卡格列凈通過RAS 和TGF?β1/Smad 途徑減輕高血壓誘導(dǎo)的心肌肥厚和纖維化

李愛花，王青青，秦迎春，謝亦璘，嚴(yán)志強(qiáng)

（1.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽淮南 232001；2.中山市中醫(yī)院，廣東中山 528401；3.上海交通大學(xué)閔行校區(qū)生命科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院上海市生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240；4.安徽理工大學(xué)附屬奉賢區(qū)中心醫(yī)院，上海 201499）

心血管疾病在全球范圍內(nèi)有較高的發(fā)病率和死亡率［1］。高血壓是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，在心血管疾病的發(fā)病機(jī)制和病理性心室重構(gòu)中起重要作用［2］。作為受高血壓影響的多個(gè)器官之一，血壓長期升高可引起以心肌肥厚和心肌纖維化為特征的病理性心室重塑。高血壓促進(jìn)心肌細(xì)胞肥厚性生長，心肌細(xì)胞大小增加［3］。心肌細(xì)胞肥大被認(rèn)為是一種對超負(fù)荷刺激引起的適應(yīng)性反應(yīng)。然而，持續(xù)的刺激會(huì)導(dǎo)致心臟失代償和心力衰竭［4］。高血壓可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)Ⅰ型膠原（Col1a）和Ⅲ型膠原（Col3a）過度表達(dá)，這兩種膠原積聚在間質(zhì)內(nèi)［4］。這些會(huì)導(dǎo)致心肌纖維化，并最終導(dǎo)致左心室功能障礙［3，4］。心室肥厚是高血壓患者發(fā)生心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，逆轉(zhuǎn)心肌肥厚有助于降低患者發(fā)生心血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。

越來越多的證據(jù)表明腎素血管緊張素系統(tǒng)（RAS）與病理性心室重構(gòu)有關(guān)［5］。血管緊張素原在肝臟中合成，經(jīng)腎素裂解為效應(yīng)分子血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）［6］。作為RAS 的重要成員，Ang Ⅱ通過與血管緊張素Ⅱ型受體1（AGTR1）相互作用發(fā)揮作用［7］。RAS 成分也可以由細(xì)胞內(nèi)和局部組織產(chǎn)生，在組織重塑中發(fā)揮重要作用［8］。研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞同時(shí)表達(dá)AGTR1 和血管緊張素Ⅱ型受體2（AGTR2）［9］。Ang Ⅱ與AGTR1 的結(jié)合激活多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號通路，包括促纖維化轉(zhuǎn)化生長因子?β（TGF?β）通路［5］。TGF?β1 通路在刺激成纖維細(xì)胞的增殖和遷移以及促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積中起著關(guān)鍵作用［10］。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制劑和Ang Ⅱ受體阻滯劑廣泛用于治療心血管疾病［11］。然而，心力衰竭的發(fā)病率和死亡率仍然很高。因此，需要一種治療病理性心室重塑和心力衰竭的新策略。

卡格列凈是鈉?葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白?2 抑制劑（SGLT2i）的成員之一，通過阻斷腎小球?qū)ζ咸烟堑脑傥斩档脱牵?2］?？ǜ窳袃粢驯挥糜谥委?型糖尿病患者。除了降低血糖外，越來越多的證據(jù)表明卡格列凈具有心血管保護(hù)作用。Meta 分析顯示卡格列凈治療顯著降低心衰事件［13］。有報(bào)道指出卡格列凈可改善心臟代謝和舒張功能，降低血管硬度，降低血壓［13，14］。體內(nèi)和體外的研究表明卡格列凈具有抗氧化和抗炎作用?？ǜ窳袃敉ㄟ^抑制mTOR/HIF?1α 信號通路顯著改善糖尿病小鼠心臟的心功能和炎癥反應(yīng)［15］?？ǜ窳袃敉ㄟ^刺激多種抗氧化和抗炎信號通路來減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟氧化應(yīng)激［16］。卡格列凈通過刺激抗氧化和抗炎信號傳導(dǎo)，減輕心臟的氧化應(yīng)激，改善心臟缺血再灌注損傷，改善心臟功能［17］。同樣，據(jù)報(bào)道，SGLT2i 的其他成員，如依格列凈，可以減輕糖尿病小鼠的心肌纖維化，并在壓力過度誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠模型中保持心肌功能［18，19］。雖然卡格列凈對心血管疾病的有益作用已有研究，但是，卡格列凈對高血壓引起的心臟重構(gòu)的影響仍未報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)卡格列凈可調(diào)節(jié)RAS 和TGF?β1/Smad 通路，可以預(yù)防高血壓引起的心肌纖維化和病理性心肌肥厚。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和藥物治療

