液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測豬血漿中除蟲脲的方法學(xué)研究

徐玉珍，劉希望，秦 哲，李世宏，白莉霞，范麗萍，魏彥明，李劍勇，楊亞軍

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室，甘肅省新獸藥工程重點實驗室，蘭州 730050)

除蟲脲(diflubenzuron，DFB)，又名二氟隆，化學(xué)名為1-(4-氯苯基)-3-(2,6-二氟苯甲?；?脲，CAS號為35367-38-5，分子式為C14H9F2N2O2Cl。DFB屬于苯甲酰脲類化合物[1-3]，是昆蟲生長調(diào)節(jié)劑，可抑制幾丁質(zhì)合成酶的活性，使昆蟲幼蟲在蛻皮時不能形成新表皮，導(dǎo)致蟲體發(fā)育受阻、畸形而死亡，從而影響昆蟲的整個世代[4]。DFB作為一種新型殺蟲劑，具有高效、低毒、低殘留等特點，能夠有效控制種植業(yè)和林業(yè)作物中大部分害蟲的幼蟲，對動物體內(nèi)外及養(yǎng)殖環(huán)境中寄生昆蟲的幼蟲亦有很好的抑制作用[5]。

目前，在國內(nèi)外養(yǎng)殖場中常用的滅蠅藥物主要有環(huán)丙氨嗪[6-10]、有機磷類和菊酯類藥物[11-12]，以及苦參、魚藤、黃荊等中藥制劑[13]；其中，環(huán)丙氨嗪作為口服滅蠅蛆藥，在國內(nèi)僅批準(zhǔn)用于雞[14]，尚未批準(zhǔn)用于其他動物。在美國、德國和巴西等國家，DFB已被批準(zhǔn)作為口服滅蠅蛆藥，用于豬、牛、羊等動物養(yǎng)殖場環(huán)境中病媒昆蟲幼蟲的防控[15-17]。

本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)建立了豬血漿中DFB濃度的檢測方法，以明確豬灌服DFB預(yù)混劑后，其活性成分在豬體內(nèi)的吸收、分布和排泄的特點。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

采集6頭體重為(40±5)kg健康商品化雜交豬的空白血漿，來自甘肅省定西市六禾生態(tài)農(nóng)牧養(yǎng)殖場，肝素鈉抗凝。DFB標(biāo)準(zhǔn)品(批號：19001，99.8%)，結(jié)構(gòu)式見圖1，購自中國計量科學(xué)研究院；DFB同位素內(nèi)標(biāo)除蟲脲-13C6(DFB-13C6)(批號：31241403)，結(jié)構(gòu)式見圖1，購自Witega公司；甲醇(批號：203398，質(zhì)譜純)，購自Merck生命科學(xué)(上海)有限公司；甲酸銨(批號：186247A，質(zhì)譜純)、甲酸(批號：202674，質(zhì)譜純)、乙腈(批號：201643，質(zhì)譜純)均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；二甲基亞砜(DMSO)(批號：SHBH2446V，分析純)購自Merck生命科學(xué)(上海)有限公司；甲醇(批號：20210114，分析純)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；豬血漿(肝素鈉抗凝，批號：M14GM148518)購自上海源葉生物科技有限公司。

圖1 DFB(A)及DFB-13C6(B)結(jié)構(gòu)式

1.2 主要儀器

液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 1200-6410A)，購自Agilent Technologies公司；大容量低溫離心機(Multifuge X3R)購自Thermo Scientific公司；樣品快速蒸發(fā)系統(tǒng)(RapidVap)購自Labconco公司；分析天平(QUINTIX65-1CN60G型)購自Sartorius公司；渦旋混合器(Vortex-2Genie)購自Scientific industries公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18柱(3 mm×50 mm，1.8 μm)；流動相A為甲醇，流動相B為0.1%甲酸水(含5 mmol/L甲酸銨)，梯度洗脫程序見表1；流速為0.4 mL/min；柱溫為35 ℃；進樣量為10 μL。

表1 梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，毛細(xì)管電壓為+4 000 V；噴霧器壓力為30 psi；干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流量(氮氣)為10 L/min；電子倍增器電壓增加值(ΔEMV)為+300 V，采用多反應(yīng)離子檢測(MRM)模式進行檢測。優(yōu)化后的MRM參數(shù)見表2。

