基于GC/HPLC檢測和苦味評定解析黃酒苦味

陳文穎，周世水*，閆統(tǒng)帥，郭 波

（1.華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2.廣東石灣酒廠集團股份有限公司，廣東 佛山528031）

黃酒是世界三大古酒之一，是中華民族的瑰寶，其富含蛋白質(zhì)、氨基酸和多糖等營養(yǎng)物質(zhì)以及活性多肽、功能多糖、維生素、γ-氨基丁酸、類黑精等生理活性物質(zhì)[1]，這賦予黃酒一定的營養(yǎng)保健功能。

苦味是黃酒的基本風味之一，適當?shù)目辔督o人以爽口的感覺[2]，但是市面上大部分黃酒口感不夠“爽”，苦味重，持續(xù)性強，使得黃酒口感粗糙[3]，銷售人群受限而導致我國黃酒銷售量人均約2 L[4]。目前，葡萄酒[5-6]、清酒[7-8]、白酒[9-10]和啤酒[11-12]的苦味物質(zhì)在國內(nèi)外都有比較系統(tǒng)的研究，但是黃酒的苦味物質(zhì)研究相對較少，其中于海燕等[13]提出黃酒中的苦味主要由高級醇、氨基酸、苦味肽和黃酒發(fā)酵不正常時產(chǎn)生的丙烯醇、酪醇引起。黃酒中苦味物質(zhì)的探究常采用分離純化黃酒中的物質(zhì)逐一進行感官評定，這種方法前處理樣品方式復雜，且忽略了黃酒中各物質(zhì)相互作用的影響[14]。2008年，有研究者首次將核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）測定葡萄酒數(shù)據(jù)并運用代謝組學的方法來進行分析，這打開了酒代謝組學的大門[15]。隨后，學者們利用酒代謝組學結(jié)合數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法如主成分分析（principal component analysis，PCA）、層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）等數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法探究酒的風味[16]、品質(zhì)評價模型[17]以及酒齡[18]等特征，使得酒中越來越多的奧秘被揭開，這些方法為分析影響黃酒苦味的因素提供了思路。因此，本研究通過使用氣相色譜（gas chromatography，GC）和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定黃酒中揮發(fā)性成分、氨基酸和理化性質(zhì)，結(jié)合苦味評定進行相關(guān)性分析和PLSR分析來確定黃酒中的各組分與苦味的關(guān)系。以期為降低黃酒苦味的釀造技術(shù)、開發(fā)優(yōu)良口味黃酒提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

20種半干型黃酒（糖度15.1～40.0 g/L、酒精度12%vol～20%vol、編號HJ1～HJ20）：浙江紹興、寧波等7家酒廠市售產(chǎn)品；甲醇、乙醛、正丙醇、乙酸乙酯、異丁醇、異戊醇、乳酸乙酯、丁酸、β-苯乙醇、酒精、丙酮、乙酸丁酯、乙腈、正己烷、異硫氰酸苯酯（均為色譜級）、氨基酸標準品（純度均＞98%）、鹽酸奎寧（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC8100氣相色譜儀（GC）、LZP-930色譜柱（30 m×0.32 mm×1 μm）：滕州中科普儀器有限公司；LC-10A高效液相色譜儀（HPLC）：日本島津公司；安捷倫TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：安捷倫科技（中國）有限公司；pH酸度計：梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 揮發(fā)性成分的測定

黃酒中揮發(fā)性成分采用GC法測定[19]。按照各組分標準品保留時間進行定性，內(nèi)標法進行定量。測定揮發(fā)性成分的內(nèi)標為17.6 mg/mL乙酸丁酯。樣品過0.22 μm 孔徑濾膜，將980 μL樣品和20 μL丙酮（內(nèi)標）置于氣相色譜樣品瓶中。柱箱升溫程序：先以50 ℃保持5 min，再以10 ℃/min的速度升溫至200 ℃并保持5 min。進樣口溫度220 ℃，檢測器溫度230 ℃，載氣為高純氮氣（N2），載氣流速30 mL/min，氫氣流速30 mL/min，空氣流速300 mL/min，尾吹氮氣速度30 mL/min，進樣體積0.4 μL。

