有機(jī)酸在三華李發(fā)酵過程中對花色苷的護(hù)色作用分析

李 媛，郭卓釗，沈雪玉，施奕喬，黃 葦,*

（1.廣東康輝集團(tuán)有限公司，廣東 潮州 515638；2.廣東正一品生物科技股份有限公司，廣東 潮州 515638；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東 廣州 510642）

傳統(tǒng)廣式?jīng)龉a(chǎn)通常將鮮果添加約占鮮果質(zhì)量25%的食鹽及1%的焦亞硫酸鈉一次性腌制為果坯，為產(chǎn)品周年生產(chǎn)提供半成品原料。但該法會使李果中的花色苷大部分損失，使用不當(dāng)還會導(dǎo)致產(chǎn)品二氧化硫殘留量超標(biāo)，引發(fā)食品安全問題，另外，高鹽腌制液的排放還會導(dǎo)致環(huán)境污染和資源浪費。三華李果肉的紫紅色主要由花色苷所呈現(xiàn)，花色苷是一種安全、無毒的天然色素，具有抗氧化，預(yù)防糖尿病，保護(hù)視力，抗動脈粥樣硬化，防治心血管疾病和抑制血小板凝集等生物活性功能[1-2]。過量使用亞硫酸鹽會導(dǎo)致三華李果中的天然色素花色苷嚴(yán)重破壞，營養(yǎng)價值和感官品質(zhì)降低[3-4]。利用乳酸菌發(fā)酵取代高硫、高鹽腌制果坯，能達(dá)到無硫保藏果坯的目的，并大幅度降低食鹽使用量[5-6]，充分保障產(chǎn)品品質(zhì)及安全。乳酸菌發(fā)酵過程中，會產(chǎn)生芳香類烷烴、醇酯類、烯烴類等物質(zhì)，賦予發(fā)酵后的果蔬堅果香、花香等風(fēng)味[7-8]。相關(guān)研究報道，pH值較低時，花色苷以穩(wěn)定的黃酮型結(jié)構(gòu)為主，當(dāng)pH值升高，不穩(wěn)定的查耳酮型假堿、甲醇和醌型比例將增加[9-10]。乳酸菌發(fā)酵過程中，因早期產(chǎn)酸有限，不能達(dá)到很好的護(hù)色效果。在接種發(fā)酵開始時，適當(dāng)添加有機(jī)酸可以降低發(fā)酵體系的pH值，使花色苷?；?，有利于維持花色苷的穩(wěn)定。本文以三華李為原料，通過有機(jī)酸在發(fā)酵過程中對果坯的護(hù)色效果，優(yōu)選其復(fù)配配方，為高花色苷含量三華李果坯的發(fā)酵提供依據(jù)，從而為開發(fā)高品質(zhì)三華李產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

三華李鮮果，購于天平架水果批發(fā)市場。

孟加拉紅培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基，廣州環(huán)凱生物科技有限公司；草酸，廣州化學(xué)試劑廠；檸檬酸，天津富晨化學(xué)試劑廠；迷迭香酸，上海麥克林生化科技有限公司；醋酸，天津市富宇精細(xì)化工有限公司。其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TU-1800紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；XK97-A菌落計數(shù)器，閩測儀器設(shè)備（廈門）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗設(shè)計

參照前期試驗[11-12]，按李果質(zhì)量計，添加180%水、3.3%糖、0.025%山梨酸鉀、0.01%那他霉素、3.00%食鹽，接種復(fù)配乳酸菌（植物乳桿菌∶干酪乳桿菌∶腸膜明串珠菌=3∶1∶8），草酸、檸檬酸、迷迭香酸、醋酸均按李果質(zhì)量的0（CK）、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%分別單獨進(jìn)行添加，封口后37℃儲藏發(fā)酵，定期測定花色苷、致腐菌指標(biāo)。文中配方百分比均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)配護(hù)色劑配方

在發(fā)酵體系中，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取0.2%迷迭香酸、0.4%草酸、0.4%檸檬酸作為中心試驗點，以發(fā)酵后果坯花色苷含量下降率（Y）為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面試驗法優(yōu)化復(fù)配護(hù)色劑，因素水平編碼如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface test 單位：%

1.2.3 測定項目與方法

1.2.3.1 乳酸菌總數(shù)、霉菌和酵母總數(shù)

