8%，群結(jié)腐霉病原菌占比18.5%，曲霉病原菌占比1.0%，鏈格孢病原菌占比8.7%。

表1 病原菌種類鑒定結(jié)果 個(gè)

利用盆栽回接法培養(yǎng)病原菌，共出現(xiàn)16 個(gè)患病花生果殼樣品。分離物經(jīng)過單孢純化后，利用孢子懸浮液分別接種到花生莢果和花生苗上，花生莢果有9 株出現(xiàn)與田間發(fā)病類似病癥，花生苗均未產(chǎn)生癥狀。在分離的病原菌中，茄鐮刀菌致病性最強(qiáng)，在接種發(fā)病的花生染病與健康交界處帶果仁剪取染病組織，分離純化病菌形態(tài)與接種菌株形態(tài)類似。病原菌培養(yǎng)結(jié)果顯示，茄鐮刀病原菌占81.6%，群結(jié)腐霉病原菌數(shù)占52.8%，曲霉病原菌占0%，鏈格孢病原菌數(shù)占4.8%。分離鑒定結(jié)果表明，安陽市內(nèi)黃縣花生果腐病病原菌主要是茄鐮刀菌和群結(jié)腐霉菌。

2.2 不同氮源對(duì)病原菌落生長(zhǎng)直徑的影響

病原菌菌落在不同氮源條件下生長(zhǎng)直徑變化有明顯差異，其中菌落直徑最大的氮源為酵母膏，達(dá)到60 mm，其次為蛋白胨，菌落直徑長(zhǎng)為57 mm，酵母膏和蛋白胨為最適宜菌絲生長(zhǎng)氮源。草酸銨組的菌落生長(zhǎng)直徑最小，為21 mm，其次是硫酸銨，菌落生長(zhǎng)直徑為25 mm，草酸銨和硫酸銨為最不適宜菌絲生長(zhǎng)氮源。除對(duì)照組外，菌絲生長(zhǎng)旺盛，均能覆蓋培養(yǎng)基。對(duì)照組的菌絲生長(zhǎng)直徑為52 mm，生長(zhǎng)稀疏，菌絲不能覆蓋培養(yǎng)基（圖1）。

圖1 不同氮源對(duì)病原菌落生長(zhǎng)的影響

2.3 不同碳源對(duì)病原菌落生長(zhǎng)直徑的影響

病原菌菌落在不同碳源條件下生長(zhǎng)直徑變化不明顯，菌落生長(zhǎng)直徑最長(zhǎng)的碳源為乳糖，達(dá)到69 mm，乳糖為最適宜碳源，其次為蔗糖，菌落生長(zhǎng)直徑為65 mm，麥芽糖、葡萄糖、木糖組的菌落生長(zhǎng)直徑分別為64、62、60 mm，果糖組菌落生長(zhǎng)直徑最小，為58 mm。不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)直徑影響較小，菌絲生長(zhǎng)濃密，培養(yǎng)基被菌絲完全覆蓋。對(duì)照組菌落生長(zhǎng)直徑為63 mm，菌絲生長(zhǎng)稀疏，不能完全覆蓋培養(yǎng)基（圖2）。

圖2 不同碳源對(duì)病原菌落生長(zhǎng)的影響

2.4 病原菌絲最高致死溫度

將病原菌菌絲分別在50、55、60、65 ℃處理5 min后，均能繼續(xù)生長(zhǎng)，處理10 min 后，也能正常生長(zhǎng)；在67 ℃5 min 后，停止生長(zhǎng)。可見，致死條件為67 ℃5 min。

2.5 不同pH 值對(duì)病原菌落生長(zhǎng)直徑的影響

pH 值為7 時(shí)，菌落生長(zhǎng)直徑最大，達(dá)到82 mm；pH 值為10 時(shí)，菌落生長(zhǎng)直徑最小，為65 mm；pH 值在5～7 時(shí)，菌落生長(zhǎng)直徑無明顯差異（圖3）。

圖3 不同pH 值對(duì)病原菌落生長(zhǎng)直徑的影響

2.6 花生果腐病發(fā)生動(dòng)態(tài)