1.3.2 氨基酸含量測定

氨基酸采用HPLC法[20]測定。取酒液200 μL加100 μL 1.2%異硫氰酸苯酯乙腈溶液和100 μL 14%三乙胺乙腈溶液，混勻后靜置1 h，加入400 μL正己烷，旋渦混合器振蕩60 s后靜置10 min，取下層清液過0.45 μm 孔徑濾膜后備用。HPLC色譜條件為安捷倫TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A：0.01 mol/L 乙酸鈉緩沖液-乙腈（97∶3，V/V）；流動相B：乙腈-水（4∶1，V/V）；流速1.0 mL/min；檢測波長254 nm；柱溫40 ℃；進樣量10 μL。洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of gradient elution

1.3.3 黃酒理化指標的測定

黃酒的總酸（以乳酸計）、總糖（以葡萄糖計）：按照GB/T 13662—2018《黃酒》測定；黃酒中酒精含量采用GC法測定并稍作改動[21]。按照乙醇保留時間進行定性，內(nèi)標法進行定量。測定酒精含量的內(nèi)標為7.32 mg/mL丙酮。樣品過0.22 μm 孔徑濾膜，將100 μL樣品、800 μL水和100 μL內(nèi)標丙酮置于氣相色譜樣品瓶中。柱箱升溫程序：先50 ℃保持4 min，再30 ℃/min的速度升溫至200 ℃并保持2 min。進樣口溫度220 ℃，檢測器溫度230 ℃，載氣為高純氮氣（N2），載氣流速30 mL/min，氫氣流速30 mL/min，空氣流速300 mL/min，尾吹氮氣速度30 mL/min，進樣體積0.4 μL。

1.3.4 苦味值的評定

苦味評定方法[22]?？辔稑藴室海河脵幟仕釋⒓儍羲{(diào)至與原酒pH（3.8～4.2）一致，用此作為標準溶液基液；將鹽酸奎寧配制為不同濃度的苦味標準品，以此為標準進行評分。鹽酸奎寧質(zhì)量濃度5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L和40 mg/L分別對應(yīng)苦味值5、10、20、30和40。

采用標簽量值評估法[23]對成員（5男5女；年齡22～50歲）進行為期兩個月的口味敏感性訓練，以2 mg/L鹽酸奎寧為苦味標準物訓練苦味。訓練后所有的評定員都可以準確識別苦味。每次評定前1 h內(nèi)限制飲食，評定員用蒸餾水漱口后，準確移取10 mL待測樣品于口腔中充分浸潤5～10 s，仰頭讓樣品浸潤咽喉部位兩次，保證樣品覆蓋整個咽喉的表面后吐出，漱口，不同樣品之間間隔不低于3 min，每個樣品評定3次，評定員確定與樣品最接近的苦味標準液并以此確定苦味值。

1.3.5 相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)系數(shù)法常用于評估2個連續(xù)變量之間的線性關(guān)系。將各測定成分含量與苦味值進行Pearson相關(guān)性分析，通過選擇雙變量相關(guān)分析中的Pearson和雙側(cè)檢驗方法，獲取相關(guān)系數(shù)。

1.3.6 PLSR苦味分析

將測定各成分作為X變量，苦味值作為Y變量，進行PLSR分析，包括數(shù)據(jù)的降維和苦味值識別的分析，建立模型并用模型預測苦味值Y。

1.3.7 統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 24.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析、相關(guān)性分析；條形圖由Graphpad prism 8.0軟件分析繪制；PLSR分析由The Unscrambler X 10.4軟件分析。除方法中特別說明外，各試驗設(shè)定3個平行，數(shù)據(jù)用“平均值±標準偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒中揮發(fā)性成分測定結(jié)果

黃酒樣品中揮發(fā)性成分、酒精度的測定結(jié)果見表2。由表2可知，黃酒中主要揮發(fā)性成分及含量為乙醛19～98mg/L、甲醇0～40 mg/L、正丙醇38～122 mg/L、乙酸乙酯31～158 mg/L、異丁醇61～132 mg/L、異戊醇108～238 mg/L、乳酸乙酯121～580 mg/L、丁酸63～714 mg/L、β-苯乙醇13～200 mg/L。其中高級醇含量最高的是樣品HJ2 578 mg/L，最低的是樣品HJ12 242 mg/L。乙酸乙酯含量最高的是樣品HJ16 158 mg/L，最低的是樣品HJ1 31 mg/L。乳酸乙酯含量最高的是樣品HJ5 580 mg/L，最低的是樣品HJ13 121 mg/L。