雄性自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）和正常血壓大鼠（WKY）購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司［批號：SCXK（京）2016?0006］。用普通飼料和自來水喂養(yǎng)大鼠，并維持在標(biāo)準(zhǔn)溫度和光照條件下。20 周齡雄性大鼠隨機(jī)分為WKY 組、SHR 組、卡格列凈低劑量［SHR?CANA（30 mg/kg）］組和卡格列凈高劑量［SHR?CANA（60 mg/kg）］組，每組8 例?？ǜ窳袃羧苡?.8% 羧甲基纖維素鈉中，每日灌胃1 次。WKY 組和SHR 組只接受羧甲基纖維素鈉處理。采用尾袖法測量收縮壓（SBP）和舒張壓（DBP），使用BP?2010 系列血壓計(jì)（Softron Biotechnology，北京，中國）。給藥前及給藥第1～8 周連續(xù)監(jiān)測大鼠的血壓、血糖及體重，每周測量1 次，每次監(jiān)測時(shí)間為同一時(shí)間段。每周用血糖儀（魚躍，中國）測定空腹8 h血糖。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照中國衛(wèi)生部動(dòng)物管理規(guī)定（2001 年第55 號文件）進(jìn)行。

1.2 超聲心動(dòng)圖

治療8 周后，使用超聲系統(tǒng)（Vevo 2100，visual?sonic，Inc，Toronto，Canada）和15 MHz 高頻探頭對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查。大鼠以異氟醚麻醉（1.5%）。評估以下指標(biāo)：舒張末期左室后壁厚度、收縮末期左室容積、舒張末期左室容積、收縮末期室間隔厚度、射血分?jǐn)?shù)。

1.3 組織切片

給藥治療8 周后處死。分別稱量全心重量和左心室重量。部分左心室在4 ℃下用4%多聚甲醛固定過夜。然后將組織脫水并包埋在石蠟中。切片厚度為4 μm，蘇木精和伊紅（HE）染色檢測形態(tài)學(xué)。馬松（Masson）三色法染色評估心肌纖維化（Solar?bio，北京，中國）。切片圖像采用顯微鏡（BX53；奧林巴斯公司，日本東京）。使用ImageJ 軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（RT?PCR）

心肌組織樣品用TRIzol 試劑（Invitrogen 公司，美國）提取總RNA。使用RT Master Mix 進(jìn)行PCR（MedChemExpress，New Jersey，USA）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用2×SYBR 預(yù)混Ex Taq 試劑盒與ROX（康為，中國）進(jìn)行RT?PCR。反應(yīng)在95℃下2 min，95℃5 s，60℃30 s，然后循環(huán)40 次。信號在ABI Q6 機(jī)器上檢測（應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國）。以GAPDH 作為內(nèi)參。采用2?ΔΔCt的方法計(jì)算。本研究使用的PCR 引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Sequence primers

