實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與痰涂片法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的效果對(duì)比

周光宏

（麻城市人民醫(yī)院，湖北 麻城 438300）

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌感染引起的傳染病。結(jié)核分枝桿菌可侵入人體的各個(gè)器官，但主要侵犯肺臟，引發(fā)肺結(jié)核[1]。結(jié)核分枝桿菌的傳播途徑主要為飛沫傳播，故其傳染性較強(qiáng)，危害較大。結(jié)核病一直是世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。相關(guān)的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，目前全球每年新增結(jié)核病患者的數(shù)量在900 萬(wàn)左右，且這一數(shù)字有逐年上升的趨勢(shì)，全球每年因結(jié)核病死亡的患者數(shù)量可達(dá)到340 萬(wàn)[2]。我國(guó)是世界上結(jié)核病高發(fā)的國(guó)家之一，活動(dòng)性肺結(jié)核的發(fā)生率在世界范圍內(nèi)高居第二位。對(duì)結(jié)核病進(jìn)行有效的預(yù)防、控制和治療尤為重要。目前臨床上主要是通過(guò)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌來(lái)診斷結(jié)核病。痰培養(yǎng)法是臨床上檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌最準(zhǔn)確的方法，但該方法存在操作復(fù)雜、檢測(cè)用時(shí)長(zhǎng)、效率低等問(wèn)題，不利于結(jié)核病的及時(shí)診斷與治療，甚至可延誤患者的最佳治療時(shí)機(jī)。因此，選擇一種快速、高效且準(zhǔn)確率高的方法來(lái)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌尤為重要[3]。本文主要是比較用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法與痰涂片法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2020 年1 月至2021 年6 月期間收治的200 例肺結(jié)核患者作為研究對(duì)象。其納入標(biāo)準(zhǔn)是：存在咳嗽、咳痰、咯血、痰中帶血等疑似肺結(jié)核的癥狀，且此類癥狀持續(xù)的時(shí)間超過(guò)3 周；進(jìn)行常規(guī)痰液抗酸桿菌涂片檢查的結(jié)果呈陰性，伴或不伴全身結(jié)核中毒；進(jìn)行胸肺部影像學(xué)檢查可見(jiàn)存在疑似活動(dòng)性結(jié)核的影像學(xué)特征；各項(xiàng)臨床診療資料完整、真實(shí)、有效；知曉本研究?jī)?nèi)容，并簽署了知情同意書(shū)。其排除標(biāo)準(zhǔn)是：入院時(shí)病情已得到確診；有結(jié)核病病史，接受過(guò)抗結(jié)核治療；病歷資料不全；對(duì)檢查或治療的依從性欠佳。在這些患者中，有男性112 例，女性88 例；其年齡為32 ～75 歲，平均年齡為（40.23±6.55）歲。本研究已通過(guò)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核及批準(zhǔn)。