表2 黃酒樣品中揮發(fā)性成分含量測定結(jié)果Table 2 Determination results of volatile components contents in Huangjiu samples mg/L

2.2 黃酒中氨基酸含量的測定結(jié)果

黃酒中氨基酸的測定結(jié)果見表3。由表3可知，各黃酒樣品中一共檢出18種游離氨基酸，包含8種必需氨基酸和10種非必需氨基酸。黃酒中必需氨基酸總量在332～2 172 mg/L，必需氨基酸總量最高的是樣品HJ8，為2 172 mg/L；最低的是樣品HJ5 為332 mg/L。黃酒中苦味氨基酸總量在458～2269mg/L，苦味氨基酸總量最高的是樣品HJ8，為2269mg/L；最低的是樣品HJ5，為458 mg/L。多數(shù)苦味氨基酸如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸也是必需氨基酸，相對而言，黃酒中苦味氨基酸總量比必需氨基酸總量多。黃酒中游離氨基酸總量在1 110～4 924 mg/L，游離氨基酸總量最高的是樣品HJ8，為4 924 mg/L；最低的是樣品HJ5為1 110 mg/L。酒樣中氨基酸含量有差異，其中天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸含量均較高，這與宮曉波等[24]的研究結(jié)果相一致。

表3 黃酒樣品中氨基酸含量測定結(jié)果Table 3 Determination results of amino acids contents in Huangjiu samples mg/L

續(xù)表

2.3 黃酒理化指標測定

黃酒樣品中總酸、總糖和酒精含量測定結(jié)果見表4。由表4可知，黃酒中總酸含量3.6～8.2 g/L，符合半干型黃酒GB/T 13662—2018《黃酒》標準（稻米黃酒3.0～7.5 g/L，非稻米黃酒3.0～10.0 g/L）?？偺呛?4.5～44.0 g/L，僅樣品HJ4總糖含量14.5 g/L略低于半干型黃酒標準，樣品HJ7總糖含量44.0 g/L略超半干型黃酒標準，其他均符合半干型黃酒GB/T 13662—2018《黃酒》標準（15.1～40.0 g/L）。酒精含量9.5～15.1 g/L，即酒精度為12.0%vol～19%vol，符合半干型黃酒GB/T 13662—2018《黃酒》標準（＞8.0%vol）。

表4 黃酒樣品理化指標測定結(jié)果Table 4 Determination results of physicochemical indexes of Huangjiu samples g/L

2.4 黃酒苦味值分析

黃酒樣品苦味值的測定結(jié)果見圖1。由圖1可知，樣品HJ1和HJ5的苦味值最高，都為40；其次是樣品HJ2的苦味值為36；樣品HJ3和HJ4的苦味值為34、樣品HJ8、HJ11、HJ15和HJ16的苦味值為32；樣品HJ9的苦味值為24；樣品HJ10的苦味值為20；樣品HJ6、HJ13的苦味值為18；樣品HJ12、HJ14的苦味值為16；樣品HJ7的苦味值最低，為14；其中苦味值＜25的黃酒樣品有7種，占44%，苦味值＞30的黃酒樣品有9種，占56%。經(jīng)品評可以發(fā)現(xiàn)，黃酒苦味值相差2個單位在品評過程中就會有顯著性差異，黃酒的苦味值在該品評標準下8～34為宜，苦味值低于8的黃酒其酒特征不明顯，有些甚至很寡淡，不具有酒的風味。苦味值高于34的黃酒苦味較重，難以吞咽甚至產(chǎn)生不愉悅感。黃酒的苦味值差異主要由于黃酒各組成成分不同而引起[25]，通過探究黃酒樣品中揮發(fā)性成分、氨基酸及理化指標與苦味的相關(guān)性，從而得以從菌種、原料組成和發(fā)酵工藝來控制黃酒發(fā)酵過程中各組成成分的產(chǎn)生[22]，降低黃酒苦味并提升黃酒品質(zhì)。

