β-葡萄糖苷酶檢測方法及其應(yīng)用進(jìn)展

尹守亮，楊鎰嬰，徐文，張穎超，王雯雯，李秋園，周志江

1(天津大學(xué) 化工學(xué)院，天津，300072)2(華北理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山，063210)3(華北理工大學(xué) 冀唐學(xué)院，河北 唐山，063210)4(中溶科技股份有限公司 博士后創(chuàng)新實(shí)踐基地，河北 唐山，064499)

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase, EC3.2.1.21)又稱為苦杏仁苷酶(amygdalase)、龍膽二糖酶(gentiobiose)及纖維二糖酶(cellobiase)，能夠水解多種葡萄糖綴合物非還原末端的β-D-葡萄糖苷鍵，釋放出β-D-葡萄糖分子和相應(yīng)的配基分子，該酶廣泛分布于微生物、植物、哺乳動(dòng)物和人體中，在食品、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)及環(huán)境等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值[1]。例如，添加β-葡萄糖苷酶能夠促進(jìn)果汁和葡萄酒中重要風(fēng)味成分的生物轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)其口感[2]；通過監(jiān)測人體內(nèi)的β-葡萄糖苷酶活性可以實(shí)現(xiàn)對(duì)戈謝病、帕金森、肺動(dòng)脈高血壓及中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等疾病的診斷[3-4]；β-葡萄糖苷酶作為纖維素酶系的重要組成成分能夠顯著促進(jìn)木質(zhì)纖維素的完全水解，提高纖維素轉(zhuǎn)化為燃料乙醇的效率[5]；土壤中的β-葡萄糖苷酶有助于降解土壤中多種有機(jī)質(zhì)，從而保持土壤質(zhì)量[6]。與其他物種來源的β-葡萄糖苷酶相比，來自微生物(如細(xì)菌、真菌和酵母)的各種β-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出更廣泛的生化特性、底物特異性和穩(wěn)定性，大量新型β-葡萄糖苷酶或單獨(dú)使用、或與其他商業(yè)酶制劑聯(lián)合使用，在食品、香料、酒精飲料、生物燃料和制藥領(lǐng)域發(fā)揮了巨大的作用。

根據(jù)β-葡萄糖苷酶蛋白組成的氨基酸序列相似性和保守結(jié)構(gòu)特征，β-葡萄糖苷酶可劃分入GH1、GH2、GH3、GH5、GH9、GH30、GH39和GH116等8個(gè)糖基水解酶家族(http://www.cazy.org/)，其中GH1家族中的β-葡萄糖苷酶的數(shù)量最多[1]。基于X射線衍射和核磁共振圖譜數(shù)據(jù)分析，GH1、GH2、GH5、GH30和GH39家族的β-葡萄糖苷酶具有典型的 (β/α)8桶狀催化結(jié)構(gòu)域，GH3家族多呈現(xiàn) (β/α)8桶狀和 (α/β)6三明治狀的結(jié)構(gòu)域，而GH9和GH116家族顯現(xiàn)出典型的 (α/α)6桶狀結(jié)構(gòu)域，當(dāng)前對(duì)于GH1和GH3家族的β-葡萄糖苷酶的結(jié)構(gòu)研究較為廣泛[7]。β-葡萄糖苷酶能夠催化芳香基或脂肪烴基與糖基之間的β-葡萄糖苷鍵的斷裂，常見的天然水解底物有水楊苷(salicin)、京尼平苷(geniposide)、七葉靈(esculin)、4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷(4-methylumbelliferyl-β-D-glucopyranoside，4-MUG)以及纖維二糖(cellobiose)等，人工合成底物有對(duì)硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,pNPG)和黃酮醇-β-D-葡萄糖苷(flavonol-β-D-glucoside)等[8]。根據(jù)底物酶解后產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型及特征，測定β-葡萄糖苷酶活性的方法包括多種，主要有分光光度法、熒光法、電化學(xué)法以及試劑盒等方法。本文主要綜述了近些年各種測定β-葡萄糖苷酶活性方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)及檢測β-葡萄糖苷酶活性的最新應(yīng)用進(jìn)展。