1.5 蛋白印跡法

左心室組織用含蛋白酶抑制劑的RIPA 緩沖液裂解（MedChemExpress，New Jersey，USA）并超聲。蛋白濃度用BCA 法（碧云天，中國）測定。100 ℃煮沸10 min 后，蛋白經(jīng)10% SDS ?聚丙烯酰胺凝膠分離，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜（Thermofish，美國）。膜在室溫下用含5%的脫脂奶粉Tris 緩沖液封閉1 h 后，然后用Ⅰ型膠原（Col1a）（1∶1 000，Proteintech，美國）、Ⅲ型膠原（Col3a）（1∶1 000，Pro?teintech，美國）、MMP2（1∶1 000，Proteintech，美國）、TGF?β1（1∶1 000，CST，美國）、Smad4（1∶1 000，CST，美國）、GAPDH（1∶1 000，Proteintech，美國）和β?Tubulin（1∶1 000，Proteintech，美國）的抗體在4℃下孵育過夜。與二抗孵育后，利用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑（圣爾，中國）曝光蛋白條帶。用Tanon 圖像分析儀（Tanon Science，上海，中國）獲取圖像并進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 卡格列凈對各組血壓的影響

與WKY 組比較，SHR 組的收縮壓、舒張壓明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。給藥2～8周，與SHR 組比較，SHR?CANA（30 mg/kg）組及SHR?CANA（60 mg/kg）組收縮壓均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。給藥2 周，與SHR 組比較，SHR?CANA（60 mg/kg）組舒張壓降低；給藥3～8周，SHR?CANA（30 mg/kg）組及SHR?CANA（60 mg/kg）組舒張壓較SHR 組均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表2。

表2 卡格列凈對各組血壓的影響（n=8，mmHg，±s）Tab 2 Effects of canagliflozin on blood pressure of rats in each groups（n=8，mmHg，±s）

表2 卡格列凈對各組血壓的影響（n=8，mmHg，±s）Tab 2 Effects of canagliflozin on blood pressure of rats in each groups（n=8，mmHg，±s）

注：與SHR 組比較，#P<0.01。

時(shí)間（周數(shù)）收縮壓WKY 組140.70±4.40#139.50±5.43#150.70±9.44#144.00±8.17#147.60±12.09#149.30±10.07#138.00±5.60#156.80±9.70#147.20±1.97#2.661 0.001 012345678FP SHR 組201.80±21.91 209.40±8.70 230.30±14.49 212.30±7.88 217.50±16.20 226.50±13.71 208.00±7.024 235.70±5.30 234.60±15.78 SHR?CANA(30 mg/kg)組196.40±10.62 199.00±4.58 206.80±5.80#186.70±12.78#183.70±6.13#178.40±15.29#185.70±12.23#205.30±16.38#183.90±10.78#SHR?CANA(60 mg/kg)組207.80±9.43 196.30±6.21 191.80±10.59#187.20±12.81#183.70±10.85#185.80±17.57#173.30±5.73#202.60±14.73#175.80±11.5#舒張壓WKY 組113.60±2.20#111.90±4.90#112.80±3.20#114.80±3.50#112.80±5.69#119.10±3.18#114.50±3.82#108.30±1.87#104.30±4.63#7.832<0.001 SHR 組165.50±11.89 164.10±8.46 192.10±9.96 188.60±5.06 174.10±9.36 174.00±10.42 164.80±2.43 195.70±13.80 191.90±12.34 SHR?CANA(30 mg/kg)組169.30±8.30 172.80±15.03 187.00±11.26 151.40±6.73#146.70±8.84#144.30±12.90#133.80±9.95#158.80±7.41#140.00±10.65#SHR?CANA(60 mg/kg)組166.00±18.43 166.20±6.80 172.30±4.57#142.30±12.06#141.20±16.40#134.70±11.28#115.20±5.61#133.00±2.94#132.80±5.13#

2.2 卡格列凈對各組血糖和體重的影響

與SHR 組比較，SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組在給藥后1～8 周血糖降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。由于卡格列凈在糖尿病患者和動(dòng)物模型中有降低體重的作用［13，20］，筆者研究了卡格列凈對SHR 體重的影響。與SHR 組比較，SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組較SHR 組體重均有下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表3。

表3 卡格列凈對各組不同時(shí)期血糖和體重的影響（n=8，±s）Tab 3 Effects of canagliflozin on blood glucose and body weight of rats in each groups in different periods（n=8，±s）

表3 卡格列凈對各組不同時(shí)期血糖和體重的影響（n=8，±s）Tab 3 Effects of canagliflozin on blood glucose and body weight of rats in each groups in different periods（n=8，±s）