圖1 黃酒樣品的苦味值測定結(jié)果Fig.1 Determination results of bitterness values of Huangjiu samples

2.5 黃酒中揮發(fā)性成分、氨基酸及理化指標與苦味值相關(guān)性結(jié)果分析

黃酒中揮發(fā)性成分、氨基酸及理化指標與苦味值相關(guān)性分析結(jié)果見圖2。由圖2可知，苦味值與異戊醇（R=0.808）、異丁醇（R=0.642）、正丙醇（R=0.623）顯著正相關(guān)，這與高級醇是酒的苦味來源結(jié)果一致[13，22，26-27]。乳酸乙酯（R=0.771）作為一種呈香物質(zhì)，是黃酒的重要香氣成分，但乳酸乙酯含量過高便會抑制酒的整體香氣并產(chǎn)生明顯苦澀感[28]。因乳酸乙酯在半干型黃酒中含量較高（121～549 mg/L）且超過了自身的苦味閾值（70 mg/L）[26]，所以其在增香的同時也會產(chǎn)生一定的苦味。

圖2 黃酒樣品中揮發(fā)性成分、氨基酸及理化指標與苦味值相關(guān)性分析結(jié)果Fig.2 Correlation analysis results between volatile components,amino acids,physicochemical indexes and bitterness value of Huangjiu samples

通常黃酒中苦味氨基酸占總氨基酸44%，會給黃酒帶來一定程度的苦味[3，13，26]，其中部分氨基酸與苦味值呈弱正相關(guān)，包括精氨酸（R=0.464）、纈氨酸（R=0.414）、脯氨酸（R=0.376）、亮氨酸（R=0.321）、異亮氨酸（R=0.296）、苯丙氨酸（R=0.246）等苦味氨基酸，其他氨基酸與苦味相關(guān)極小或負相關(guān)，特別是甘氨酸（R=-0.536）與苦味呈顯著負相關(guān)。由于氨基酸的感官閾值較高[26]，且氨基氮與苦味呈現(xiàn)負相關(guān)而與鮮味正相關(guān)[29]，這可能是導致黃酒中氨基酸與苦味相關(guān)性低的原因。

此外，總酸（R=0.641）對苦味有促進作用，總糖（R=-0.735）對苦味有明顯抑制作用，糖是一種傳統(tǒng)的苦味掩蓋物[30]，在黃酒的風味中同樣也發(fā)揮了巨大作用。酒精與苦味值呈極顯著正相關(guān)（R=0.850），而且酒精濃度越高，苦味越強烈，這與CHEN T等[31]的高濃度酒精會產(chǎn)生強烈的苦味結(jié)論相一致。

2.6 偏最小二乘法回歸分析模型建立

不同黃酒樣品中揮發(fā)性成分、氨基酸及理化指標與苦味值相關(guān)性偏最小二乘法回歸分析載荷圖見圖3。PLSR可進一步驗證Pearson相關(guān)性分析的物質(zhì)來建立苦味與測定成分之間的可靠性。以各測定成分為X預測變量，苦味值為Y響應(yīng)變量進行PLSR分析，提取兩個主成分，主成分1解釋了31%的X方差、73%的Y方差，主成分2解釋了31%的X方差、解釋了16%的Y方差，兩個主成分共解釋了62%的X方差、89%的Y方差。由圖3可知，位于2個橢圓之間的成分如酒精度、異戊醇、異丁醇、正丙醇、乳酸乙酯和絕大部分的氨基酸均能很好的被PLSR模型解釋，酒精度、異戊醇、異丁醇、正丙醇、乳酸乙酯等與苦味值距離較近，表明相關(guān)程度高，而氨基酸類物質(zhì)與苦味值距離較遠，表明相關(guān)程度低。這也與邱修柄等[22]的研究中高級醇比苦味氨基酸更能決定苦味強度的結(jié)果相同。苦味值位于內(nèi)橢圓，對PLSR模型總方差貢獻顯著，能很好的被相關(guān)性高的測定成分解釋。

圖3 黃酒樣品中揮發(fā)性成分、氨基酸及理化指標與苦味值的偏最小二乘法回歸分析載荷圖Fig.3 Load diagram of partial least squares regression analysis of volatile components,amino acids,and physicochemical indexes in Huangjiu samples and bitterness value