1 分光光度法

大多數(shù)無機(jī)化合物、有機(jī)化合物及蛋白質(zhì)等在紫外或可見光區(qū)具有一定的特征光吸收，或者能夠轉(zhuǎn)化為某些具有特定吸收的衍生物，因此，分光光度法在生化反應(yīng)產(chǎn)物的定量分析中應(yīng)用非常廣泛。采用分光光度法測定β-葡萄糖苷酶活性常用的反應(yīng)底物、工作原理及優(yōu)缺點(diǎn)如下。

(1)水楊苷法

β-葡萄糖苷酶能夠催化水楊苷分解成葡萄糖和水楊醇(saligenin)(圖1-a)。第1種顯色方法是在堿性、煮沸的條件下，酶解產(chǎn)生的葡萄糖分子與3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸(3-amino-5-nitrosalicylic acid)，該產(chǎn)物在540 nm處有最大吸收，且其吸光值與酶解產(chǎn)生的葡萄糖量呈線性關(guān)系[9]；第2種顯色方法是在堿性且有鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])存在的條件下，水楊苷分解的另一產(chǎn)物水楊醇與4-氨基安替比林(4-aminoantipyrin)反應(yīng)生成紅色的染料安替比林(antipyrine)，通過在500～510 nm波長處測定安替比林的吸光值來表征β-葡萄糖苷酶催化水楊苷的水解程度[10]。

DNS顯色法仍然是目前最常用的測定酶學(xué)活性的經(jīng)典方法，其操作過程簡單、材料試劑廉價(jià)易得，儀器設(shè)備要求低，并且對(duì)于酶解產(chǎn)物為葡萄糖的其它類水解酶也均適用，因此，該方法在高校、科研院所中使用最為普遍；但DNS法顯色結(jié)果易受反應(yīng)環(huán)境條件的影響，DNS能夠與多種還原糖發(fā)生顯色反應(yīng)，因此其靈敏度和準(zhǔn)確度會(huì)受到一定的影響[9]。而4-氨基安替比林具有易潮解、易氧化的性質(zhì)，其純度會(huì)直接影響空白試驗(yàn)的吸光度值，且顯色反應(yīng)混合物長時(shí)間存放不穩(wěn)定，需要在固定時(shí)間內(nèi)完成樣品的測試，否則會(huì)導(dǎo)致分析結(jié)果的準(zhǔn)確性降低，目前，4-氨基安替比林顯色法多用于檢測土壤、水體中揮發(fā)和非揮發(fā)性酚類物質(zhì)含量[11]。

(2)pNPG法

以pNPG作為β-葡萄糖苷酶的酶解底物，其反應(yīng)產(chǎn)物之一為對(duì)硝基苯酚(p-nitrophenol，pNP)，通過分光光度計(jì)在400～420 nm波長處直接測定pNP的吸光值來評(píng)價(jià)β-葡萄糖苷酶的水解活性(圖1-b)。pNPG和水楊苷均是測定β-葡萄糖苷酶活性的最常用的2種底物，pNPG方法具有操作步驟少、檢測條件溫和、靈敏度高和重現(xiàn)性較好，水解反應(yīng)完成后不需額外實(shí)驗(yàn)操作就可直接進(jìn)行定量測定等特點(diǎn)，尤其在微生物和植物中β-葡萄糖苷酶活性的檢測應(yīng)用較為普遍[8, 12]。但pNPG的價(jià)格較為昂貴，且在400 nm波長的檢測條件下，易受生物混合樣品中其它光吸收雜質(zhì)信號(hào)的干擾，一定程度上限制了其應(yīng)用。

