bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c靶基因預(yù)測及生物信息學(xué)分析

杜鑫澤，馬鑫浩，張殿琦，杜嘉偉，馬 婧，謝琨成，何 杰，昝林森，2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，楊凌 712100；2.國家肉牛改良中心，楊凌 712100；3.西安市奶牛育種中心，西安 710000)

在雄性哺乳動物中，精子發(fā)生是一個復(fù)雜且受多種途徑精密調(diào)控的生理過程，主要經(jīng)歷4個階段：第一階段，A0型精原細(xì)胞有絲分裂經(jīng)歷A1-A4精原細(xì)胞、中間型精原細(xì)胞、B型精原細(xì)胞并最終形成初級精母細(xì)胞；第二階段，初級精母細(xì)胞開始第一次減數(shù)分裂形成次級精母細(xì)胞；第三階段，初級精母細(xì)胞進(jìn)行第二次減數(shù)分裂形成圓形精子細(xì)胞；第四階段，圓形精子細(xì)胞經(jīng)過一系列變形分化為成熟精子[1]。在精子發(fā)生的整個過程中，雄性生殖細(xì)胞分化過程具有復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，除了編碼蛋白質(zhì)的mRNA外，許多非編碼RNA如微小RNA(microRNA,miRNA)、piwi相互作用RNA(PIWI interacting RNA,piRNA)、環(huán)狀RNA(circularRNA,circRNA)、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)等都發(fā)揮著重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。

miRNA是一類進(jìn)化上高度保守的長度在22 nt左右的小分子非編碼RNA，miRNA可以參與調(diào)控包括性成熟、睪丸發(fā)育、精子發(fā)生在內(nèi)的諸多生物學(xué)過程，其在精子發(fā)生過程中以細(xì)胞特異性或階段特異性方式表達(dá)[2]。靶向mRNA的3′-UTR以實現(xiàn)基因沉默是miRNA的經(jīng)典作用機(jī)制[3]，miRNA常通過與靶向mRNA的3′-UTR中的互補(bǔ)序列結(jié)合，并通過與多蛋白RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)相互作用來加速轉(zhuǎn)錄物衰減或翻譯抑制來抑制基因表達(dá)[4]。miRNA在眾多生物學(xué)途徑中的作用突出了轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的復(fù)雜性。研究表明，miRNA的表達(dá)具有較強(qiáng)的組織特異性，表明miRNA在不同組織、不同生物學(xué)過程中具有獨(dú)特的功能。miRNA因其在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中占據(jù)主導(dǎo)地位而被深入研究并廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域[5]。就畜牧生產(chǎn)而言，種公畜的繁殖性能被育種學(xué)家高度關(guān)注，因此，探究miRNA對家畜精子發(fā)生的影響和作用機(jī)制成為了農(nóng)業(yè)科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[6]。

miR-34家族由3個成員組成，分別是miR-34a、miR-34b和miR-34c。miR-34b/c在精子發(fā)生過程中具有多種功能，既可以調(diào)節(jié)減數(shù)分裂過程，也可以調(diào)節(jié)精子發(fā)生后期的變形和獲能等生物學(xué)過程。研究證明，多種動物的精子中含有miR-34b/c，這些成員在精子發(fā)生[7]和早期胚胎發(fā)育[8]中發(fā)揮著重要作用。miR-449家族也由3個成員組成，分別是miR-449a、miR-449b和miR-449c，它們被定位到Cdc20b基因的第2個內(nèi)含子上，形成一個miRNA簇，在不同物種間高度保守。miR-449成員在控制細(xì)胞周期和表皮分化中起主要作用[9]。報道顯示，miR-34/449家族在纖毛發(fā)生[10]、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)[11]、細(xì)胞分化[12]、癌癥[13]等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮作用。雖然miR-34和miR-449最初被指定為單獨(dú)的miR家族，但miR-34與miR-449家族成員具有相同的種子序列，且miR-34和miR-449被證明可以調(diào)節(jié)一組相同的靶基因，因此可以被視為一個miRNA簇，命名為miR-34/449[14]。鑒于這2個家族成員在基因表達(dá)調(diào)控中可能一起發(fā)揮作用，且2個基因家族之間具有相互代償機(jī)制，本研究利用生物信息學(xué)方法探究miR-34b/c、miR-449a/b/c在牛精子發(fā)生中的作用機(jī)制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過預(yù)測共同調(diào)控miR-34b/c、miR-449a/b/c的轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)以及受miR-34b/c、miR-449a/b/c共同調(diào)控的靶基因以構(gòu)建miR-34b/c、miR-449a/b/c的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以期為后續(xù)miR-34b/c和miR-449a/b/c調(diào)控牛精子發(fā)生的相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

