復(fù)合添加劑對(duì)解凍后奶牛性控凍精質(zhì)量及受胎率的影響

許曉玲，白佳樺，肖霖力，秦玉圣，宋玉清，劉 彥

(北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097)

奶牛性控凍精可以按照實(shí)際生產(chǎn)需求繁育出更多的優(yōu)良母牛，是良種快速擴(kuò)繁的重要技術(shù)手段。特別是近年來(lái)隨著分離技術(shù)的發(fā)展，性控精液X精子分離準(zhǔn)確率為85%～95%[1]。人工授精后性控母犢率高達(dá)95.45%，與普通凍精47.37%的母犢率相比，優(yōu)勢(shì)特別明顯[2]。但是，在性控凍精制作過(guò)程中需要對(duì)精液進(jìn)行稀釋、染色、流式分離、冷凍等體外操作，導(dǎo)致其在凍融后的精子活力、頂體完整率及受精率等重要指標(biāo)方面顯著低于常規(guī)冷凍精液[3]。同時(shí)，性控凍精普遍存在輸精后受胎率不高的問(wèn)題，因此限制了該項(xiàng)技術(shù)在奶牛特別是經(jīng)產(chǎn)奶牛生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。

褪黑素(melatonin)是一種主要由松果體分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，其在生物節(jié)律、生殖、免疫、抗氧化等方面發(fā)揮著重要作用。多項(xiàng)研究表明，在冷凍精液稀釋液中添加褪黑素可以顯著提高解凍后精子活力、動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)[4-5]以及精子頂體膜、質(zhì)膜的完整性[6]。前列腺素(prostaglandin，PGF2α)是存在于動(dòng)物和人體中的一類(lèi)由不飽和脂肪酸組成的、具有多種生理作用的活性物質(zhì)，最早是在人精液中發(fā)現(xiàn)的，主要來(lái)自精囊；此后發(fā)現(xiàn)其存在于動(dòng)物體睪丸、子宮、胎盤(pán)及卵巢等多種組織。研究表明，在人工授精前1～2 h，用輸精管吸入2 mL PGF2α注射到子宮頸分叉處，可以提高奶牛輸精后的受胎率[7]；在解凍后精液中添加1.5 mg/mL PGF2α也可顯著提高奶牛的受胎率[8]。但褪黑素和前列腺素兩者組合后對(duì)解凍后奶牛性控凍精的作用鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本研究開(kāi)展了以褪黑素、地諾前列腺素為主的精液復(fù)合添加劑對(duì)性控凍精解凍后精子活率、運(yùn)動(dòng)參數(shù)、頂體完整性、高能線粒體比例及受胎率的影響，以期為提高奶牛場(chǎng)良種覆蓋率提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

褪黑素、碘化丙啶(PI)、Hochest 33342、FITC-PNA均購(gòu)自Sigma公司；JC-1試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；Steridyl?精液稀釋液購(gòu)自Minitube公司；地諾前列腺素(dinoprostin)購(gòu)自輝瑞公司。

用于精液品質(zhì)分析的牛性控凍精購(gòu)自北京首農(nóng)畜牧發(fā)展有限公司奶牛中心(308H017803、308H016683、11109693)；用于牛場(chǎng)輸精試驗(yàn)所用性控凍精購(gòu)自荷蘭CRV奶牛育種公司(151HO03369、551HO03416)。

1.2 試驗(yàn)處理

從液氮中取出30支0.25 mL奶牛性控凍精細(xì)管，分為2組：試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組15支，37 ℃水浴鍋中解凍30 s。剪開(kāi)細(xì)管封口，將精液加入到37 ℃預(yù)熱的250 μL精液復(fù)合添加劑(試驗(yàn)組)或250 μL精液稀釋液(對(duì)照組)EP管中，混勻。將混合物室溫孵育0、2和4 h后，用于后續(xù)精液品質(zhì)檢測(cè)試驗(yàn)。試驗(yàn)組中褪黑素和地諾前列腺素的終濃度分別為24 ng/mL和1.5 mg/mL。

1.3 精液品質(zhì)測(cè)定

1.3.1 性控凍精活率 取孵育后的性控凍精混合物100 μL，添加5 μL PI和5 μL Hochest 33342置于37 ℃水浴鍋避光孵育10 min。取出10 μL制片，置于熒光顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)視野里的死精子數(shù)(紅色)和總精子數(shù)(藍(lán)色)，計(jì)算精子活率。每個(gè)樣品取5個(gè)視野計(jì)算平均值。計(jì)算公式為：

精子活率(%)=(總精子數(shù)―死精子數(shù))/總精子數(shù)×100%

1.3.2 精子頂體完整性 取孵育后的性控凍精混合物100 μL，添加5 μL PI、5 μL Hochest 33342及10 μL FITC-PNA，置于37 ℃水浴鍋避光孵育30 min。取出10 μL制片，置于熒光顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)視野里的死精子數(shù)(紅色)和總精子數(shù)(藍(lán)色)，以及發(fā)生頂體反應(yīng)或頂體破損精子數(shù)(綠色)，計(jì)算活精子中沒(méi)有頂體反應(yīng)的精子數(shù)占總精子數(shù)的比例。每個(gè)樣品取5個(gè)視野計(jì)算平均值。計(jì)算公式為：