(3)京尼平苷法

梁華正等[13]利用京尼平苷作為β-葡萄糖苷酶的反應(yīng)底物，其水解產(chǎn)生的京尼平(genipin)與精氨酸能夠發(fā)生顯色反應(yīng)，通過在590 nm波長處測定反應(yīng)混合物的吸光度值來評(píng)價(jià)β-葡萄糖苷酶的活性(圖1-c)。該方法與pNPG法相比, 雖然靈敏度較低, 但精密度和準(zhǔn)確度均較好，且該顯色反應(yīng)結(jié)果能夠在寬pH范圍(5～9)和長時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定(10 h)[13-14]。該方法中使用了精氨酸作為反應(yīng)的顯色底物，但反應(yīng)環(huán)境中的其它氨基酸(甘氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸)也可能會(huì)產(chǎn)生一定的顯色干擾，因此，對(duì)于復(fù)雜生物樣品來源的混合物中β-葡萄糖苷酶活性的測定，其準(zhǔn)確性可能會(huì)有所降低。京尼平一般常作為藥物中間體用于治療腫瘤、肝硬化、神經(jīng)退行性病變等疾?。煌瑫r(shí)它也是一種天然的生物交聯(lián)劑，其細(xì)胞毒性極低，在藥物載體領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用，因此，大多數(shù)研究人員多以京尼平苷作為酶的反應(yīng)底物來篩選或改造高親和力、高催化活性的β-葡萄糖苷酶[15-17]。除京尼平苷外，藥用植物中的白藜蘆醇苷和黃芩苷等也常做篩選的底物用于獲得高水解活性的β-葡萄糖苷酶[18-19]。

圖1 分光光度法測定β-葡萄糖苷酶活性常用底物種類及反應(yīng)過程Fig.1 The substrate and reaction process of β-glucosidase activity determined by spectrophotometry

2 熒光法

熒光法是指某些化合物分子被外來輻射光照射吸收能量后由基態(tài)轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)，當(dāng)激發(fā)態(tài)分子躍遷回基態(tài)時(shí)常伴隨發(fā)光現(xiàn)象，通過測定其發(fā)光強(qiáng)度來表征待測分子的含量，該方法在食品、衛(wèi)生、環(huán)境、藥物、臨床生化等方面有著廣泛的應(yīng)用[20]。熒光法包括酶解后生成的產(chǎn)物直接能夠產(chǎn)生熒光的，以及酶解產(chǎn)物與其它底物反應(yīng)間接產(chǎn)生熒光2種。例如在醫(yī)學(xué)上常用4-MUG來檢測戈謝病病人的β-葡萄糖苷酶活性，β-葡萄糖苷酶催化4-MUG分解產(chǎn)生4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferone，4-MU)和β-D-葡萄糖，通過在355 nm激發(fā)光、460 nm淬滅光波長條件下測定4-MU的熒光值強(qiáng)度變化來評(píng)價(jià)β-葡萄糖苷酶的活性(圖2-a)[21]。但是4-MU的藍(lán)色熒光易與某些生物樣品的背景雜質(zhì)信號(hào)產(chǎn)生重疊干擾，且反應(yīng)環(huán)境的pH對(duì)其熒光強(qiáng)度值影響較大，尤其對(duì)于檢測一些活性較低的β-葡萄糖苷酶，其應(yīng)用受到了一定限制[21-22]。SERDIUK等[23]在4-MUG的基礎(chǔ)上對(duì)熒光探針進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，合成了一種基于黃酮醇-β-D-葡萄糖苷分子為底物的檢測新方法，通過激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(excited state intramolecular proton transfer，ESIPT)現(xiàn)象，酶切產(chǎn)生的黃酮醇(激發(fā)光350 nm，淬滅光530 nm)探針可以通過紅移熒光被精確的監(jiān)測，該底物較4-MUG相比，顯著提高了檢測β-葡萄糖苷酶活性的靈敏度(圖2-b)。