牛(Bostaurus,bta)、人(Homosapiens,hsa)、小鼠(Musmusculus,mmu)、大鼠(Rattusnorvegicus,rno)、雞(Gallusgallus,gga)和豬(Susscrofa,ssc)等物種的miR-34b/c、miR-449a/b/c及其前體的序列信息來源于 miRBase(http:∥mirbase.org/index.shtml)在線數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法

1.2.1 miR-34b/c和miR-449a/b/c的相似性分析 利用MegaX[15]軟件對miR-34b/c和miR-449a/b/c前體序列分別進(jìn)行多序列比對，并計算各模型組合的BIC分?jǐn)?shù)(Bayesian information criterion)，選取BIC分?jǐn)?shù)最低的模型組合，即最大似然估計法(maximum likelihood)、Jukes-Cantor模型和Gamma分布分別構(gòu)建miR-34b/c和miR-449a/b/c的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 bta-miR34/449靶基因預(yù)測 通過在線軟件TargetScan 7.2(http:∥www.targetscan.org/vert_72/)[16]、miRDB(http:∥www.mirdb.org/)[17]和miRWalk(http:∥mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)[18]預(yù)測bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c的靶基因，取三者預(yù)測結(jié)果的交集作為bta-miR34/449的靶基因。

1.2.3 靶基因功能預(yù)測 根據(jù)靶基因預(yù)測結(jié)果，選取bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c共同作用的靶基因。分別使用在線軟件DAVID 5.8(https:∥david.ncifcrf.gov/)[19]和KOBAS(http:∥kobas.cbi.pku.edu.cn/)[20]對其進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析(物種為牛)，收集調(diào)整后P<0.05的條目并使用R語言程序包ggplot2繪制柱狀圖和氣泡圖。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測 在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索出bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的前體序列，使用AnimalTFDB(http:∥bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/#!/)[21]對其上游2 kb至上游0.1 kb的序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測，獲取可能調(diào)控bta-miR-34/449的轉(zhuǎn)錄因子。

1.2.5 構(gòu)建TF-miRNA-靶基因作用網(wǎng)絡(luò) 選取同時調(diào)控bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合靶基因預(yù)測和String在線數(shù)據(jù)庫(http:∥string-db.org/)[22]構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape 3.8.0在線軟件(http:∥www.cytoscape.org/)[23]構(gòu)建TF-miR-34/449-mRNA作用網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié) 果

2.1 miR-34/499的相似性分析

根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫的查詢結(jié)果，牛miR-34/499分別位于第15和20號染色體上，對比牛、人、小鼠、大鼠、雞和豬等物種的miR-34/449序列并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)合序列比對發(fā)現(xiàn)，miR-34/449在進(jìn)化中相對保守，成熟體序列基本一致(表1、2，圖1)。

表1 各物種miR-34b/c的成熟序列

表2 各物種miR-449a/b/c的成熟序列

圖1 ML法構(gòu)建miR-34b/c(A)、miR-449a/b/c(B)系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 靶基因預(yù)測

通過在線軟件TargetScan、miRDB和miRWalk對bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c的靶基因進(jìn)行預(yù)測，取三者的交集分別得到了115、151、161、149和152個靶基因(圖2)。

A，bta-miR-34b；B，bta-miR-34c；C，bta-miR-449a；D，bta-miR-449b；E，bta-miR-449c

2.3 靶基因功能預(yù)測

bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c共同作用的靶基因分別為73和80個，用于功能分析的靶基因為49個(圖3、表3)，如SYT1、SNX15、LGI1、ELMOD1、RCAN1等。對靶基因集進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的靶基因主要富集在精子發(fā)生、鈣離子依賴性胞吐的調(diào)節(jié)、胰島素分泌的調(diào)節(jié)等GO條目，以及HIF-1信號通路、甲狀腺激素信號通路、Wnt信號通路等KEGG通路(圖4)。