參照GB 4789.15—2016[13]中規(guī)定的方法進(jìn)行測定。

1.2.3.2 果坯花色苷含量

參照陳云霞等[14]和楊磊等[15]的方法并稍作修改。果坯打漿后充分混勻并準(zhǔn)確稱取5.00 g，加入用36%的鹽酸調(diào)定pH值為3的酸性乙醇20 mL，浸提20 h，超聲處理20 min后抽濾，濾液用酸性乙醇定容至50 mL，利用紫外可見分光光度計測定OD520值，通過吸光度計算花色苷含量，計算公式為：

式中：A為實測試樣的吸光度值；V為液體總體積，mL；m為試樣質(zhì)量，g；98.2為花色苷平均消光系數(shù)。

1.2.3.3 花色苷下降率

花色苷下降率按以下公式計算：

式中：A為發(fā)酵30 d后果坯花色苷含量，mg/100 g；A0為新鮮三華李花色苷含量，mg/100 g。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行顯著性分析；響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)酸護(hù)色劑的篩選

黃月[16]從三華李鮮果分離出的致腐菌主要為漢遜德巴利氏酵母、巴斯德畢赤酵母、膠紅酵母以及枝孢霉菌。黃志鈺等[17]從三華李發(fā)酵液中分離出的致腐菌主要為假絲酵母亞種、庫德里阿茲氏畢赤酵母和西方畢赤酵母。因此監(jiān)測三華李發(fā)酵過程中霉菌和酵母的活菌數(shù)十分重要。

2.1.1 草酸添加量對三華李果坯發(fā)酵效果的影響

由圖1可知，新鮮三華李花色苷含量平均為3.11 mg/100 g，在相同發(fā)酵時間內(nèi)，三華李果坯花色苷含量隨草酸添加量的增加而升高。

圖1 草酸添加量對發(fā)酵過程中三華李果坯花色苷含量的影響Fig.1 Effects of oxalic acid additions on anthocyanins contents in Sanhua plum fruit billets during fermentation

草酸添加量與發(fā)酵過程中三華李果坯微生物生長狀況關(guān)系見圖2及圖3。由圖2可知，發(fā)酵第5天開始，所有草酸處理組乳酸菌活菌數(shù)均大幅度下降，發(fā)酵至第15天時，僅檢測出少量乳酸活菌，至第30天，已檢測不出乳酸活菌。霉菌和酵母在第15天時就基本檢測不出（圖3）。在相同發(fā)酵時間內(nèi)，總活菌數(shù)隨草酸添加量的增加而減小，說明草酸對微生物的生長有一定的抑制作用。

圖2 草酸添加量對發(fā)酵過程中三華李果坯乳酸菌總數(shù)的影響Fig.2 Effects of oxalic acid additions on total numbers of lactic acid bacteria in Sanhua plum fruit billets during fermentation

圖3 草酸添加量對發(fā)酵過程中三華李果坯霉菌和酵母總數(shù)的影響Fig.3 Effects of oxalic acid additions on total numbers of molds and yeasts in Sanhua plum fruit billets during fermentation

綜上可知，草酸添加量越高，相同發(fā)酵時間內(nèi)果坯花色苷降解越緩慢，微生物存活率降低。結(jié)合發(fā)酵效果及護(hù)色效果，選擇草酸添加量0.2%為適宜發(fā)酵濃度。

2.1.2 檸檬酸添加量對三華李果坯發(fā)酵效果的影響

由圖4可知，在相同發(fā)酵時間內(nèi)，三華李果坯花色苷含量隨檸檬酸添加量的增加而升高。

圖4 檸檬酸添加量對發(fā)酵過程中三華李果坯花色苷含量的影響Fig.4 Effects of citric acid additions on anthocyanins contents in Sanhua plum fruit billets during fermentation

檸檬酸添加量與發(fā)酵過程中三華李果坯微生物生長狀況關(guān)系見圖5及圖6。由圖5可知，所有檸檬酸處理組的乳酸菌活菌數(shù)均隨發(fā)酵時間的延長而減少，至第30天時，基本檢測不出乳酸活菌；相同發(fā)酵時間內(nèi)，霉菌和酵母總數(shù)隨檸檬酸添加量的增加而減小。

圖5 檸檬酸添加量對發(fā)酵過程中三華李果坯乳酸菌總數(shù)的影響Fig.5 Effects of citric acid additions on total number of lactic acid bacteria in Sanhua plum fruit billets during fermentation