程鑫等[24]建立了一種基于刃天青還原的熒光法，間接實(shí)現(xiàn)了對(duì)β-葡萄糖苷酶的定量分析和檢測，該方法的底物是2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸(2-O-β-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid, AA-2βG)，AA-2βG在β-葡萄糖苷酶的水解作用下生成具有還原性的抗壞血酸(ascorbic acid)，抗壞血酸將刃天青(resazurin)還原成具有強(qiáng)烈熒光效應(yīng)的試鹵靈(resorufin)，通過測定試鹵靈的濃度(激發(fā)光579 nm，發(fā)射光584 nm)來表征β-葡萄糖苷酶的活性(圖2-c)。該方法操作簡單，現(xiàn)象明顯，既可以通過裸眼觀察顯色反應(yīng)過程(青藍(lán)色逐漸變成紫紅色，隨后變?yōu)榉奂t色)實(shí)現(xiàn)對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的定性評(píng)價(jià)，也可利用熒光酶標(biāo)儀實(shí)現(xiàn)酶活性的定量分析。王龍文等[25]基于點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的原理，將β-葡萄糖苷酶水解AA-2βG產(chǎn)生的抗壞血酸用于還原Cu(II)成Cu(I)，Cu(I)進(jìn)而原位催化香豆素(coumarin)和芐基疊氮(benzyl azide)進(jìn)行環(huán)加成點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生高熒光強(qiáng)度的三氮唑(triazole)來定量分析β-葡萄糖苷酶的活性(圖2-c)，該方法的優(yōu)點(diǎn)是與常規(guī)的pNPG 和4-MUG 法相比, 可避免400 nm 波長范圍內(nèi)的反應(yīng)環(huán)境中可能存在的生色基團(tuán)的干擾，提高測定混合樣品中β-葡萄糖苷酶活性的準(zhǔn)確度和精確度。

XING等[26]設(shè)計(jì)并合成了一種全新的熒光感應(yīng)分子SY，該分子在極低濃度條件下(5.4×10-8mol/L)就能夠與β-葡萄糖苷酶水解扁桃苷(amygdalin)產(chǎn)生的CN-接合，進(jìn)而促進(jìn)SY分子內(nèi)部電荷的轉(zhuǎn)移引起熒光強(qiáng)度變化，通過多通道熒光分析儀可在雙重?zé)晒獗嚷氏?I414/I564和I803/I564)實(shí)現(xiàn)對(duì)CN-含量的高選擇性和高精確性檢測，這種雙重?zé)晒獗嚷史治龇椒@著提高了β-葡萄糖苷酶活性檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度(圖2-d)。LIU等[27]建立了一種基于CN-的新型免標(biāo)記熒光“turn off-on”納米傳感器用于評(píng)估土壤中β-葡萄糖苷酶活性，其原理是利用處于熒光猝滅(“turn off”)狀態(tài)的半胱氨酸(Cys)包覆的CuInS2量子點(diǎn)(Cys-CuInS2QDs)與經(jīng)β-葡萄糖苷酶特異性水解生氰苷釋放出的CN-結(jié)合，使Cys-CuInS2QDs熒光恢復(fù)(“turn on”)。通過熒光信號(hào)的“turn off”和“turn on”能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)β-葡萄糖苷酶存在與否、活性大小及抑制因子進(jìn)行精密的檢測與分析(圖2-d)。

圖2 熒光法測定β-葡萄糖苷酶活性的原理Fig.2 The principle of β-glucosidase activity detected by the fluorescence method