頂體完整率(%)=(總精子數(shù)-染綠色精子數(shù)-染紅色精子數(shù))/總精子數(shù)×100%

1.3.3 精子高能線粒體活性 取孵育后的性控凍精混合物100 μL，添加5 μL PI、5 μL Hochest 33342及10 μL JC-1，置于37 ℃水浴鍋避光孵育10 min。取出10 μL制片，置于熒光顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)高能線粒體(紅色)的精子數(shù)占總精子數(shù)的比例。每個(gè)樣品取5個(gè)視野計(jì)算平均值。

1.4 人工授精試驗(yàn)

從液氮中取出多支0.25 mL奶牛性控凍精細(xì)管，迅速置于37 ℃恒溫水浴鍋中解凍30 s，將37 ℃預(yù)熱的復(fù)合添加劑(試驗(yàn)組)或精液稀釋液(對(duì)照組)按照1∶1的比例添加到解凍后的性控精液中，用于發(fā)情周期正常的216頭青年母牛(對(duì)照組101頭、試驗(yàn)組115頭)及子宮環(huán)境良好的82頭頭胎母牛(對(duì)照組26頭、試驗(yàn)組56頭)輸精。輸精時(shí)間嚴(yán)格控制在排卵前的3～5 h內(nèi)進(jìn)行。同時(shí)，通過(guò)直腸把握確定優(yōu)勢(shì)卵泡位置，采用子宮體深部輸精，輸精28 d后采用血檢確定妊娠情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)合添加劑對(duì)性控凍精精子品質(zhì)的影響

2.1.1 復(fù)合添加劑對(duì)性控凍精活率的影響 通過(guò)對(duì)復(fù)合添加劑孵育0、2及4 h后的性控凍精進(jìn)行PI和Hochest 33342 染色，染色情況見(jiàn)圖1，其中PI染紅色代表死精子，Hochest 33342染藍(lán)色代表總精子。由表1可知，孵育0 h，試驗(yàn)組及對(duì)照組性控凍精活率分別為45.82%和44.68%，差異不顯著(P>0.05)；孵育2 h，試驗(yàn)組性控凍精活率為39.03%，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；孵育4 h，試驗(yàn)組及對(duì)照組性控凍精活率分別為21.19%和20.17%，差異不顯著(P>0.05)。

圖1 精子活率檢測(cè)(400×)

表1 奶牛性控凍精經(jīng)復(fù)合添加劑孵育后不同時(shí)間的精子活率

2.1.2 復(fù)合添加劑對(duì)性控凍精頂體完整性的影響 對(duì)復(fù)合添加劑孵育0、2及4 h后的精子頂體完整性進(jìn)行檢測(cè)，染色結(jié)果見(jiàn)圖2，其中FITC-PNA染綠色代表發(fā)生頂體反應(yīng)或頂體破損的精子，PI染紅色代表死精子，Hochest 33342染藍(lán)色代表總精子。由表2可知，孵育0 h，試驗(yàn)組和對(duì)照組精子頂體完整性分別為48.92%和48.31%，差異不顯著(P>0.05)；孵育2 h，試驗(yàn)組精子頂體完整率為38.91%，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；孵育4 h，試驗(yàn)組和對(duì)照組精子頂體完整性分別為26.62%和24.95%，差異不顯著(P>0.05)。

圖2 精子頂體完整性檢測(cè)(400×)

表2 奶牛性控凍精經(jīng)復(fù)合添加劑孵育后不同時(shí)間的頂體完整率

2.1.3 復(fù)合添加劑對(duì)性控凍精線粒體活性的影響 通過(guò)對(duì)復(fù)合添加劑孵育0、2及4 h后的精子線粒體活性進(jìn)行染色，染色結(jié)果見(jiàn)圖3，JC-1染紅色代表高能線粒體精子，Hochest 33342染藍(lán)色代表總精子。由表3可知，孵育0 h，試驗(yàn)組精液中高能線粒體活性精子比率為35.20%，與對(duì)照組間差異不顯著(P>0.05)；孵育2和4 h，試驗(yàn)組精液中高能線粒體活性精子比率分別為32.76%和24.90%，均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

圖3 精子線粒體活性染色(400×)

表3 奶牛性控凍精經(jīng)復(fù)合添加劑孵育后不同時(shí)間的高能線粒體活性精子比率

2.2 復(fù)合添加劑對(duì)奶牛性控凍精受胎率的影響

將37 ℃預(yù)熱的復(fù)合添加劑按照1∶1的比例添加到解凍后的性控精液中，分別用于青年奶牛和頭胎奶牛的輸精試驗(yàn)，輸精后28 d采血進(jìn)行早期妊娠診斷確定配種受胎情況，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，試驗(yàn)組青年奶牛和頭胎奶牛受胎率分別為65.22%和48.21%，均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表4 奶牛性控凍精添加復(fù)合添加劑后的受胎率