表2 DFB的MRM參數(shù)

1.3.3 溶液的制備 DFB標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取DFB標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加入1 mL DMSO，水浴超聲，以使完全溶解，完全轉(zhuǎn)入10 mL量瓶中，以甲醇稀釋并定容至刻度，即為質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃存放。將DFB標(biāo)準(zhǔn)儲備液以10% DMSO甲醇溶液逐步稀釋至100 000、1 000、800、400、100、20、2、1和0.5 ng/mL，作為中間標(biāo)準(zhǔn)儲備液及標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DFB-13C6標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取DFB-13C65 mg，以甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃存放。以甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 豬血漿樣品的處理 取豬血漿0.5 mL于5 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液10 μL，渦旋混勻，加2 mL甲醇，渦旋混勻1 min，4 ℃條件下4 500×g離心10 min，將上清夜轉(zhuǎn)移至另一5 mL離心管中，45 ℃條件下減壓濃縮至干，以500 μL甲醇-水(1∶1)完全溶解殘渣，過0.22 μm尼龍濾膜，進行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測定。

1.4 方法學(xué)驗證

1.4.1 專屬性 取1.1采集的空白豬血漿，加入內(nèi)標(biāo)后，依1.3.4項下的方法進行處理、檢測，記錄目標(biāo)分析物的色譜圖，以考察DFB標(biāo)準(zhǔn)溶液、不同來源代表性的空白血漿、加標(biāo)空白血漿樣品等不同來源的基質(zhì)對DFB檢測的干擾。

1.4.2 最低檢測限和最低定量限 移取0.5 mL空白豬血漿，加入1.3.3制備的不同濃度DFB標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及內(nèi)標(biāo)工作溶液，渦旋混勻，制備成DFB加標(biāo)樣品，依1.3.4項下的方法進行處理、檢測，記錄色譜圖，計算DFB定量離子的信噪比(SNR，按照峰高對峰高比)，結(jié)合準(zhǔn)確度及精密度試驗的結(jié)果，以確定方法的最低檢測限(LOD)和最低定量限(LOQ)。

1.4.3 基質(zhì)效應(yīng) 移取0.5 mL空白豬血漿，依1.3.4項下的方法進行處理并復(fù)溶；加入內(nèi)標(biāo)工作液及1.3.3制備的不同濃度DFB標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各10 μL，制備成低(2 ng/mL)、高濃度(800 ng/mL)水平的處理樣品，每個濃度6個平行，依1.3.4項下的方法進行處理、檢測，與相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的定量離子峰面積進行比較?？疾?批不同來源的空白豬血漿，以評價方法的基質(zhì)效應(yīng)。

1.4.4 線性范圍 以10%的DMSO甲醇溶液為溶劑，制備DFB濃度分別為最低定量限至1 000 ng/mL，內(nèi)標(biāo)濃度均為20 ng/mL的系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，依1.3.4項下的方法進行LC-MS/MS檢測，以DFB與內(nèi)標(biāo)濃度的比值為橫坐標(biāo)，以DFB與內(nèi)標(biāo)定量離子的峰面積比值為縱坐標(biāo)，根據(jù)試驗結(jié)果，選取以1/x、1/y或1/x2等合適的加權(quán)方式，進行線性回歸。

1.4.5 準(zhǔn)確度和精密度 移取0.5 mL空白豬血漿，加入1.3.3制備的不同濃度DFB標(biāo)準(zhǔn)工作溶液10 μL，配制成DFB濃度分別為最低定量限及低(2 ng/mL)、中(100 ng/mL)、高濃度(800 ng/mL)的血漿樣品，加入內(nèi)標(biāo)，依1.3.4項下的方法進行處理、檢測。每個濃度水平6個平行，考察方法的準(zhǔn)確度、精密度在批內(nèi)及批間的變異情況。

1.4.6 穩(wěn)定性

1.4.6.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性 精密稱取DFB標(biāo)準(zhǔn)品，依1.3.3項下的方法配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，并稀釋成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間儲備溶液，分裝后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。分別于存放后的15和60 d取出，進行適當(dāng)稀釋后，與新配制的對應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液進行比較，內(nèi)標(biāo)法考察儲備溶液的穩(wěn)定性。