不同黃酒樣品中揮發(fā)性成分、氨基酸及理化指標與苦味值相關(guān)性偏最小二乘法回歸分析得分圖見圖4。由圖4可知，隨著苦味值的增大，其主成分1得分值和主成分2得分值呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，不同苦味值的黃酒能明顯區(qū)分開來。且所有樣本都落在95%的置信區(qū)間內(nèi)，無異常值，這表明黃酒成分與苦味值對應(yīng)關(guān)系分析結(jié)果是可信的。

圖4 黃酒樣品中揮發(fā)性成分、氨基酸及理化指標與苦味值的偏最小二乘法回歸分析得分圖Fig.4 Score plot of partial least square regression analysis of volatile components,amino acids,physicochemical indexes and bitterness value of Huangjiu samples

2.7 黃酒苦味值偏最小二乘法回歸預測模型的驗證

為了定量預測黃酒樣品中揮發(fā)性成分、氨基酸及理化指標與苦味值相關(guān)性，將16種半干型黃酒樣品分別按照表5中揮發(fā)性成分、氨基酸及理化指標（X1～X30）進行PLSR模型驗證，并得到黃酒苦味值（Y）預測模型的回歸方程如下：Y=0.037 3X1+0.033 0X2+0.110 4X3-0.000 2X4+0.121 6X5+0.1565X6+0.1477X7+0.0717X8+0.0602X9+0.1499X10-0.0345X11-0.0133X12-0.0185X13-0.0976X14-0.0091X15+0.0603X16-0.0434X17-0.0336X18+0.0401X19-0.0202X20+0.0472X21-0.0189X22-0.0343X23+0.0202X24+0.0239X25+0.0078X26-0.0034X27-0.0105X28+0.1023X29-0.138 5X30-0.032 2。此定量模型的自變量擬合度（RX2）為0.62，因變量擬合度（RY2）為0.883，預測擬合精度（Q2cum）=0.783＞0.6，說明該模型擬合效果好且預測結(jié)果能夠被接受。將另外從市場購買的不同價位具有代表性的黃酒樣品HJ17、HJ18、HJ19、HJ20使用模型進行驗證，得到預測苦味值和評定苦味值分別見表5。由表5可知，樣品HJ17模型預測苦味值為32.0，評定苦味值30，偏差率6.6%；樣品HJ18模型預測苦味值為21.5，評定苦味值24，偏差率10.3%；樣品HJ19模型預測苦味值為28.0，評定苦味值30，偏差率6.6%；樣品HJ20模型預測苦味值為27.5，評定苦味值26，偏差率5.8%，最大偏差率接近10%。結(jié)果表明，黃酒苦味值預測模型的預測值準確，能達到黃酒苦味值感官評定準確率的90%。

表5 以揮發(fā)性成分、氨基酸及理化指標預測黃酒樣品苦味值模型驗證Table 5 Model validation of predicting bitterness value of Huangjiu samples with volatile components,amino acids and physicochemical indexes

續(xù)表

3 結(jié)論

本試驗研究了黃酒樣品中揮發(fā)性成分、氨基酸及理化指標與其苦味的關(guān)系，Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明，黃酒的苦味值與揮發(fā)性物質(zhì)如酒精、異戊醇、異丁醇、正丙醇和乳酸乙酯等相關(guān)性較高（R=0.623～0.808），與苦味氨基酸如脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸等相關(guān)性低（R=0.246～0.464），與部分氨基酸為負相關(guān)，特別是甘氨酸（R=-0.536）呈顯著負相關(guān)，酒精與苦味相關(guān)性最高（R=0.850）、總酸對苦味有促進作用（R=0.649），總糖對苦味有明顯抑制作用（R=-0.735）。PLSR模型驗證了苦味值與揮發(fā)性成分、氨基酸及理化指標的關(guān)系，不同苦味值的黃酒可以明顯地被模型區(qū)分開，黃酒苦味值預測模型的預測值準確，達到黃酒苦味值感官評定準確率的90%。研究結(jié)果表明黃酒苦味值可以通過儀器測定黃酒揮發(fā)性成分、氨基酸及理化指標直接確定，這為黃酒苦味值的判定提供了一種客觀有效的技術(shù)方法。