1株鯉魚(yú)源植物乳桿菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性分析

楊澤敏，李 雙，金正雨，廖義瀟，楊 穎，3，文 明，3

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025；3.貴州省動(dòng)物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴陽(yáng) 550025)

近年來(lái)，中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化發(fā)展，許多水產(chǎn)養(yǎng)殖中的疾病仍無(wú)有效防治疫苗，加上抗生素濫用，導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化[1-3]。隨著中國(guó)全面禁止抗生素類添加劑在飼料中使用，益生菌作為抗生素的替代品備受關(guān)注，并越來(lái)越多地應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中[4-6]。

乳酸菌(lactic acid bacteria)是指一類能發(fā)酵糖類產(chǎn)生有機(jī)酸的無(wú)芽孢、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的總稱，是應(yīng)用最早的一種益生菌，具有頡頏有害細(xì)菌、提高免疫力及提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等作用，已被應(yīng)用添加于多種動(dòng)物飼料中[7-8]。已有學(xué)者初步揭示了乳酸菌對(duì)促鯉魚(yú)生長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫、維持腸道菌群平衡、抑制病原菌及改善水體環(huán)境等作用。李利等[9]發(fā)現(xiàn)，在鯉魚(yú)飼糧中添加乳酸菌促進(jìn)了鯉魚(yú)的生長(zhǎng)及提高了腸道酶活性。桂遠(yuǎn)明等[10]從鯉魚(yú)腸道內(nèi)分離干酪乳桿菌制成生物制品對(duì)鯉魚(yú)進(jìn)行飼喂，促進(jìn)了鯉魚(yú)生長(zhǎng)，提高了鯉魚(yú)免疫水平及抗病能力。何宇智[11]發(fā)現(xiàn)乳酸菌能有效調(diào)控水體中氨氮、亞硝酸鹽氮的含量，對(duì)改良水質(zhì)有較好的效果。

已證實(shí)益生菌制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有多種益生功能，但在鯉魚(yú)上的應(yīng)用研究相對(duì)較少。因此，本研究擬從鯉魚(yú)腸道內(nèi)分離鯉源乳酸菌，并對(duì)分離菌進(jìn)行生物學(xué)特性分析，以期篩選到優(yōu)質(zhì)鯉源乳酸菌，為后續(xù)制備鯉魚(yú)用益生菌制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)菌 健康鯉魚(yú)購(gòu)自貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)市場(chǎng)；嗜水氣單胞菌、維氣氏單胞菌均由貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；柱狀黃桿菌由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所惠贈(zèng)。體重18～20 g的健康昆明小鼠購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)。

1.1.2 主要試劑 Shieh培養(yǎng)基(江蘇綠葉生物有限公司)；MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、HIB培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑、通用基因組DNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；PCR反應(yīng)試劑(天根生化科技(北京)有限公司)；藥敏試紙(溫州康泰生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離與純化 將鯉魚(yú)處死后，進(jìn)行體表消毒，在超凈工作臺(tái)中剖開(kāi)鯉魚(yú)腹腔，取出前腸和中腸，縱向剪開(kāi)腸道，用載玻片刮取腸道內(nèi)容物及腸道黏膜置于培養(yǎng)皿中，與5 mL PBS充分混合，取2 mL混合液加入盛有200 mL MRS三角錐形瓶中，置于37 ℃培養(yǎng)箱24 h進(jìn)行富集培養(yǎng)。取1 mL富集液加入9 mL PBS中混勻，隨后進(jìn)行倍比稀釋,取稀釋度為10-6、10-7、10-8、10-9和10-10的富集液進(jìn)行涂板，挑取菌落形態(tài)不一的單個(gè)菌落在MRS平板純化4代，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2 分離菌16S rRNA鑒定 利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取上述分離純化后細(xì)菌的DNA，并以此作為模板采用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物為：27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系25 μL:2×TaqMasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板 1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用MegAlign軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 分離菌生長(zhǎng)特性及產(chǎn)酸能力測(cè)定 取100 μL分離菌培養(yǎng)液接種于200 mL MRS培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)。每隔4 h取樣，以空白培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定600 nm波長(zhǎng)下的吸光度(D600 nm值)，同時(shí)測(cè)定菌液的pH，以菌液培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、D600 nm值和pH為縱坐標(biāo)分別繪制生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線。