注：與SHR 組比較，#P<0.01。

時(shí)間（周數(shù)）血糖(mmol/L)體重(g)WKY 組SHR 組SHR?CANA(30 mg/kg)組6.90±0.22 6.60±0.34#5.68±0.76#4.95±0.26#4.40±0.32#5.08±0.26#4.93±0.28#4.38±0.70#4.68±0.33#SHR?CANA(60 mg/kg)組6.80±0.37 6.55±0.58#5.60±0.36#4.98±0.81#4.00±0.24#4.15±0.17#4.78±0.28#4.48±0.36#4.18±0.30#WKY 組SHR 組012345678FP 6.73±0.22 7.00±0.56 7.00±0.56 6.48±0.66 6.30±0.32 6.33±0.67 6.40±0.50 6.53±0.92 6.50±0.59 7.23±0.81 7.83±0.55 7.03±0.76 6.70±0.55 6.20±0.53 6.80±0.50 6.50±0.41 7.08±1.10 6.63±0.46 313.00±8.29 327.80±19.33 334.80±15.44 343.00±8.76 335.30±6.70 339.80±6.70 332.50±6.25 341.00±3.74 342.50±10.41 319.30±17.67 330.80±7.27 337.80±3.10 336.00±7.87 338.00±4.69 350.80±7.32 347.00±4.76 348.80±7.54 339.00±6.83 SHR?CANA(30 mg/kg)組304.50±8.89 292.00±9.42#267.80±4.19#280.50±5.75#258.50±10.34#257.00±14.67#262.80±10.50#258.00±7.70#250.00±13.76#SHR?CANA(60 mg/kg)組312.50±16.92 296.00±9.90#291.30±6.24#271.30±3.86#259.80±2.87#255.00±8.60#246.30±7.46#244.00±8.60#252.00±5.29#2.553 0.001 51.027<0.001

2.3 卡格列凈對各組左心室肥厚及功能的影響

卡格列凈治療8 周后，SHR 組的室間隔厚度、左室后壁厚度、收縮期末容積均較WKY 組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與SHR 組比較，SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組室間隔厚度、左室后壁厚度、收縮期末容積均有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4。檢測心臟重量/體重（HW/BW）和左心重量/心臟重量（LHW/HW）的比值，與WKY組相比，SHR組的HW/BW和LHW/HW增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與SHR 組相比，SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組的HW/BW 和LHW/HW 降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HE 染色結(jié)果顯示，與WYK 相比，SHR 組心肌細(xì)胞橫截面積較WKY 組顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與SHR 組比較，SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組心肌細(xì)胞橫截面積顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖1和表5。

表5 卡格列凈對各組心肌肥厚的影響（n=8，±s）Tab 5 Effects of canagliflozin on myocardial hypertrophy in each group（n=8，±s）

表5 卡格列凈對各組心肌肥厚的影響（n=8，±s）Tab 5 Effects of canagliflozin on myocardial hypertrophy in each group（n=8，±s）

注：與SHR 組比較，#P<0.01。

HE 染色（心肌細(xì)胞橫截面積，μm2）組別全心/體重(g/g)左心/全心(g/g)0.003 3±0.000 15#0.69±0.005 6#6 565.00±375.50#0.004 0±6.923e?0050.80±0.02314 030.00±885.40 0.003 7±1.431e?005#0.72±0.032#7 067.00±371.60#0.003 5±0.000 13#0.73±0.047#5 770.00±557.60#32.958.45169.80 0.000 10.002 70.000 1 WKY 組SHR 組SHR?CANA(30 mg/kg)組SHR?CANA(60 mg/kg)組FP

圖1 各組心肌組織HE 染色（×40）Fig 1 HE staining of myocardial tissue in each group（×40）

表4 卡格列凈對各組左心室肥厚及功能的影響（n=8，±s）Tab 4 Effects of canagliflozin on left ventricle cardiac hyper?trophy and function in SHRs（n=8，±s）