無論是利用β-葡萄糖苷酶水解扁桃苷生成CN-觸發(fā)底物產(chǎn)生熒光，還是利用β-葡萄糖苷酶水解AA-2βG生成抗壞血酸引發(fā)底物產(chǎn)生熒光，其主要優(yōu)點(diǎn)是都能成功實(shí)現(xiàn)對(duì)極低β-葡萄糖苷酶活性的準(zhǔn)確測定，如CuInS2QDs檢測最低限為0.000 2 U/mL；三氮唑檢測最低限為0.000 456 U/mL，這對(duì)于測量食品、土壤等環(huán)境中痕量的β-葡萄糖苷酶提供了極大的便利。但熒光法的缺點(diǎn)是反應(yīng)底物不容易獲得，有的需要通過專門化學(xué)合成得到，有的部分試劑(如Cys-CuInS2QDs中的金屬銦)的價(jià)格較為昂貴。熒光分析法具有快速、簡單、靈敏度高，以及高選擇性和高重現(xiàn)性等特點(diǎn)，且當(dāng)前逐漸朝著高效、痕量、微觀和全自動(dòng)化的方向發(fā)展[20, 24]。

3 電化學(xué)方法

因?yàn)棣?葡萄糖苷酶催化底物水解一般都能生成葡萄糖分子，CHEN等[28]基于β-葡萄糖苷酶催化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并借助個(gè)人血糖儀(personal glucose meter，PGM)建立了一種更為簡便、快速的β-葡萄糖苷酶活性及抑制劑的測定方法。其反應(yīng)原理和過程如圖3所示，β-葡萄糖苷酶催化水楊苷水解生成葡萄糖和水楊醇(saligenin)，葡萄糖在血糖檢測試紙(blood glucose test strips)上的葡萄糖脫氫酶的作用下發(fā)生脫氫反應(yīng)，并將電子和氫轉(zhuǎn)移給氧化型輔酶I(NADP+)形成還原型輔酶I(NADPH)；NADPH和水楊醇進(jìn)一步觸發(fā)血糖檢測試紙上的鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])還原為亞鐵氰化鉀(K4[Fe(CN)6])，其中轉(zhuǎn)移的電子轉(zhuǎn)變成PGM可檢測的電信號(hào)。該檢測方法將氧化還原反應(yīng)電子的轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)變成血糖儀可檢測的電信號(hào)，具有檢測時(shí)間短，可視化強(qiáng)優(yōu)點(diǎn)，就像日常測定血液中葡萄糖一樣簡單便捷。JIN等[29]進(jìn)一步對(duì)使用血糖儀測定β-葡萄糖苷酶活性的方法做了更為詳細(xì)的統(tǒng)計(jì)性分析和驗(yàn)證，測試標(biāo)準(zhǔn)曲線證明該方法具有穩(wěn)定的線性關(guān)系(R2=0.999 2)，且與DNS法相比，該方法具有更好的準(zhǔn)確性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、耐用性及選擇性等優(yōu)點(diǎn)。

圖3 血糖儀測定β-葡萄糖苷酶活性原理Fig.3 Principle of measuring β-glucosidase activity by glucose meter

電化學(xué)方法所需檢測樣品量較少，只需幾微升反應(yīng)樣品便可快速計(jì)算出酶學(xué)活力。這種簡便的、快速的、小型化的β-葡萄糖苷酶檢測法在醫(yī)療診斷、食品安全和環(huán)境監(jiān)測等諸多領(lǐng)域中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[29]。