1.2.4 分離菌耐受試驗(yàn) 用鹽酸配制pH為3.0、2.5和2.0的PBS，用牛膽鹽配制濃度為0.3%、0.2%和0.1%的膽鹽，分別取100 μL分離菌培養(yǎng)液接種于10 mL上述配制好的溶液中，以未處理的PBS作為對(duì)照，置于37 ℃培養(yǎng)箱1 h后，取菌液涂布平板計(jì)數(shù)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 分離菌抑菌試驗(yàn) 采用牛津杯法測(cè)定分離菌對(duì)嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、柱狀黃桿菌的抑制情況。嗜水氣單胞菌和維氣氏單胞菌置于29 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，柱狀黃桿菌置于29 ℃ 恒溫培養(yǎng)48 h，各取100 μL分別均勻涂布于LB、BHI和shieh瓊脂培養(yǎng)基上；待平板稍干，放上牛津杯，待測(cè)菌液培養(yǎng)24 h后 8 000×g離心5 min，取200 μL上清液加入牛津杯內(nèi)，同時(shí)加入等量MRS空白培養(yǎng)基作對(duì)照，置于29 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，測(cè)量并記錄抑菌圈直徑大小。

1.2.6 分離菌藥物敏感性試驗(yàn) 采用K-B法測(cè)定分離菌株的藥物敏感性，使用0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管對(duì)菌株培養(yǎng)液進(jìn)行標(biāo)定并校正，取100 μL涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，用無(wú)菌鑷子將藥敏片放置于培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量并記錄抑菌圈直徑大小，依據(jù)藥敏紙片判定標(biāo)準(zhǔn)判定細(xì)菌的藥物敏感性[12]。

1.2.7 小鼠安全性試驗(yàn) 取體重18～20 g的昆明種健康小鼠12只，分成2組，每組6只，雌雄各半。對(duì)照組灌胃PBS，試驗(yàn)組灌胃1 mL濃度為1×108CFU/mL的分離菌株，每天一次連續(xù)1周，觀察記錄小鼠的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離與純化結(jié)果

經(jīng)分離純化后得到的分離菌在MRS固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為圓形、表面光滑、邊緣整齊、呈乳白色(圖1A)；革蘭氏染色為陽(yáng)性、兩端鈍圓的短小桿菌，無(wú)芽孢(圖1B)；將該菌株命名為YY001。

圖1 分離菌菌落形態(tài)(A)和革蘭氏染色鏡檢圖(B，1 000×)

2.2 16S rRNA鑒定

以YY001株的基因組為模板，通用引物PCR擴(kuò)增出大小約1 500 bp的條帶(圖2)，與預(yù)期大小相符。測(cè)序結(jié)果顯示該擴(kuò)增片段大小為1 457 bp，經(jīng)BLAST對(duì)比后，利用MegAlign軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，YY001株與8株植物乳桿菌聚為一簇，且與植物乳桿菌(登錄號(hào)：MT463427.1)親緣性關(guān)系最近，置信度達(dá)100%(圖3)。綜合分離菌的形態(tài)學(xué)特征及基因序列分析結(jié)果，判定該株分離菌為植物乳桿菌。

圖2 YY001株16S rRNA 基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 生長(zhǎng)特性及產(chǎn)酸能力測(cè)定

由圖4可知，YY001株在培養(yǎng)4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)12 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期，培養(yǎng)20 h后進(jìn)入衰亡期。由圖5可知，隨著細(xì)菌的不斷增殖，產(chǎn)酸不斷積累，0～12 h pH迅速下降，12～16 h pH下降緩慢，16 h后趨于穩(wěn)定，最終pH穩(wěn)定在3.8。

圖4 YY001株的生長(zhǎng)曲線

圖5 YY001株的產(chǎn)酸曲線

2.4 耐受試驗(yàn)

YY001株分別經(jīng) pH 3.0、2.5和2.0 PBS,0.3%、0.2%和0.1%膽鹽，以及常規(guī)PBS(pH 7.0)處理后，活菌數(shù)分別為9.1×108、2.1×107、1.9×107、1.78×107、3.0×105、2.37×106和2.52×106CFU/mL，菌株在不同pH和不同膽鹽濃度下均具有一定的存活率(圖6)，說(shuō)明菌株對(duì)酸、膽鹽環(huán)境均具有一定的耐受能力。

圖6 YY001株耐受試驗(yàn)結(jié)果

2.5 抑菌試驗(yàn)

由圖7可知，YY001株對(duì)嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和柱狀黃桿菌均有一定的抑制作用。其中，對(duì)柱狀黃桿菌的抑制效果最好，抑菌圈直徑為34.19 mm；對(duì)嗜水氣單胞菌的抑制效果次之，抑菌圈直徑為14.56 mm；對(duì)維氣氏單胞菌的抑制作用效果最弱，抑菌圈直徑為11.77 mm。

①A，維氣氏單胞菌；B，嗜水氣單胞菌；C，柱狀黃桿菌。②空白，MRS肉湯對(duì)照

2.6 藥物敏感性試驗(yàn)