A，bta-miR-34b∩bta-miR-34c；B，bta-miR-449a∩bta-miR-449b∩bta-miR-449c；C，bta-miR-34b/c∩bta-miR-449a/b/c。圖5同

表3 bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的共同靶基因

圖4 靶基因的GO功能(A)和KEGG通路(B)富集分析

2.4 轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

預(yù)測到bta-miR-34b和bta-miR-34c共同的轉(zhuǎn)錄因子有77個，bta-miR-449a、bta-miR-449b和bta-miR-449c共同的轉(zhuǎn)錄因子有17個，以上5個miRNAs共同的轉(zhuǎn)錄因子有2個(圖5、表4)，分別為核受體亞家族2C組成員2(nuclear receptor subfamily 2C group member 2,NR2C2)和HICZBTB轉(zhuǎn)錄抑制因子1(HIC ZBTB transcriptional repressor 1,HIC1)。

圖5 bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

表4 bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的轉(zhuǎn)錄因子

2.5 TF-miRNA-mRNA作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

根據(jù)bta-miR-34/449預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子、靶基因以及蛋白間互作關(guān)系構(gòu)建TF-miRNA-mRNA作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c對精子發(fā)生的調(diào)控作用通過其與上游轉(zhuǎn)錄因子、下游靶基因共同構(gòu)成的TF-miRNA-mRNA作用網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮作用，bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c受到上游轉(zhuǎn)錄因子NR2C2和HIC1的調(diào)控，同時會抑制AXL、E2F3、DAAM1等下游靶基因的表達(dá)，以實現(xiàn)對精子發(fā)生的生物學(xué)調(diào)控(圖6)。

圖6 TF-bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c-mRNA作用網(wǎng)絡(luò)

3 討 論

在基因表達(dá)過程中，miRNA能夠通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控影響基因的表達(dá)，miRNA是基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，有望成為生物標(biāo)志物開發(fā)的候選分子。單個miRNA可以靶向數(shù)百個mRNA并影響許多基因的表達(dá)[24]。精子發(fā)生過程是雄性動物得以產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)精子的重要生物學(xué)過程，miRNA已被證明參與精子發(fā)生的各個時期[25]。miR-34家族可以靶向許多細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，如Notch1、CDK4和MYC，且TGIF2和Notch2在精子發(fā)生過程中是miR-34c的2個重要靶基因，Notch信號能夠促進(jìn)生殖細(xì)胞的分化[26]。有報道稱，miR-34c在精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞中高表達(dá)，抑制原代精母細(xì)胞中的miR-34c可以防止生殖細(xì)胞免受睪酮剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，在體外培養(yǎng)的生殖細(xì)胞中miR-34c的過度表達(dá)會觸發(fā)細(xì)胞凋亡[27-28]。miR-449家族成員也在精子發(fā)生中扮演著重要角色，miR-449a、miR-449b和miR-449c在減數(shù)分裂開始期間上調(diào)，并優(yōu)先在精母細(xì)胞和精子細(xì)胞中表達(dá)[29]。大量研究已經(jīng)揭示了miRNA-34和miR-449家族對精子發(fā)生各個時期的調(diào)控作用及機(jī)制，但其對精子發(fā)生過程中上游轉(zhuǎn)錄因子和下游靶基因構(gòu)成的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還有待進(jìn)一步挖掘。