1.2 方法

在200 例患者入院后，均采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法、痰涂片法及痰培養(yǎng)法對(duì)其進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)，方法是：1）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。采集患者的痰液標(biāo)本，在其中加入4 倍于痰液的氫氧化鈉溶液（濃度為4%），混勻后靜置。待痰液液化后，取1 mL 的標(biāo)本進(jìn)行離心處理，獲取上清液。將上清液反復(fù)沉淀后與無(wú)菌生理鹽水混合，置于PCR 反應(yīng)管中。將PCR 反應(yīng)管置于定量PCR 擴(kuò)增儀內(nèi)，在93℃下預(yù)變性2 min，之后在93℃ 45 s →55℃ 60 s 的條件下處理10 個(gè)循環(huán)，在93℃ 30 s →55℃ 45 s 的條件下處理30 個(gè)循環(huán)。完成上述操作后，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行擴(kuò)增處理，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序中的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行操作。結(jié)合擴(kuò)增儀器顯示的實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度及其增長(zhǎng)曲線，判斷其DNA 含量。增長(zhǎng)曲線呈S 型、 CT 值＜38 則判斷檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，CT 值＞40 則判斷檢測(cè)結(jié)果呈陰性，CT 值在38 ～40 之間標(biāo)記為可疑陽(yáng)性，必須進(jìn)行復(fù)檢，若復(fù)檢結(jié)果顯示CT 值無(wú)數(shù)值為陰性，反之則為陽(yáng)性。2）痰涂片法。采集患者的痰液標(biāo)本0.1 mL，將標(biāo)本均勻涂抹于載玻片上，涂抹的面積為2 cm×2.5 cm。待標(biāo)本干燥固定后，依次對(duì)其進(jìn)行石碳酸復(fù)紅溶液染色、5% 鹽酸酒精脫色、亞甲基藍(lán)溶液復(fù)染處理，最后在油鏡下觀察視野中抗酸桿菌的數(shù)量。當(dāng)持續(xù)觀察300 個(gè)視野均未見(jiàn)抗酸桿菌時(shí)，可判斷檢測(cè)結(jié)果呈陰性，反之則表示檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性。3）痰培養(yǎng)法。采集患者的痰液標(biāo)本，參照《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》中的相關(guān)規(guī)定對(duì)痰液標(biāo)本進(jìn)行接種、培養(yǎng)，并將獲得的菌落進(jìn)行抗酸染色鑒定。若培養(yǎng)到第八周時(shí)仍未見(jiàn)菌落（結(jié)核分枝桿菌）生長(zhǎng)，則表示檢測(cè)結(jié)果呈陰性，反之則表示檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性。

1.3 觀察指標(biāo)

比較用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法、痰涂片法、痰培養(yǎng)法對(duì)200 例患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的陽(yáng)性率。以痰培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果為依據(jù)，比較用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法與痰涂片法對(duì)200 例患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的效能（包括靈敏度、特異度和準(zhǔn)確率）。靈敏度= 真陽(yáng)性例數(shù)/（真陽(yáng)例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%。特異度= 真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+ 假陽(yáng)性例數(shù)）×100%。準(zhǔn)確率=（真陽(yáng)性例數(shù)+ 真陰性例數(shù)）/ 總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 21.0 軟件處理本研究中的數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用±s表示，用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用% 表示，用χ2 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 用三種檢測(cè)方法對(duì)200 例患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的結(jié)果

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法對(duì)200 例患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的結(jié)果顯示，其中檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的患者有75 例；用痰涂片法對(duì)200 例患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的結(jié)果顯示，其中檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的患者有60 例；用痰培養(yǎng)法對(duì)200 例患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的結(jié)果顯示，其中檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的患者有78 例。詳見(jiàn)表1。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法、痰涂片法、痰培養(yǎng)法對(duì)200 例患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的陽(yáng)性率分別為37.50%（75/200）、30.00%（60/200）、39.00%（78/200）。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法和痰培養(yǎng)法對(duì)200 例患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的陽(yáng)性率均高于痰涂片法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法和痰培養(yǎng)法對(duì)200 例患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的陽(yáng)性率相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 用三種檢測(cè)方法對(duì)200 例患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的結(jié)果（例）

2.2 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法、痰涂片法對(duì)200例患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的效能

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法對(duì)200 例患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確率分別為94.87%、97.54%、96.50%，用痰涂片法對(duì)200 例患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確率分別為57.69%、86.89%、75.50%。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法對(duì)200 例患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確率均高于痰涂片法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

表2 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法、痰涂片法對(duì)200 例患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的效能[%（例/ 例）]