圖6 檸檬酸添加量對發(fā)酵過程中三華李果坯霉菌和酵母總數(shù)的影響Fig.6 Effects of citric acid additions on total numbers of molds and yeasts in Sanhua plum fruit billets during fermentation

綜上所述，隨著檸檬酸添加量的升高，發(fā)酵三華李果坯花色苷降解速度延緩，微生物存活率降低。為兼顧發(fā)酵效果及護(hù)色效果，選擇檸檬酸添加量0.4%為適宜發(fā)酵濃度。

2.1.3 迷迭香酸添加量對三華李果坯發(fā)酵效果的影響

由圖7可知，在相同發(fā)酵時間內(nèi)，三華李果坯花色苷含量隨迷迭香酸添加量的增加而升高。

圖7 迷迭香酸添加量對發(fā)酵過程中三華李果坯花色苷含量的影響Fig.7 Effects of rosmarinic acid additions on anthocyanins contents in Sanhua plum fruit billets during fermentation

迷迭香酸添加量與發(fā)酵過程中三華李果坯微生物生長關(guān)系見圖8和圖9。由圖8可知，相同發(fā)酵時間內(nèi)，乳酸菌活菌數(shù)隨迷迭香酸添加量的增加逐漸減小，0.8%迷迭香酸處理組在發(fā)酵第30天時基本檢測不出乳酸活菌，其他試驗組可以維持一定的乳酸菌活菌數(shù)。由圖9可知，迷迭香酸處理組的霉菌和酵母總數(shù)在標(biāo)準(zhǔn)時間范圍有小幅度增長，中后期逐漸減少，相同發(fā)酵時間內(nèi)，數(shù)量隨迷迭香酸添加量的增加而減小。

圖8 迷迭香酸添加量對發(fā)酵過程中三華李果坯乳酸菌總數(shù)的影響Fig.8 Effects of rosmarinic acid additions on total numbers of lactobacillus in Sanhua plum fruit billets during fermentation

圖9 迷迭香酸添加量對發(fā)酵過程中三華李果坯霉菌和酵母總數(shù)的影響Fig.9 Effects of rosmarinic acid additions on total numbers of molds and yeasts in Sanhua plum fruit billets during fermentation

綜上所述，隨著迷迭香酸添加量的升高，發(fā)酵三華李果坯花色苷降解速度延緩，微生物存活率降低，對果坯風(fēng)味影響增大，雖然迷迭香酸具有優(yōu)秀的護(hù)色效果，但其添加過多，自身所帶來的氣味會掩蓋果香味，為兼顧發(fā)酵效果、護(hù)色效果及果坯風(fēng)味，選擇迷迭香酸添加量0.2%為適宜發(fā)酵濃度。

2.1.4 醋酸添加量對三華李果坯發(fā)酵效果的影響

由圖10可知，醋酸添加量低于0.4%時，對果坯花色苷降解有一定抑制作用；醋酸添加量大于0.4%時，相同發(fā)酵時間內(nèi)，果坯花色苷含量隨添加量增加而減小，且均低于對照，不利于護(hù)色。

圖10 醋酸添加量對發(fā)酵過程中三華李果坯花色苷含量的影響Fig.10 Effects of acetic acid additions on anthocyanins contents in in Sanhua plum fruit billets during fermentation

醋酸添加量與發(fā)酵過程中三華李果坯微生物生長關(guān)系見圖11和圖12。由圖11可知，低添加量的醋酸處理組在發(fā)酵初期，乳酸菌活菌數(shù)呈增長趨勢。由圖12可知，發(fā)酵至第30天時，隨著醋酸添加量的增加，霉菌和酵母生長受抑制的程度增加。研究表明，與醋酸發(fā)酵過程相關(guān)的細(xì)菌為乳桿菌屬[18]，適量添加醋酸有助于降低發(fā)酵液的酸度，抑制腐敗菌生長的同時不會對乳酸菌產(chǎn)生不利影響。

圖11 醋酸添加量對發(fā)酵過程中三華李果坯乳酸菌總數(shù)的影響Fig.11 Effects of acetic acid additions on total numbers of lactobacillus in Sanhua plum fruit billets during fermentation

圖12 醋酸添加量對發(fā)酵過程中三華李果坯霉菌和酵母總數(shù)的影響Fig.12 Effects of acetic acid additions on total numbers of molds and yeasts in Sanhua plum fruit billets during fermentation