表4 卡格列凈對各組左心室肥厚及功能的影響（n=8，±s）Tab 4 Effects of canagliflozin on left ventricle cardiac hyper?trophy and function in SHRs（n=8，±s）

注：與SHR 組比較，#P<0.01。

組別收縮期末容積(μL)左室后壁厚度（mm）室間隔厚度(mm)WKY 組SHR 組SHR?CANA(30 mg/kg)組SHR?CANA(60 mg/kg)組85.45±21.19#125.40±23.44 91.09±9.76#84.97±14.15#5.88 0.008 50.001 00.006 6 FP 1.68±0.20#2.09±0.25 1.67±0.20#1.63±0.17#5.52 2.68±0.14#3.32±0.27 2.80±0.39#2.47±0.22#8.95

2.4 卡格列凈對各組心肌纖維化的影響

組織學(xué)檢查顯示，SHR 組心肌間質(zhì)膠原體積較WKY 組增加，SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組減少。見圖2。與WKY組相比，SHR 組Col1a 和Col3a 的表達(dá)顯著升高。與SHR 組相比，SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組Col1a 和Col3a 的表達(dá)被抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。與WKY 組相比，SHR 組MMP2 的相對mRNA 和蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。然而，與SHR 組相比，SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組MMP2 表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖2～4 和表6。

表6 卡格列凈對各組心肌纖維化的影響（n=8，±s）Tab 6 Effects of canagliflozin on myocardial fibrosis in each group（n=8，±s）

表6 卡格列凈對各組心肌纖維化的影響（n=8，±s）Tab 6 Effects of canagliflozin on myocardial fibrosis in each group（n=8，±s）

注：與SHR 組比較，#P<0.05。

組別WKY 組Col1a/GAPDH（RT?PCR）1.00±0.00#Col1a/β?tubulin(western?blotting)0.067±0.003 2#Col3a/GAPDH（RT?PCR）1.00±0.00#MMP2/β?tubulin(western?blotting)0.34±0.22#MMP2/GAPDH（RT?PCR）1.00±0.00#SHR 組SHR?CANA(30 mg/kg)組SHR?CANA(60 mg/kg)組2.17±0.89 0.72±0.31#0.48±0.19#0.310±0.031 0.110±0.067#0.043±0.019#2.32±0.83 0.83±0.34#0.17±0.070#1.25±0.33 1.15±0.062#0.24±0.17#3.43±0.78 1.31±0.24#0.39±0.072#FP 7.292 27.68 12.16 16.61 31.35 0.0001 0.0112 0.0001 0.0024 0.0009

圖2 各組心肌Masson 三色法染色（×40）Fig 2 Myocardial Masson Trichrome Stain in each group（×40）

2.5 卡格列凈對各組心肌組織AGTR1、AGTR2、Renin、TGF?β1 和Smad4 表達(dá)的影響

與WKY 組相比，SHR 組的TGF?β1 及Smad4的mRNA 和蛋白水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與SHR 組比較，SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組的TGF?β1 及Smad4 的mRNA 和蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與WKY 組相比，SHR 組AGTR1 和腎素中mRNA 水平升高，而與WKY 組相比，SHR組AGTR2 mRNA 水平降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與SHR 組相比，SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組AGTR1 及Renin 的mRNA 的表達(dá)降低，而SHR?CANA（30 mg/kg）組、SHR?CANA（60 mg/kg）組中AGTR2 mRNA 的表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖5、6 及表7、8。

表7 卡格列凈對各組心肌組織TGF?β1 和Smad4 表達(dá)的影響（n=8，±s）Tab 7 Effects of canagliflozin on the expression of TGF?β1 and Smad4 in myocardial tissue in each group（n=8，±s）

表7 卡格列凈對各組心肌組織TGF?β1 和Smad4 表達(dá)的影響（n=8，±s）Tab 7 Effects of canagliflozin on the expression of TGF?β1 and Smad4 in myocardial tissue in each group（n=8，±s）