本研究通過查詢miRBase在線數(shù)據(jù)庫中牛、人、小鼠、大鼠等物種的miR-34b/c、miR-449a/b/c及其前體序列信息，運(yùn)用相似性分析以及miRNA轉(zhuǎn)錄因子、靶基因預(yù)測、富集分析等技術(shù)手段對bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c的序列保守性、上下游調(diào)控機(jī)制及功能進(jìn)行分析，得到了49個共同靶基因和2個轉(zhuǎn)錄因子，其中，靶基因和轉(zhuǎn)錄因子的篩選通過在線數(shù)據(jù)庫TargetScan、miRDB、miRWalk及AnimalTFDB實現(xiàn)，以上數(shù)據(jù)庫均包含牛的相關(guān)信息或支持通過序列直接預(yù)測，盡管miRNA在物種間具有較強(qiáng)的序列保守性，但是使用其他物種miRNA的相關(guān)信息預(yù)測牛miRNA的靶基因或轉(zhuǎn)錄因子仍然不是最優(yōu)選擇，因此本試驗通過對預(yù)測工具的合理選擇在一定程度上提高了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本研究預(yù)測到的2個轉(zhuǎn)錄因子(NR2C2和HIC1)在精子發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。NR2C2也被稱為睪丸核受體4(testicular orphan receptor 4，TR4)，是核受體家族的成員[30]。在小鼠睪丸中，NR2C2主要表達(dá)于初級精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞中，并在精子發(fā)生的減數(shù)分裂前期和連續(xù)減數(shù)分裂前期起重要作用。NR2C2基因敲除小鼠的生殖潛能顯著降低，各個階段的精子數(shù)量明顯降低，初級精母細(xì)胞降解，生精小管壞死扭曲，精子發(fā)生減數(shù)分裂前期和連續(xù)減數(shù)分裂期延長和中斷，導(dǎo)致細(xì)胞分裂中期延長和生精細(xì)胞異常[31]。HIC1是一種鋅指轉(zhuǎn)錄抑制因子，可通過與沉默交配型信息調(diào)節(jié)2同源物1(sirtuin 1，SIRT1)啟動子結(jié)合，控制細(xì)胞生長和死亡，以響應(yīng)p53依賴性凋亡DNA損傷[32]。Jenal等[33]研究發(fā)現(xiàn)，HIC1是細(xì)胞周期和凋亡調(diào)節(jié)因子E2F轉(zhuǎn)錄因子1(E2F transcription factor 1,E2F1)的新轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，E2F1通過包含HIC1 P0啟動子上的TATA盒在內(nèi)的2個E2F DNA結(jié)合位點(diǎn)誘導(dǎo)HIC1的表達(dá)。HIC1與包含HIC1結(jié)合共有位點(diǎn)的E2F1啟動子基因結(jié)合，通過調(diào)控E2F1轉(zhuǎn)錄抑制細(xì)胞生長。Uchida等[34]研究證明，HIC1缺失促進(jìn)青春期前睪丸平滑肌細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致成年睪丸中生精小管周圍的PMC數(shù)量增加，并最終影響精子發(fā)生。

本研究篩選到的部分靶基因已有報道顯示參與調(diào)控了精子發(fā)生過程。受體酪氨酸激酶AXL是TAM家族的成員，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和新陳代謝等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[35]。AXL是牛睪丸支持細(xì)胞中miR-34c的直接靶基因，miRNA-34c通過靶向AXL基因調(diào)節(jié)牛支持細(xì)胞增殖和凋亡[36]。E2F3是E2F家族中的一員，是唯一被發(fā)現(xiàn)在精原細(xì)胞、細(xì)線期精母細(xì)胞和支持細(xì)胞中表達(dá)的E2F成員。在支持細(xì)胞特異性視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(RB)敲除小鼠睪丸內(nèi)注射shRNA-E2F3，結(jié)果顯示，支持細(xì)胞中因RB缺失引起的生精功能障礙通過E2F3的體內(nèi)沉默得到部分恢復(fù)[37]，暗示RB/E2F3途徑在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。形態(tài)發(fā)生相關(guān)激活因子1(dishevelled associated activator of morphogenesis 1,DAAM1)是一種formin家族蛋白，通過Wnt信號通路參與非支鏈肌動蛋白絲的成核、形態(tài)發(fā)生和器官發(fā)生等重要生物學(xué)過程[38]。Pariante等[39]評估了DAAM1與大鼠睪丸形態(tài)發(fā)生的可能關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示，在有絲分裂階段，DAAM1與支持細(xì)胞、生殖細(xì)胞和精原細(xì)胞中的肌動蛋白共享其定位，在減數(shù)分裂期間，2種蛋白都存在于精母細(xì)胞中，而在形成的血睪丸屏障中只能檢測到肌動蛋白，DAAM1在整個精子發(fā)生過程中跟隨頂體系統(tǒng)的發(fā)展，最終保留在成熟精子的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)在精子能量代謝過程中起重要作用，熱應(yīng)激能夠增加豬睪丸中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3(glucose transporter type 3,GLUT3)和LDHA的表達(dá)，繼而增加支持細(xì)胞中乳酸產(chǎn)生[40]。小鼠中乳酸脫氫酶C(lactate dehydrogenase C,LDHC)基因的缺失導(dǎo)致精子無法獲能并在精卵結(jié)合中不能穿過透明帶[41]，而LDHA作為轉(zhuǎn)基因引入LDHC缺失小鼠中，轉(zhuǎn)基因小鼠獲得了正常的精子功能和生育能力[42]。Klinefelter綜合征(Klinefelter syndrome,KS)是男性性腺機(jī)能減退和性染色體異常的遺傳疾病，患有KS的男性睪丸中LDHA mRNA的表達(dá)量減少與睪丸內(nèi)乳酸含量的下降相關(guān)[40]。以上證據(jù)不同程度地印證了本研究預(yù)測的靶基因在精子發(fā)生中扮演著重要角色。此外，本研究預(yù)測得到的還沒有被廣泛報道的其他基因也具有進(jìn)一步研究的價值。