3 討論

結(jié)核病在我國(guó)屬于法定乙類傳染病。在我國(guó)所有甲乙類傳染病中，結(jié)核病的發(fā)生率高居第二位[4]。引起結(jié)核病的病原菌為結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)較為特殊，耐藥性較強(qiáng)，對(duì)多種治療藥物均有較強(qiáng)的耐藥性，因此結(jié)核病的臨床治療難度較大。對(duì)結(jié)核病進(jìn)行早診斷早治療是改善此病患者預(yù)后的關(guān)鍵。在結(jié)核病的診斷中，病史詢查、癥狀觀察、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)、影像學(xué)檢查等都是常用的檢查手段，其中實(shí)驗(yàn)室檢查最為常用。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢查方法中又以痰涂片法、痰培養(yǎng)法最為多見(jiàn)。痰培養(yǎng)法是診斷結(jié)核病的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但因結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)較為特殊，導(dǎo)致其吸收營(yíng)養(yǎng)的過(guò)程相對(duì)緩慢，生長(zhǎng)速度也比較慢，在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的時(shí)間短則3 ～4 周，長(zhǎng)則7 ～8 周，即便在快速培養(yǎng)技術(shù)廣泛應(yīng)用、培養(yǎng)時(shí)間大幅縮短的今天，檢測(cè)時(shí)間仍需7 ～10 d，這會(huì)在一定程度上延誤患者的治療[5]。相對(duì)而言，痰涂片法由于使用了抗酸染色鏡，可對(duì)抗酸桿菌的數(shù)量進(jìn)行直觀的觀察和判斷，具有操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，能明顯縮短檢測(cè)所用的時(shí)間。但痰涂片法一方面對(duì)標(biāo)本的采集和處理有較高的要求，若操作不當(dāng)可導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)；另一方面，在菌種含量過(guò)低的情況下，檢測(cè)的陽(yáng)性率也比較低，同時(shí)也可因肺結(jié)核性抗酸桿菌的存在而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。本文采用痰涂片法對(duì)200 例疑似患有結(jié)核病的患者進(jìn)行檢測(cè)，其陽(yáng)性檢出率僅有30.00%，顯著低于痰培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果（39.00%）。另外，用痰涂片法對(duì)200 例患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確率分別為57.69%、86.89%、75.50%，都不是很高。本研究的結(jié)果顯示，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法對(duì)200 例患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的陽(yáng)性率為37.50%，用該方法對(duì)200 例患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確率分別為94.87%、97.54%、96.50%，均顯著高于痰涂片法，與痰培養(yǎng)法的一致性較好。

PCR 法是分子生物學(xué)中常用的一種試驗(yàn)手段，已在病原體的檢測(cè)、疾病的診斷中得到了廣泛的應(yīng)用。由于傳統(tǒng)的PCR 技術(shù)在基因定量上存在不足，因此1996 年有學(xué)者提出了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、可高通量快速檢測(cè)、診斷的特異性和敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，使其有望成為一項(xiàng)重要的檢測(cè)技術(shù)。與常規(guī)PCR 技術(shù)不同的是，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)帶有定量系統(tǒng)，可將具有特殊波長(zhǎng)的熒光或熒光基團(tuán)添加到PCR 的反應(yīng)系統(tǒng)中，該裝置可利用熒光信號(hào)對(duì)PCR 過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，并引入了CT 值（即生成可探測(cè)熒光信號(hào)所需的最少周期數(shù)，也就是PCR 周期內(nèi)熒光信號(hào)從基底向指數(shù)生長(zhǎng)的拐點(diǎn)）。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)中，標(biāo)準(zhǔn)曲線一般是根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)物的CT 值計(jì)算出的。在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸中，存在較高的相關(guān)系數(shù)（R2 ＞0.99），根據(jù)該方程可得到未知樣品的初始模量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)帶有從標(biāo)準(zhǔn)曲線上自動(dòng)求出原始模板數(shù)量的軟件，該技術(shù)是從分子生物學(xué)角度，通過(guò)對(duì)特定DNA 進(jìn)行定量分析來(lái)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的一種手段。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的原理在于[6]：在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光反應(yīng)物，使之與PCR 擴(kuò)增物發(fā)生關(guān)聯(lián)，并通過(guò)整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)體系中熒光強(qiáng)度的判斷來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)核分枝桿菌DNA 的定量判斷。這種自動(dòng)化分析手段具有檢測(cè)速度快、診斷效能高等優(yōu)點(diǎn)，且不會(huì)受到相關(guān)污染物的影響，對(duì)于無(wú)法進(jìn)行病原菌培養(yǎng)或培養(yǎng)相對(duì)困難的患者而言十分適用。需要注意的是，在采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌時(shí)，存在活菌、死菌鑒別困難的問(wèn)題，可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性，但從總體上來(lái)看，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響較小。

綜上所述，與用痰涂片法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌相比，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確率均更高，與痰培養(yǎng)法的一致性更好，更適用于結(jié)核病的早期篩查與診斷，值得在臨床上推廣應(yīng)用。