注：與SHR 組比較，#P<0.01。

組別TGF?β1/GAPDH（RT?PCR）Smad4/β?tubulin(western?blotting)Smad4/GAPDH（RT?PCR）TGF?β1/β?tubulin(western?blotting)WKY 組SHR 組SHR?CANA(30 mg/kg)組SHR?CANA(60 mg/kg)組1.00±0.00#2.28±0.49 1.35±0.059#0.90±0.47#45.9816.0311.0313.4 0.000 10.0010.003 20.000 4 FP 0.35±0.13#1.72±0.19 0.46±0.13#0.59±0.18#0.42±0.015#1.00±0.00 0.51±0.015#0.39±0.13#0.44±0.068#1.51±0.54 0.37±0.028#0.51±0.12#

圖5 各組心肌Smad4 的蛋白表達(dá)Fig 5 Protein expression of myocardial Smad4 in each group

圖3 各組心肌Col1a 的蛋白表達(dá)Fig 3 Protein expression of myocardial Col1a in each group

圖4 各組心肌MMP2 的蛋白表達(dá)Fig 4 Protein expression of myocardial MMP2 in each group

圖6 各組心肌TGF?β1 的蛋白表達(dá)Fig 6 Protein expression of myocardial TGF?β1 in each group

表8 卡格列凈對各組心肌組織AGTR1、AGTR2、腎素表達(dá)的影響（n=8，±s）Tab 8 Effects of canagliflozin on the expression of AGTR1，AGTR2 and renin in myocardial tissue in each group（n=8，±s）

表8 卡格列凈對各組心肌組織AGTR1、AGTR2、腎素表達(dá)的影響（n=8，±s）Tab 8 Effects of canagliflozin on the expression of AGTR1，AGTR2 and renin in myocardial tissue in each group（n=8，±s）

注：與SHR 組比較，#P<0.01,#P<0.05。

Renin/GAPDH（RT?PCR）1.00±0.00#4.78±1.89 1.39±0.52#0.96±0.19#10.51 0.0038組別WKY 組SHR 組SHR?CANA(30 mg/kg)組SHR?CANA(60 mg/kg)組FP AGTR1/GAPDH（RT?PCR）1.00±0.00#4.61±0.99 1.24±0.46#0.54±1.60#34.34 0.0001 AGTR2/GAPDH（RT?PCR）1.00±0.00#0.17±0.019 0.84±0.36#0.62±0.25#10.53 0.0011

3 討論

本研究旨在探討卡格列凈對高血壓引起的心臟重構(gòu)的影響?？ǜ窳袃舾深A(yù)可減輕SHR 心肌肥厚、纖維化和心功能障礙?？ǜ窳袃粝抡{(diào)了Col1a、Col3a、MMP?2、TGF?β1 和Smad4 等纖維化分子標(biāo)志物的表達(dá)。研究證明卡格列凈可抑制AGTR1 和Renin mRNA 表達(dá)，但上調(diào)了AGTR2 mRNA 的水平。這些結(jié)果表明，卡格列凈可以改善SHR 的心室重構(gòu)，這為卡格列凈對心血管疾病的治療提供了一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

卡格列凈最初用于控制血糖，也被發(fā)現(xiàn)具有心血管保護(hù)作用。CANVAS 試驗(yàn)表明卡格列凈降低了2 型糖尿病患者心血管疾病死亡的風(fēng)險(xiǎn)［12，13］。降低心血管死亡率的機(jī)制包括降低血壓、減輕體重、改善血管硬度、改善血糖和促進(jìn)利尿。本研究表明，卡格列凈治療可以降低血壓、體重和血糖。我們的結(jié)果與其他研究報(bào)道結(jié)果一致。最近的一項(xiàng)研究表明卡格列凈治療2 型糖尿病患者24 周后顯著降低體重［21］。在高脂肪飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠中也可以觀察到類似的結(jié)果，這些小鼠的脂肪量和白色脂肪組織重量都減少［22］。這種減少可能與卡路里損失的誘導(dǎo)有關(guān)［19］。與其他藥物相比，卡格列凈治療可降低2 型糖尿病患者的收縮壓和舒張壓［23］。在用卡格列凈治療的非糖尿病大鼠中發(fā)現(xiàn)血壓也降低［17］。一些研究表明卡格列凈促進(jìn)小鼠、大鼠和家兔對乙酰膽堿的血管舒張敏感性，這可能有助于解釋卡格列凈降低血壓的作用［17，24，25］?？ǜ窳袃糇鳛橐环N降糖藥，可以降低糖尿病小鼠和大鼠的循環(huán)血糖濃度，但不能降低非糖尿病動(dòng)物的血糖濃度［26，27］。本實(shí)驗(yàn)表明卡格列凈治療SHRs 的血糖水平降低，這是有爭議的。這一差異可能與不同動(dòng)物模型和不同劑量的卡格列凈有關(guān)。