4 試劑盒方法

β-葡萄糖苷酶催化底物水解產(chǎn)生的葡萄糖可以通過商品化的血糖含量測定試劑盒來進(jìn)行定量，根據(jù)葡萄糖的含量來表征待測樣品中β-葡萄糖苷酶的活性。市場上血糖含量測定試劑盒的工作原理有葡萄糖氧化酶法和己糖激酶法等多種。葡萄糖氧化酶能夠催化葡萄糖氧化產(chǎn)生H2O2，過氧化物酶進(jìn)一步催化H2O2氧化4-氨基安替比林偶聯(lián)酚生成紅色的醌類化合物，該紅色化合物在505 nm處具有特征吸收峰。己糖激酶法是指葡萄糖和三磷酸腺苷在己糖激酶的作用下生成葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate，G-6-P)與二磷酸腺苷，G-6-P在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)催化作用下脫氫，生成6-磷酸葡萄糖酸，同時(shí)使NADP+還原成NADPH，NADPH在340 nm處存在最大吸收峰，通過測定NADPH的濃度來計(jì)算葡萄糖的濃度。除了血糖含量測定試劑盒，目前市場上已經(jīng)有許多針對(duì)不同物種(植物、哺乳動(dòng)物及人類等)、不同樣品來源而開發(fā)的專門化的β-葡萄糖苷酶活性檢測試劑盒。例如，有針對(duì)血清、血漿、細(xì)胞上清液，組織勻漿等樣品的“人β-葡萄糖苷酶ELISA試劑盒”，該試劑盒的工作原理主要是將含有β-葡萄糖苷酶的待測樣品與試劑盒中生物素標(biāo)記的抗體一起放置在96孔板中溫育反應(yīng)，然后加入親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶和顯色底物共同作用產(chǎn)生顏色變化，根據(jù)顏色的深淺來定量測定待測樣品中β-葡萄糖苷酶的濃度；“土壤 β-葡萄糖苷酶活性檢測試劑盒”底物多選擇pNPG，其原理屬于分光光度法，通過測定水解后產(chǎn)生的pNP的吸光值來評(píng)價(jià)土壤樣品中β-葡萄糖苷酶的活性。

試劑盒的價(jià)格雖然昂貴，但優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)操作過程不需要專門配置特定的試劑，且有明確的說明書，清晰的操作步驟，分析結(jié)果誤差較少，靈敏度、精密度和重現(xiàn)性也都較好。經(jīng)過對(duì)多家食品、醫(yī)藥和酶制劑廠家的調(diào)研發(fā)現(xiàn)，大部分企業(yè)公司的分析人員根據(jù)自身不同的檢測需求，而選擇不同的試劑盒來檢測β-葡萄糖苷酶活性。

5 活體細(xì)胞中β-葡萄糖苷酶活性檢測方法

β-葡萄糖苷酶在自然界中分布廣泛且具有多種重要的生物學(xué)功能。β-葡萄糖苷酶能夠參與微生物細(xì)胞壁中碳水化合物的降解；在植物細(xì)胞中，β-葡萄糖苷酶在色素或細(xì)胞壁的生物合成、果實(shí)成熟和病蟲害防御機(jī)制中發(fā)揮重要作用；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，β-葡萄糖苷酶參與了神經(jīng)酰胺水解等過程；在人體細(xì)胞中，β-葡萄糖苷酶活性大小可以用于診斷戈謝病等疾病[30]。但是，當(dāng)前測定β-葡萄糖苷酶活性的方法，大多需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，或者對(duì)β-葡萄糖苷酶蛋白質(zhì)進(jìn)行純化回收后再準(zhǔn)確定量總蛋白量和計(jì)算其酶活力，該操作過程比較耗時(shí)，且無法精確反應(yīng)活細(xì)胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶活力的變化情況，因此，近年來，關(guān)于檢測活體細(xì)胞中β-葡萄糖苷酶活性的研究方法逐漸增多。