3 討 論

3.1 復(fù)合添加劑對(duì)奶牛性控凍精品質(zhì)的影響

奶牛性控凍精可根據(jù)牛場(chǎng)發(fā)展的需求較短時(shí)間內(nèi)獲得更多的優(yōu)良母犢后代，從而實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖利潤(rùn)的最大化。隨著流式細(xì)胞分離技術(shù)的不斷發(fā)展，性控精子分離效率和準(zhǔn)確率都在不斷提高，生產(chǎn)成本也在不斷降低。但由于性控凍精受精能力遠(yuǎn)低于常規(guī)凍精，因此在一定程度上限制了其在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。研究表明，性控凍精受精能力低與其制備分選時(shí)染料、附加電荷、分離壓力、高度稀釋、冷凍、長(zhǎng)時(shí)間體外操作等引起氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量活性氧(ROS)有關(guān)，大量的ROS改變了精子結(jié)構(gòu)功能，使精子出現(xiàn)DNA片段化、脂質(zhì)過(guò)氧化、頂體完整性與活力降低[9]，從而抑制了精子受精能力[10-13]。針對(duì)以上問(wèn)題，不少研究者通過(guò)在精液冷凍保護(hù)液液中添加維生素、谷胱甘肽、半胱氨酸、海藻糖、褪黑素、槲皮素、白藜蘆醇等抗氧化物來(lái)緩解冷凍精液的氧化損傷，效果顯著。孫偉[14]研究表明，通過(guò)添加抗氧化劑(VE、SOD、CAT)可以明顯提升奶牛分離X精子的活力和體外存活時(shí)間。但這些研究主要集中在冷凍保護(hù)劑中，在性控凍精分選中及分選后的研究相對(duì)較少。Li等[15]研究表明，在水牛精液中補(bǔ)充10-4mol/L褪黑素可以有效減少性控精液分選和凍融過(guò)程產(chǎn)生ROS引起的氧化損傷；褪黑素在精子冷凍中的作用機(jī)制可能是通過(guò)改變激酶的活性從而降低了精子的冷凍損傷[16-17]。Li等[18]研究表明，褪黑素主要是通過(guò)抑制凋亡和MT1受體來(lái)促進(jìn)牛性控凍精的受精能力。Pang等[19]在解凍后的奶牛常規(guī)精液中添加10-5和10-3mol/L褪黑素可以顯著增加精子頂體完整性、線粒體活性，顯著降低胞內(nèi)ROS水平。這與本試驗(yàn)在性控精液中的研究結(jié)果是一致的。本研究通過(guò)對(duì)解凍后性控凍精添加以褪黑素和地諾前列腺素為主的復(fù)合添加劑孵育2 h后，精子活率、頂體完整性、高能線粒體活性精子比率均顯著增加。因此，復(fù)合添加劑中褪黑素作為強(qiáng)氧化劑，在精液冷凍、精液分選及精液解凍后都具有提高其活力、減少氧化應(yīng)激的作用，為提高輸精后的受胎率奠定了基礎(chǔ)。

3.2 復(fù)合添加劑對(duì)性控凍精受胎率的影響

性控凍精解凍后存活時(shí)間短，輸精后受胎率也比普通凍精低。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中性控凍精的推廣使用受到了一定限制，特別是在經(jīng)產(chǎn)母牛中很少使用。與常規(guī)精液人工授精相比，性控凍精人工授精情期受胎率可降低15%～20%[20]。青年奶牛第1次使用性控凍精配種妊娠率為41.11%(761/1 851)，返情牛第2次配種妊娠率為36.52%(42/115)[21]。不同研究表明，用性控精液給奶牛進(jìn)行人工授精后青年牛的受胎率顯著高于經(jīng)產(chǎn)母牛。吳洪等[22]研究表明，青年牛和成母牛性控凍精受胎率分別為55.60%(93/167)和48.20%(198/411)，兩者差異顯著。本研究中，青年奶牛的受胎率高于頭胎奶牛，且復(fù)合添加劑組青年奶牛和頭胎奶牛的受胎率分別為65.22%和48.21%，均顯著高于對(duì)照組。復(fù)合添加劑主要成分是褪黑素和地諾前列腺素，褪黑素可以直接參與卵泡的發(fā)育與排卵，提高牛卵母細(xì)胞成熟率及胚胎的發(fā)育率[23-24]；在配種同時(shí)體外注射10-3～10-1mol/L褪黑素可以有效提高奶牛受胎率[25]。此外，在解凍后凍精及輸精前的子宮頸中添加PGF2α均可提高奶牛的受胎率[7-8]。因此，復(fù)合添加劑促進(jìn)性控凍精的受胎率不僅是因?yàn)闇p少了性控凍精的氧化損傷，提高凍精在生殖道的運(yùn)動(dòng)能力，還可能是因?yàn)榇龠M(jìn)了卵泡的及時(shí)排卵，增加了精卵結(jié)合的機(jī)會(huì)。

4 結(jié) 論

以褪黑素和地諾前列腺素為主的精液復(fù)合添加劑能夠提高解凍后奶牛性控凍精的精子活率、頂體完整率、高能線粒體活性精子比率以及輸精后的受胎率。