心肌肥厚的特點(diǎn)是心肌數(shù)量增加，心室厚度增加，心肌細(xì)胞大小增加，心功能受損，是心血管死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［3，4，28］。因此，減輕心肌肥厚對預(yù)防心血管疾病的進(jìn)一步死亡至關(guān)重要。研究報(bào)道了SGLT?2i 在減輕心肌肥厚方面的有效性。Shi 等［29］觀察到達(dá)格列凈治療后降低了主動(dòng)脈橫向收縮小鼠升高的HW/BW 比、左室直徑、左室后壁厚度和左室射血分?jǐn)?shù)。最近的一項(xiàng)研究報(bào)道，達(dá)格列凈通過調(diào)節(jié)TGF?β1/Smad 通路改善Ang Ⅱ輸注SD 大鼠的心肌肥厚和左心室功能［30］。在使用依格列凈治療的肥胖大鼠中，心臟重量和左心室體積的增加得到了改善［31］。同樣，有研究表明卡格列凈治療3個(gè)月顯著改善了2 型糖尿病患者的左心室舒張功能［14］。有報(bào)道稱卡格列凈對非糖尿病雄性大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，并可減輕糖尿病和非糖尿病心臟心肌梗死［17，26］。與之前的研究一致，本實(shí)驗(yàn)表明，與SHR 相比，卡格列凈治療SHR 顯著降低了HW/BW 比、LVW/HW 比、心肌細(xì)胞大小、左室壁厚度、室間隔厚度和左室收縮期末容積。表明卡格列凈可以改善心室重構(gòu)。

心肌纖維化與心功能障礙密切相關(guān)［3，4，10］。眾所周知，長期高血壓可誘發(fā)心肌纖維化［3，4，10］。心肌纖維化的特點(diǎn)是膠原過度積累和細(xì)胞外基質(zhì)降解，增加舒張強(qiáng)度，引起左室舒張功能損害［10］。膠原蛋白由成纖維細(xì)胞合成，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原分別占心臟膠原蛋白的80%和10%。慢性壓力超負(fù)荷可促進(jìn)膠原基因表達(dá)和膠原蛋白合成。多項(xiàng)研究表明SHR 心臟中Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達(dá)高于WKY［32，33］。高血壓引起的心肌細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)受基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）調(diào)控。越來越多的研究表明，異常的基質(zhì)金屬蛋白酶活性可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)破壞和基質(zhì)降解［34］。MMP2 在鹽敏感的高血壓大鼠和SHR 大鼠心肌組織中表達(dá)增加。有研究表明，MMP2 調(diào)節(jié)膠原合成和心臟基質(zhì)重塑。MMP2 敲除可減少心肌肥厚并改善心肌纖維化，而MMP2 過表達(dá)可增強(qiáng)心肌肥厚和心肌纖維化［35，36］。本研究發(fā)現(xiàn)SHR 大鼠心臟組織中膠原沉積以及Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和MMP?2中mRNA 和蛋白水平增加，卡格列凈治療后可使其減弱。研究提示MMP2 可能參與卡格列凈在心臟重構(gòu)中的保護(hù)作用。