1.4.6.2 樣品穩(wěn)定性 移取0.5 mL空白豬血漿，依1.3.4項下的方法，分別制備低(2 ng/mL)、高(800 ng/mL)濃度水平的豬血漿加標(biāo)樣品，進行如下考察：將加標(biāo)樣品于-20 ℃分別凍存30和60 d后，考察存放穩(wěn)定性；將加標(biāo)樣品于—20 ℃凍存后，室溫下融化，反復(fù)3次，考察凍融穩(wěn)定性；將樣品處理后，于進樣前分別4 ℃冷藏12 h，及室溫不避光放置12 h，以考察樣品處理液的穩(wěn)定性。

2 結(jié) 果

2.1 專屬性

依前述方法，對DFB標(biāo)準(zhǔn)溶液2 ng/mL(圖2)、不同來源代表性的空白血漿(圖3)、加標(biāo)空白血漿樣品2 ng/mL(圖4)進行處理并檢測。如圖所示，在DFB出峰的位置，未發(fā)現(xiàn)明顯干擾，表明該方法選擇性好，血漿基質(zhì)對DFB和內(nèi)標(biāo)的檢測無干擾。

A，DFB定量離子對311.1→158.1*；B，DFB-13C6定量離子對317.1→158.1*。圖2～4同

圖3 空白豬血漿的代表性MRM色譜圖

圖4 加標(biāo)空白豬血漿的MRM色譜圖(2 ng/mL)

2.2 LOD和LOQ

當(dāng)空白豬血漿中DFB的添加濃度分別為0.5和1 ng/mL時，DFB定量離子的SNR均大于3和10(表3)，典型的檢測色譜圖見圖5。本方法的LOD和LOQ分別可以達到0.5和1 ng/mL。

表3 空白血漿加標(biāo)樣品的信噪比檢測結(jié)果

A，0.5 ng/mL，Rt 5.06 min，311.1→158.1*的SNR為26.7；B，1 ng/mL，Rt 5.06 min，311.1→158.1*的SNR為41.4

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)的考察結(jié)果如表4所示，結(jié)果顯示，方法的基質(zhì)效應(yīng)平均值在93.14%～107.94%之間，且基質(zhì)效應(yīng)的變異系數(shù)<10%，均符合檢測要求。

表4 DFB在豬血漿的基質(zhì)效應(yīng)

2.4 線性范圍

以1/x為權(quán)重，進行加權(quán)線性回歸。結(jié)果表明，在1～1 000 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.0197x+0.0076，R2=0.998，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6。

圖6 DFB標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5 準(zhǔn)確度和精密度

當(dāng)血漿中DFB的濃度分別為0.5和1 ng/mL時，定量離子的SNR滿足定性和定量檢測的要求。因此，以血漿中DFB濃度分別為0.5、1、2、100和800 ng/mL的樣品，進行準(zhǔn)確度和精密度考察。結(jié)果見表5。方法的批內(nèi)和批間平均準(zhǔn)確度在97.78%～115.06%之間，批內(nèi)和批間精密度的變異系數(shù)均<10%，滿足定量檢測的要求。

表5 DFB在豬血漿中的準(zhǔn)確度與精密度

2.6 穩(wěn)定性

標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性、加標(biāo)樣品的凍存穩(wěn)定性考察結(jié)果見表6，表明儲備液、加標(biāo)樣品凍存在-20 ℃條件下存放60 d較為穩(wěn)定。加標(biāo)樣品凍融穩(wěn)定性及處理后的穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表7、8。不同處理條件下DFB在溶劑和血漿基質(zhì)中的準(zhǔn)確度和精密度在要求范圍內(nèi)，表明DFB在上述條件下穩(wěn)定性良好，能滿足測定要求。

表6 DFB不同條件下穩(wěn)定性(準(zhǔn)確度)

表7 加標(biāo)樣品凍融的穩(wěn)定性(準(zhǔn)確度)

表8 樣品處理后放置12 h穩(wěn)定性變化結(jié)果(含量變化率)

3 討 論

在配制DFB標(biāo)準(zhǔn)溶液時常用的溶劑主要有乙腈、甲醇等，但是DFB在其中的溶解度較小，凍存條件下易于析出結(jié)晶，使用時需要進行再次超聲溶解[18-20]。DFB在DMSO中極易溶解，因此本試驗以10%DMSO甲醇為溶劑，可以很好的溶解DFB，—20 ℃長期存放時未見析出。