通過試點(diǎn)村花生田間觀察，花生果腐病病株呈片狀發(fā)生，病株葉片出現(xiàn)類似花生褐斑病的褐色橢圓形斑點(diǎn)，而正常的花生植株葉片呈綠色。從開花期以后果腐病逐漸加重發(fā)生，每年7 月15 日至8 月15日，如遇雨水過大，田間密度過大，在高溫高濕環(huán)境下致病病原菌極易侵害莢果引起腐爛。砂土地和偏干旱地塊發(fā)病較輕，只有果殼出現(xiàn)黑褐色病斑，如果后期濕度過高果腐病也會(huì)嚴(yán)重發(fā)生，整個(gè)莢果變黑腐爛，重茬連作地塊地下害蟲嚴(yán)重也會(huì)導(dǎo)致果腐病重度發(fā)生。莢果侵染癥狀為果殼剛開始出現(xiàn)褐色不規(guī)則小斑點(diǎn)，隨著病情加重發(fā)展成暗黑褐色大病斑，最后整個(gè)莢果完全變黑腐爛。果腐病發(fā)病較輕的莢果特征為果仁瘦小、發(fā)硬、停止發(fā)育，種皮色呈淺灰色；果腐病發(fā)病嚴(yán)重的莢果特征為果柄呈黑褐色，與莢果連接松散，收獲時(shí)極易脫落，莢果果仁與果殼全部腐爛有惡臭味，沒有任何利用價(jià)值。

安陽市內(nèi)黃縣花生果腐病發(fā)生動(dòng)態(tài)調(diào)查結(jié)果（圖4）顯示，2019 年果腐病發(fā)生相對(duì)較輕，2020 年和2021 年果腐病發(fā)生較重，連續(xù)3 a 調(diào)查的果腐病發(fā)生動(dòng)態(tài)基本趨同。2019 年，果腐病發(fā)病率最高為14.60%，整體發(fā)病較輕，病情指數(shù)為15.72；2020 年，果腐病發(fā)病率最高為18.90%，病情指數(shù)為19.84；2021年，果腐病發(fā)病率最高為24.80%，病情指數(shù)為26.79。

從圖4 可以看出，在花生莢果尚未形成的苗期、開花期、下針期均未出現(xiàn)花生果腐病，在7 月1 日結(jié)莢初期發(fā)現(xiàn)有零星果腐病感染病株；7 月8 日后果腐病病情開始逐步蔓延發(fā)生，到8 月10 日果腐病發(fā)生已經(jīng)比較嚴(yán)重，病情指數(shù)和發(fā)病率明顯增高；到8 月20 日成熟收獲期，果腐病發(fā)生達(dá)到峰值。

圖4 安陽市內(nèi)黃縣花生果腐病發(fā)生動(dòng)態(tài)

3 結(jié)論與討論

茄鐮刀菌是多種植物及動(dòng)物的致病菌，在自然界中廣泛存在，能使植物發(fā)生根部腐爛、植株枯萎等癥狀，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育造成嚴(yán)重不利影響。茄鐮刀菌是花生果腐病的主要致病病原之一［5］。

本研究通過對(duì)安陽市內(nèi)黃縣的花生果腐病病原進(jìn)行分離、純化、回接鑒定，證明花生果腐病首位致病病原菌是茄鐮刀菌，次致病病原菌是群結(jié)腐霉菌。病株地上植株莖、枝、葉色呈綠色，生長(zhǎng)正常，莖基部剛開始染病時(shí)出現(xiàn)褐色水漬狀病斑，維管束顏色也變成褐色。莢果外殼在果腐病侵染初期會(huì)出現(xiàn)大小不規(guī)則深褪色病斑，隨著果腐病發(fā)展加重莢果外殼呈鐵銹色，果仁逐漸干癟，直至莢果完全變黑，果柄脫落，果仁完全腐爛喪失利用價(jià)值。

本研究結(jié)果表明，安陽市內(nèi)黃縣花生在7月1 日結(jié)莢初期出現(xiàn)零星果腐病病株，在7 月8 日后果腐病病情開始逐步蔓延發(fā)生，到8 月10 日果腐病病情指數(shù)和發(fā)病率明顯增加，到8 月20 日成熟收獲期時(shí)果腐病病情達(dá)到頂峰。