TGF?β 信號通路在心肌重塑的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用［9］。作為纖維形成的主要介質(zhì)，TGF?β1 已被證實(shí)在高血壓大鼠的心臟組織中過度表達(dá)和激活［9］。許多研究表明TGF?β1 在心臟重塑中的重要性。例如，TGF?β1 在轉(zhuǎn)基因小鼠中過表達(dá)可促進(jìn)心肌肥厚和纖維化，而TGF?β1 缺乏的雜合小鼠心肌纖維化減弱［37，38］。TGF?β1 通過典型的Smad 依賴信號通路發(fā)揮促纖維化活性。TGF?β1與特異性TGF?β Ⅱ型受體結(jié)合后，受體調(diào)節(jié)的R?SMADs（SMAD2，SMAD3）被激活。R?SMADs與常見Smad4 結(jié)合形成復(fù)合物，復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核并調(diào)控其下游基因表達(dá)［6，7，11］。最近的研究表明，TGF?β1 誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞中Smad4的表達(dá)［39］。在慢性心肌梗死瘢痕和壓力超載的小鼠心臟中TGF?β1 和Smad4 表達(dá)升高［3，40，41］。使用NLRP3 抑制劑MCC950 抑制TGF?β1 和Smad4 的上調(diào)，同時(shí)減輕心肌肥厚和纖維化［39］。同樣，達(dá)格列凈通過降低TGF?β1 的表達(dá)抑制血管內(nèi)皮素誘導(dǎo)的肥大和纖維化［26］。與上述研究結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)表明卡格列凈可減少SHR 心肌組織中TGF?β1 和Smad 4 的表達(dá)，從而減輕高血壓引起的病理性心臟重構(gòu)。

有研究報(bào)道，腎素血管緊張素系統(tǒng)（RAS）與高血壓引起的心肌重塑密切相關(guān)［3，6，7］。RAS 包括循環(huán)RAS 和組織RAS。越來越多的研究表明，組織RAS 可影響心臟，對病理性心臟重塑有更直接的影響［6，7］。較多的證據(jù)表明，Ang Ⅱ通過與AGTR1 相互作用可促進(jìn)心臟重構(gòu)，而AGTR2 被認(rèn)為具有心臟保護(hù)作用［6?8］。有報(bào)道稱，持續(xù)輸注Ang Ⅱ誘導(dǎo)大鼠使心臟AGTR1 表達(dá)和AGTR2 表達(dá)減少，并伴有心肌肥厚、心肌纖維化和血壓升高［42］。在高鹽飼料喂養(yǎng)的大鼠中，發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ和AGTR1 在心臟中表達(dá)增加［8，43］。同樣，SHR 心肌組織中腎素、AG?TR1、Ang Ⅱ表達(dá)上調(diào)，AGTR2 表達(dá)下調(diào)［44］。通過調(diào)節(jié)RAS 的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)高血壓引起的病理性心臟重塑。例如，纈沙坦通過調(diào)節(jié)AGTR1、AGTR2、ACE1 和ACE2 表達(dá)的表達(dá)，防止SHR 的心肌肥大和纖維化［45］。擬鈣蛋白R(shí)568 通過調(diào)節(jié)腎素、AngⅡ、AGTR1 和AGTR2 的表達(dá)改善高血壓誘導(dǎo)的心臟重構(gòu)［44］。在本實(shí)驗(yàn)中，心臟組織中腎素、AGTR1表達(dá)增加，而AGTR2 表達(dá)減少。卡格列凈可逆轉(zhuǎn)其表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)表明卡格列凈對SHR 心肌重構(gòu)的有益影響是通過調(diào)節(jié)RAS 介導(dǎo)的。

綜上所述，本研究表明卡格列凈治療通過調(diào)節(jié)RAS 和TGF?β1/Smad 信號通路減輕高血壓所致心肌肥厚和纖維化。

作者貢獻(xiàn)度說明：

李愛花：實(shí)驗(yàn)操作、指標(biāo)檢測，撰寫論文；秦迎春、謝亦璘：協(xié)助實(shí)驗(yàn)造模；王青青：數(shù)據(jù)分析；嚴(yán)志強(qiáng)：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)、論文修改、審閱。

本文無任何利益沖突。