本試驗考察了乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-水(5 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸)、甲醇-水(5 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸)等不同流動相，結(jié)果顯示，在不同的流動相條件下，目標(biāo)色譜峰形良好，主峰無拖尾現(xiàn)象，分離效果良好。但以甲醇作為流動相時，DFB的檢測結(jié)果更為穩(wěn)定；因此，以甲醇-水(5 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸)為流動相。

研究報道顯示，動植物及土壤樣本中DFB檢測的常用方法為高效液相色譜法(HPLC-UV)和LC-MS/MS[18,21-23]。劉艷萍等[21]用HPLC-UV方法測定荔枝中DFB的殘留，結(jié)果顯示，LOD為10 μg/kg，該濃度下DFB在全果肉中的平均回收率為82.70%。劉錦霞等[23]通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測豬肉中DFB等10種苯甲酰胺類殺蟲劑的殘留，外標(biāo)法定量，結(jié)果顯示，該方法的LOD為5 μg/kg，回收率在86.4%～99.4%范圍內(nèi)。然而，關(guān)于動物血液中DFB濃度檢測的相關(guān)文獻報道卻較少。

相關(guān)研究資料顯示[24]，DFB對大鼠的口服劑量為4 mg/kg時，其經(jīng)尿液和膽汁的排泄量為總給藥量的50%；當(dāng)口服給藥劑量為900 mg/kg時，則下降為4%。另有研究將雙苯環(huán)經(jīng)14C標(biāo)記的DFB以5 mg/kg的劑量(推薦給藥劑量為0.3 mg/kg)對豬口服給藥，結(jié)果顯示，給藥量的82%以原形經(jīng)糞便排出，5%經(jīng)尿液排出[25]。說明在大劑量單次給藥后，DFB在豬腸道的吸收很少。Tfouni等[17]在9頭肉牛和20頭奶牛體內(nèi)開展了DFB的殘留試驗，折算后每頭動物DFB的攝入量為30 mg/d，肉牛連續(xù)給藥120 d，奶牛連續(xù)給藥77 d，HPLC-UV法檢測肉?？墒承越M織及牛奶中DFB的殘留量；該方法在肌肉、脂肪、肝臟、腎臟和牛奶中的LOD分別為14、6、16、15和0.6 μg/kg，LOQ分別為50、50、50、50和10 μg/kg,結(jié)果顯示，在給藥結(jié)束后的24 h內(nèi)，各可食性組織和牛奶中均未檢出DFB。以上結(jié)果表明，DFB在動物腸道的吸收較少，主要隨糞便排出體外，血藥濃度較低。

因此，在考察DFB口服給藥的藥代動力學(xué)特征時，血藥濃度的檢測方法應(yīng)具有較高的靈敏度，檢測限應(yīng)該相對較低。故本研究采用LC-MS/MS建立了豬血漿中DFB濃度的測定方法。在LC-MS/MS的檢測過程中，采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記物DFB-13C6為內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)法定量提高了方法的靈敏度與準(zhǔn)確性。在保證信噪比、準(zhǔn)確度和精密度等方法學(xué)要求的前提下，本方法的LOD可以達到0.5 ng/mL，平均準(zhǔn)確度在97.78%～115.06%之間。因此，該方法可以避免因口服給藥后血漿中藥物含量低，導(dǎo)致無法準(zhǔn)確測定藥物濃度的情況。

本研究所建立的豬血漿中DFB測定方法，其樣品前處理方法操作簡單，儀器靈敏度高，準(zhǔn)確度和精密度等符合生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則[26]的要求，適用于豬血漿中DFB濃度的檢測，可用于評價DFB預(yù)混劑口服給藥后在豬體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征。

4 結(jié) 論

本研究通過LC-MS/MS建立的豬血漿中DFB檢測方法簡便，專屬性強，靈敏度高(LOD 0.5 ng/mL，LOQ 1 ng/mL)，準(zhǔn)確(準(zhǔn)確度在97.78%～115.06%)，可靠(精密度均<10%)，樣品的穩(wěn)定性滿足檢測要求，適用于DFB預(yù)混劑在豬體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究。