STRAHSBURGER等[31]研究發(fā)現(xiàn)pNPG的酶解產(chǎn)物pNP一般不能被微生物細(xì)胞進(jìn)一步代謝分解，因此，通過提前向培養(yǎng)基中添加底物pNPG，可以在405 nm波長條件下實(shí)時(shí)取樣檢測活細(xì)胞上清液中的β-葡萄糖苷酶的酶活力，通過試驗(yàn)證明該方法能夠明顯區(qū)分開自身不能合成β-葡萄糖苷酶的菌株BifidobacteriumlongumB7254和自身能夠合成β-葡萄糖苷酶的菌株BifidobacteriumpseudocatenulatumB7003；在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊(duì)利用96孔板進(jìn)行高通量篩選，從大量的備選菌株中快速篩選出了高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性的乳桿菌。PAN等[32]使用嵌入電化學(xué)功能的納米毛細(xì)管實(shí)現(xiàn)對(duì)戈謝氏病人活體細(xì)胞的溶酶體中β-葡萄糖苷酶活性的實(shí)時(shí)監(jiān)測。通過設(shè)計(jì)和制作一種納米毛細(xì)管，一方面該納米毛細(xì)管的尖端可用于分離活細(xì)胞內(nèi)單個(gè)的亞細(xì)胞腔室(溶酶體等)，形成一個(gè)微反應(yīng)室便于分析溶酶體中各種蛋白質(zhì)的活性；另一方面在毛細(xì)納米管的內(nèi)表面和外表面邊緣涂上鉑層，將涂有氯化銀的銀絲(Ag/AgCl)插入毛細(xì)管內(nèi)作為電化學(xué)測量的參比電極，制作成一個(gè)微小電化學(xué)檢測器。納米毛細(xì)管從細(xì)胞中取出獲取溶酶體后在Triton X-100作用下釋放出其中的β-葡萄糖苷酶，酶水解辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(octyl-β-D-glucopyranoside)生成的葡萄糖分子在毛細(xì)管尖端內(nèi)壁的鉑電極上通過電化學(xué)氧化產(chǎn)生H2O2分子，在通過測量H2O2的值來表征活細(xì)胞溶酶體內(nèi)β-葡萄糖苷酶的活力大小。細(xì)胞是生命活動(dòng)的最基本單元，實(shí)現(xiàn)對(duì)活體單細(xì)胞內(nèi)重要的酶學(xué)活性、特定物質(zhì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)等的監(jiān)測，能夠?yàn)樘骄磕承┘膊〉钠鹨颉l(fā)展和治療提供準(zhǔn)確、可靠的依據(jù)。

6 β-葡萄糖苷酶抑制劑篩選方法

β-葡萄糖苷酶作為一種重要的風(fēng)味酶及檢測指標(biāo)因子在食品、飲料，土壤質(zhì)量監(jiān)測等方面發(fā)揮著重要的作用。在生命機(jī)體中，β-葡萄糖苷酶參與了糖尿病、艾滋病、轉(zhuǎn)移性癌癥和溶酶體貯積病等多種疾病的發(fā)病過程[28]。因此，篩選高效的β-葡萄糖苷酶抑制劑不僅可以通過阻斷特定的代謝過程來揭示酶在生命系統(tǒng)中的關(guān)鍵功能，也可以為相關(guān)疾病的治療尋求具有前景的治療方法。

β-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選原理主要是通過抑制因子對(duì)β-葡萄糖苷酶催化底物水解反應(yīng)的抑制程度來進(jìn)行篩選。例如WU等[33]通過將β-葡萄糖苷酶固定在毛細(xì)管入口的內(nèi)壁上，建立了一種基于毛細(xì)管電泳在線固定化β-葡萄糖苷酶篩選抑制因子的微反應(yīng)器，以pNPG為模型底物，通過檢測pNPG的水解程度衡量抑制因子對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的抑制程度，利用該反應(yīng)器方法成功地從12種天然的黃酮類化合物中篩選出黃芩素、染料木素、表兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素沒食子酸酯等4種具有β-葡萄糖苷酶抑制活性的因子；并通過分子對(duì)接對(duì)4種抑制因子的抑制作用進(jìn)行模擬，表征酶-抑制因子的結(jié)合能大小依次為：表沒食子兒茶素沒食子酸酯>黃芩素>表沒食子兒茶素沒食子酸酯>染料木素，這與反應(yīng)器篩選得到的抑制率順序一致，其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯與β-葡萄糖苷酶的結(jié)合能力最強(qiáng)，對(duì)接模擬發(fā)現(xiàn)能夠與活性中心“口袋”中的ASP283，ARG280，SER304，LYS396和GLN276等位點(diǎn)結(jié)合而發(fā)揮抑制作用。CHEN等[28]利用血糖儀來篩選β-葡萄糖苷酶抑制劑，其原理是當(dāng)待測反應(yīng)樣品中混有抑制因子如粟樹精胺時(shí)，PGM的顯示數(shù)值明顯降低，因?yàn)棣?葡萄糖苷酶的抑制作用顯著降低了水楊苷分解生成葡萄糖和水楊醇的含量。通過血糖儀測試14種小分子化合物和6種茶多酚提取物對(duì)β-葡萄糖苷酶的抑制活性，發(fā)現(xiàn)沒食子酸、原兒茶醛、隱綠原酸、表?xiàng)攦翰杷?epigallocatechin)、表兒茶素和香草酸等6種化合物的抑制率均超過了40%；普洱茶和福鼎白茶的茶多酚提取物對(duì)β-葡萄糖苷酶也具有較好的抑制作用(>20%)。