醋酸添加量過多，強(qiáng)烈的醋酸刺激氣味會掩蓋部分原果的風(fēng)味，對后續(xù)產(chǎn)品的調(diào)味加工帶來不利影響。

綜上所述，醋酸添加量越高，致腐菌存活率越低，添加0.4%醋酸發(fā)酵30 d時果坯花色苷含量最高，低濃度醋酸對延緩果坯花色苷降解有一定作用，但高濃度醋酸反而加速其降解。故選擇醋酸添加量0.4%為適宜發(fā)酵濃度。

2.2 不同有機(jī)酸護(hù)色能力比較

由表2及圖13可知，發(fā)酵過程中，添加草酸、檸檬酸、迷迭香酸對抑制花色苷的降解均呈明顯的量效關(guān)系，添加量越大，其對三華李果坯的護(hù)色效果越好。但添加醋酸時，在低濃度范圍內(nèi)對花色苷降解具有一定地延緩作用，添加量達(dá)到0.6%以上時反而促進(jìn)果坯花色苷的降解。這可能是因為醋酸對腐敗菌的抑制效果較弱，果坯軟化程度較高，加速花色苷溶出到發(fā)酵液中。添加量在0~0.4%范圍內(nèi)，迷迭香酸與草酸護(hù)色能力相當(dāng)；當(dāng)添加量大于0.6%時，不同有機(jī)酸護(hù)色能力由強(qiáng)到弱依次為：迷迭香酸＞草酸＞檸檬酸＞醋酸。趙磊等[19]關(guān)于提高黑米花色苷顏色穩(wěn)定性輔色劑的研究表明，迷迭香酸和草酸會使花色苷溶液出現(xiàn)增色效應(yīng)，但草酸會使花色苷溶液出現(xiàn)藍(lán)移現(xiàn)象，迷迭香酸護(hù)色效果優(yōu)于草酸，因為迷迭香酸通過氫鍵和π-π堆積的相互作用力與花色苷結(jié)合，從而提高黑米花色苷的穩(wěn)定性。

圖13 不同有機(jī)酸對發(fā)酵三華李果坯的護(hù)色效果（發(fā)酵30 d）Fig.13 Color protection effects of different organic acids on fermented Sanhua plum fruit billets(30 d fermentation)

表2 添加不同有機(jī)酸發(fā)酵30 d時三華李果坯花色苷含量Table 2 Anthocyanin contents of Sanhua plum fruit billets after 30 d fermentation with different organic acids additions 單位：mg/100 g

有機(jī)酸一般結(jié)合在花色苷的C3位或C6位糖基上，形成?；ㄉ眨淇烧郫B糖鏈將有機(jī)酸置于2-苯基苯并吡喃骨架表面，能較好地抵抗水的親核攻擊，從而增加花色苷穩(wěn)定性[20]。有機(jī)酸提供的酸性環(huán)境能使花色苷分子聚合成非共價手性超分子復(fù)合物，形成了一個花色苷顏色的核心，加強(qiáng)自聚作用，阻止水合作用，加深花色苷顏色[21]。

一般隨著有機(jī)酸分子中甲氧基和羥基數(shù)的增加，花色苷酰化效果增加，花色苷的穩(wěn)定性隨之提高[22]。由4種有機(jī)酸結(jié)構(gòu)圖（圖14）可以看出，分子中甲氧基和羥基數(shù)量由高到低依次為：迷迭香酸＞檸檬酸＞草酸＞醋酸。研究發(fā)現(xiàn)，草酸抑制鮮切香蕉褐變的效果均好于檸檬酸[23]?？赡苁且驗椴菟岢藢ㄉ者M(jìn)行酰基化作用外，還有較強(qiáng)的抑制多酚氧化酶（PPO）的能力，抑制同屬酚類物質(zhì)的花色苷褐變，使得護(hù)色效果優(yōu)于檸檬酸，但其機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。

圖14 不同有機(jī)酸結(jié)構(gòu)圖Fig.14 Structure diagrams of different organic acids

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化護(hù)色劑配方

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

以花色苷下降率為指標(biāo)，進(jìn)行復(fù)配護(hù)色劑的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表3。

表3 復(fù)配護(hù)色劑優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface optimization test for compound color protectors

利用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件對響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