靶基因GO功能富集分析表明，bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的靶基因主要富集在精子發(fā)生、鈣離子依賴性胞吐的調(diào)節(jié)、胰島素分泌的調(diào)節(jié)等GO條目，推測bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的靶基因在精子發(fā)生和精子獲能中起作用。相關(guān)報道顯示，miR-34c參與小鼠睪丸精子發(fā)生和雄性生殖細(xì)胞(male germ-line stem cells,mGSCs)凋亡的調(diào)節(jié)[7]。miR-34b/c和miR-449a/b/c對于正常精子發(fā)生和男性生育不可或缺[43]。miR-34b和miR-34c存在于與透明帶結(jié)合的精子中，表明其可能與精子受精過程有關(guān)[8]。KEGG通路富集分析，bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的靶基因顯著富集在HIF-1信號傳導(dǎo)途徑、甲狀腺激素信號通路和Wnt信號通路等。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor,HIF)是細(xì)胞對缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，HIF由α亞單位(HIF-1α、HIF-2α或HIF-3α)和β亞單位(HIF-β)組成，HIF-1α和HIF-2α密切相關(guān)，它們與HIF-β亞基的相互作用分別產(chǎn)生HIF-1和HIF-2，HIF-1和HIF-2 2種活性轉(zhuǎn)錄因子均與缺氧反應(yīng)元件(hypoxia-response element,HRE)結(jié)合，刺激與血管生成、能量代謝、細(xì)胞生長和細(xì)胞周期進(jìn)展等相關(guān)的靶基因調(diào)節(jié)生物學(xué)過程[44]。HIF-1α和HIF-2α在睪丸支持細(xì)胞中的表達(dá)已經(jīng)得到證實[45]，且HIF-2參與促卵泡素(follicle-stimulating hormone,FSH)對支持細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)[46]。Gruber等[47]對出生2 d的小鼠進(jìn)行HIF-2α消融手術(shù)，導(dǎo)致小鼠支持細(xì)胞無法建立完整的血睪屏障，并伴有睪丸大小和重量減少，且經(jīng)消融手術(shù)處理的小鼠最終不育。本研究中靶基因富集到的另一個重要通路是Wnt信號通路，Wnt信號是一種高度保守的細(xì)胞間通信機(jī)制。典型的Wnt信號傳導(dǎo)也稱為Wnt/β-連環(huán)蛋白通路，通常被認(rèn)為是一種干細(xì)胞自我更新機(jī)制[48]。原始生殖細(xì)胞的特異性分化和雄性胎兒生殖道的正常發(fā)育依賴于Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)[49]。Takase等[50]研究報道，睪丸中Wnt信號通路特別有助于精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells,SSC)的增殖，證實了本研究結(jié)果的可靠性。

4 結(jié) 論

bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c通過上游轉(zhuǎn)錄因子和下游靶基因組成的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)節(jié)精子發(fā)生過程。