7 小結(jié)

β-葡萄糖苷酶在食品工業(yè)、生物燃料及醫(yī)學(xué)檢測等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值，本文介紹了近些年來測定β-葡萄糖苷酶活性的常用方法及部分典型實(shí)例，各種測定β-葡萄糖苷酶活性的方法所使用的底物分子類型、酶學(xué)活性檢測范圍及最低檢測限等信息內(nèi)容如表1所示。建議對(duì)于常規(guī)的酶學(xué)活性測定試驗(yàn)一般可采用經(jīng)典的分光光度法，選擇水楊苷或pNPG作為催化反應(yīng)的底物，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)底物中，不同家族的β-葡萄糖苷酶一般對(duì)這2種底物酶解活性都較好[34-35]；對(duì)于檢測混合樣品中低活性的β-葡萄糖苷酶可采用靈敏度和選擇性較高的熒光法(三氮唑或CuInS2QDs)；如需要快速定量分析β-葡萄糖苷酶的活性時(shí)可選擇電化學(xué)方法或者熒光法。雖然分光光度法在檢測β-葡萄糖苷酶活性時(shí)可能會(huì)受到催化反應(yīng)背景環(huán)境中吸光雜質(zhì)的干擾，但其優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，材料試劑低廉易獲得，不需要昂貴的檢測設(shè)備，因此，在大多高校、科研院所開展一些基礎(chǔ)性、探究性的實(shí)驗(yàn)中使用最為普遍。熒光法具有快速、靈敏度和選擇性較高，有些可用于活體細(xì)胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶活性的實(shí)時(shí)檢測等優(yōu)點(diǎn)，且隨著當(dāng)前可選擇的熒光底物的種類逐漸增多(表1)，檢測試劑成本的逐漸降低，其在農(nóng)業(yè)、環(huán)境、食品和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的范圍也將越來越廣，但部分熒光法的操作流程可能會(huì)比較復(fù)雜，有的需要昂貴的儀器和訓(xùn)練有素的專業(yè)人員[36-37]。試劑盒和個(gè)人血糖儀的測定方法簡單便捷，且準(zhǔn)確性高，越來越受到各類生物公司的青睞，其多可用于環(huán)境、臨床醫(yī)學(xué)等分析現(xiàn)場的酶學(xué)活性的測定，期待在不久的將來能夠開發(fā)出更多種類、針對(duì)更多不同來源樣品、不同用途的酶學(xué)活性測定試劑盒。因?yàn)棣?葡萄糖苷酶在生物體初級(jí)代謝和次級(jí)代謝活動(dòng)中都發(fā)揮著重要的作用，期待將來進(jìn)一步開發(fā)更多的評(píng)價(jià)活體細(xì)胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶活性的檢測方法，在亞細(xì)胞水平上為進(jìn)一步解析β-葡萄糖苷酶影響生命活動(dòng)及各種生理機(jī)能奧秘提供可靠的工具。

表1 檢測β-葡萄糖苷酶活性的方法及底物類型Table 1 The method and substrates for determination of β -glucosidase activity