由表1可知，YY001株對(duì)四環(huán)素、紅霉素、克林霉素和氯霉素表現(xiàn)為敏感；對(duì)慶大霉素表現(xiàn)為中度敏感；對(duì)卡那霉素、鏈霉素和萬(wàn)古霉素表現(xiàn)為耐藥。

表1 YY001的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 小鼠安全性試驗(yàn)

連續(xù)灌胃分離菌YY001 1周后，試驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠均呈現(xiàn)生長(zhǎng)狀況健康良好，無(wú)發(fā)病和死亡。說(shuō)明108CFU YY001株對(duì)小鼠無(wú)毒害作用。

3 討 論

近年來(lái)，益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究取得了很大進(jìn)展[13]。已有大量研究證實(shí)，益生菌在凡納濱對(duì)蝦、泥鰍、中華鱉、草魚(yú)、斜帶石斑魚(yú)、刺身[14-17]等水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用都有較好的效果。但目前水產(chǎn)養(yǎng)殖用益生菌大多來(lái)自非水生生物，有研究報(bào)道宿主源性益生菌具有更好的定植能力，從而促進(jìn)更優(yōu)的益生特性[18]；曾東[19]已證實(shí)從鯉腸道及養(yǎng)殖水體中分離到的益生菌相較其他從陸生動(dòng)物中分離的益生菌，在鯉魚(yú)腸道中具有更好的適應(yīng)性和應(yīng)用性。所以本研究從鯉魚(yú)腸道內(nèi)容物及黏膜中分離鯉魚(yú)源性益生菌菌株，以期應(yīng)用于鯉魚(yú)微生態(tài)制劑的研制。

本研究分離到的植物乳桿菌在耐酸及膽鹽試驗(yàn)中，在不同pH條件下具有較好的耐受力，在不同濃度的膽鹽條件下均具有耐受力，在0.3%膽鹽濃度下與對(duì)照組相比存活率相對(duì)較差。菌株耐膽鹽能力較差的情況可能是因?yàn)轷庺~(yú)屬于無(wú)胃魚(yú)類，腸道pH約為中性環(huán)境且無(wú)膽鹽[20]，所以對(duì)膽鹽的耐受力不強(qiáng)。

植物乳桿菌可通過(guò)代謝產(chǎn)生有機(jī)酸包括乳酸、丙酸、丁酸和細(xì)菌素等有益物質(zhì)，從而抑制腸道有害微生物生長(zhǎng)[21-22]。張洪玉[23]用植物乳桿菌飼喂斑點(diǎn)叉尾鮰，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組腸道內(nèi)致病菌的比例顯著降低，可減少斑點(diǎn)叉尾鮰腸道疾病暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。本試驗(yàn)中分離到的植物乳桿菌對(duì)水產(chǎn)常見(jiàn)致病菌柱狀黃桿菌、維氣氏單胞菌和嗜水氣單胞菌均抑菌作用，且該菌株對(duì)柱狀黃桿菌的抑菌效果顯著，說(shuō)明分離到的植物乳桿菌可作為鯉魚(yú)微生態(tài)制劑候選菌株，有望降低鯉魚(yú)腸道疾病的發(fā)生。

近年來(lái)，耐藥菌不斷出現(xiàn)，其攜帶耐藥基因的傳播日益受到人們的關(guān)注，長(zhǎng)期以來(lái)細(xì)菌耐藥性和耐藥基因研究主要集中在病原菌上，而對(duì)益生菌的耐藥性研究相對(duì)較少[24]。隨著益生菌的不斷開(kāi)發(fā)利用，益生菌的耐藥性被作為益生菌安全性評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。本研究藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)四環(huán)素、紅霉素、克林霉素和氯霉素表現(xiàn)為敏感，對(duì)慶大霉素表現(xiàn)為中度敏感，表明分離株對(duì)多數(shù)水產(chǎn)常用抗生素敏感；對(duì)卡那霉素、鏈霉素和萬(wàn)古霉素耐藥，這可能與生長(zhǎng)環(huán)境不同及抗生素濫用導(dǎo)致耐藥性等因素有關(guān)，本試驗(yàn)分離菌株的耐藥基因是否會(huì)傳遞還需進(jìn)一步試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。

4 結(jié) 論

本研究從健康鯉魚(yú)腸道中分離到1 株乳酸菌，通過(guò)16S rRNA 基因測(cè)序比對(duì)，確定該菌株為植物乳酸桿菌，將其命名為YY001。該分離株具有較好的耐酸耐膽鹽性能、產(chǎn)酸能力強(qiáng)和能有效抑制水產(chǎn)常見(jiàn)致病菌等優(yōu)良生物學(xué)特性，有望作為水產(chǎn)養(yǎng)殖微生態(tài)制劑的益生菌種。