以花色苷下降率Y為響應(yīng)值，迷迭香酸X1、草酸X2、檸檬酸X3為自變量，建立二次回歸方程：

Y=34.81-2.07X1+1.33X2-0.913X3-1.19X1X2+0.3X1X3-1.56X2X3+0.5X12+0.6X22+1.66X32

由表4可知，模型極顯著（P=0.001 7＜0.01）；失擬項不顯著（P=0.472 2＞0.05），說明該模型殘差均由隨機(jī)誤差引起；決定系數(shù)R2=0.939 3，調(diào)整決定系數(shù)=0.861 3，說明二次回歸方程擬合程度高，能夠反映三華李發(fā)酵前后果坯花色苷變化率情況。

由圖15~16可知，相對于迷迭香酸和草酸（X1X2）的交互作用，草酸和檸檬酸（X2X3）的交互作用對發(fā)酵果坯花色苷下降率的影響更為顯著，檸檬酸濃度越低且草酸濃度越高，對發(fā)酵果坯花色苷的下降率影響越顯著。

圖15 迷迭香酸和草酸添加量的交互作用對花色苷下降率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.15 Response surface diagram and contour plot of interaction effects between rosmarinic acid and oxalic acid additions on anthocyanin decline rates

以花色苷下降率最小為最優(yōu)結(jié)果，通過響應(yīng)面分析得到各因子的優(yōu)化參數(shù)為：迷迭香酸添加量0.3%，草酸添加量0.4%，檸檬酸添加量0.4%，發(fā)酵后果坯花色苷下降率預(yù)測值為33.48%。

在該優(yōu)化條件下進(jìn)行驗證試驗，測得花色苷下降率為32.80%，與理論值基本吻合，說明該模型能較好地預(yù)測上述復(fù)配護(hù)色劑的護(hù)色效果。

圖16 草酸和檸檬酸添加量的交互作用對花色苷下降率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.16 Response surface diagram and contour plot of interaction effects between oxalic acid and citric acid additions on anthocyanin decline rates

2.3.2 復(fù)配護(hù)色劑對發(fā)酵三華李果坯色澤影響直觀效果的比較

由圖17可知，CK組三華李果坯顏色相對暗沉，添加最佳復(fù)配護(hù)色劑的果坯色澤紅艷，CK組發(fā)酵果坯花色苷含量為1.36 mg/100 g；添加最佳復(fù)配護(hù)色劑組的花色苷含量為2.09 mg/100 g，與鮮果平均花色苷含量3.11 mg/100 g相比較，下降率為32.80%，相比未進(jìn)行護(hù)色處理的空白對照組，花色苷下降率降低了23個百分點，護(hù)色效果顯著。果坯無明顯的迷迭香殘留氣味，有典型三華李果香以及發(fā)酵的醇香。

圖17 復(fù)配護(hù)色劑對發(fā)酵果坯色澤的影響Fig.17 Effects of compound color protectors on the color of fermented fruit billets

添加優(yōu)選的有機(jī)酸復(fù)配護(hù)色劑，經(jīng)接種37℃發(fā)酵30 d，每毫升霉菌和酵母總數(shù)對數(shù)值均在1左右，乳酸菌活菌數(shù)均在2以上，符合保藏要求。

3 結(jié)論

（1）通過在乳酸菌發(fā)酵體系中加入有機(jī)酸護(hù)色劑能有效保護(hù)花色苷，迷迭香酸、草酸、檸檬酸3種有機(jī)酸添加量越大，三華李果坯花色苷降解量越??；發(fā)酵30 d時，在添加量0.2%~0.4%范圍內(nèi)，草酸護(hù)色能力略優(yōu)于迷迭香酸，添加量0.6%~08%范圍內(nèi)，迷迭香酸護(hù)色能力優(yōu)于草酸，總體比較護(hù)色能力由強(qiáng)到弱依次為：迷迭香酸＞草酸＞檸檬酸＞醋酸。添加有機(jī)酸能有效抑制霉菌和酵母的生長。

（2）在發(fā)酵體系中加入復(fù)配護(hù)色劑（0.3%迷迭香酸，0.4%草酸，0.4%檸檬酸），37℃乳酸菌發(fā)酵30 d時，三華李果坯花色苷為2.09 mg/100 g，相比鮮果（3.11 mg/100 g），花色苷含量下降率為32.80%，CK組發(fā)酵果坯花色苷含量為1.36 mg/100 g，花色苷下降率為56.27%。以上結(jié)果說明，有機(jī)酸護(hù)色劑對三華李果坯花色苷的保護(hù)作用顯著。