劉樂,李艷,連加達(dá),張穎,鄭亞軍
(山西師范大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,山西 太原,030092)
醇溶蛋白由于其獨(dú)特的溶解性能與功能特性受到日益廣泛的關(guān)注[1]。與一般蛋白質(zhì)相比,醇溶蛋白具有較好的凝膠性能和乳化性能,在制藥、高端化妝品、保健食品行業(yè)被廣泛應(yīng)用[2]??寡趸瘎┮话阒改軌蚯宄^剩自由基的物質(zhì)。當(dāng)機(jī)體失衡時(shí),大量過剩的自由基會引發(fā)連鎖反應(yīng)使得細(xì)胞的結(jié)構(gòu)受到破壞,各類疾病隨之而來[3]。因此,尋找安全、高效、無毒的天然抗氧化劑成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)等學(xué)科研究的熱點(diǎn)。近年來,研究發(fā)現(xiàn),由于某些天然蛋白質(zhì)含有特定的氨基酸序列而表現(xiàn)出良好的抗氧化活性,同時(shí)它們又具有較高的營養(yǎng)價(jià)值,因此,從天然蛋白質(zhì)中開發(fā)抗氧化劑逐漸引起人們的關(guān)注。藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)是一種藜科植物,其蛋白質(zhì)含量高達(dá)18%,且氨基酸配比平衡,藜麥蛋白中醇溶蛋白的含量約占12%[4]。藜麥自20世紀(jì)90年代引入我國,目前在山西省、河北省和內(nèi)蒙古自治區(qū)的種植面積較大,屬于新型經(jīng)濟(jì)作物[5]。近年來,學(xué)者們對藜麥總蛋白的結(jié)構(gòu)、加工特性與生物活性進(jìn)行了分析,并從中鑒定出一些降血壓肽和降血脂肽[6-7]。但目前國內(nèi)外對藜麥蛋白尤其是醇溶蛋白(quinoa prolamine,QP)的研究報(bào)道極少[4]。由于醇溶蛋白的氨基酸組成和亞基構(gòu)成與其營養(yǎng)價(jià)值與加工特性密切相關(guān),而醇溶蛋白的抗氧化性與乳化性是其能否作為天然抗氧化劑與乳化劑的主要指標(biāo),因此本試驗(yàn)研究藜麥醇溶蛋白的提取、分子質(zhì)量分布、氨基酸組成、抗氧化性與乳化性,以探究其作為天然抗氧化劑與乳化劑的可能性,同時(shí)也為藜麥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。
藜麥,山西省忻州市藜農(nóng)食品公司。2-D脫氧核糖、2,2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)自由基,武漢清季生物科技公司;FeCl3、FeSO4、鄰苯三酚等,西安科維化學(xué)試劑有限公司;玉米醇溶蛋白、維生素C,上海素培生物公司。
UV-1800PC紫外可見分光光度計(jì),浙江上虞光申科儀器公司;PR18CK-2冷凍高速離心機(jī),德國Hettich公司;BA210生物顯微鏡,上海Motic Otic有限公司;HSA-D數(shù)顯水浴振蕩儀,蘇州瑞天儀器廠;DYCZ-24D型電泳槽、DYY-6C型電泳儀,北京六一生物儀器有限公司;Gene TBFW-1型凝膠成像儀,日本GENE公司;HITACHI L-8900型氨基酸自動分析儀,日本日立公司。
1.3.1 藜麥醇溶蛋白的制備工藝
藜麥→清洗→干燥→粉碎→過60目篩→脫脂→干燥→二次粉碎→脫脂藜麥粉→過100目篩→加入0.3 mol/L NaCl[1∶10(g∶mL)]→室溫下攪拌提取2 h→過濾→棄濾液、收集濾渣→加入75%乙醇[1∶10(g∶mL)]→攪拌提取2 h→過濾→收集濾液→離心(6 000×g,20 min)→收集上清液→真空冷凍干燥→藜麥醇溶蛋白
其中,加入0.3 mol/L NaCl的目的是將脫脂藜麥中球蛋白與清蛋白提取出來,再從剩余的濾渣中提取醇溶蛋白,以提高醇溶蛋白的純度;蛋白質(zhì)的濃度采用考馬斯亮藍(lán)法測定[8]。
1.3.2 SDS-PAGE分析
參考SAHNI等[9]方法。將藜麥醇溶蛋白溶解于樣品緩沖液中,使其質(zhì)量濃度為1 mg/mL,在100 ℃下煮沸4 min,上樣12 μL,恒壓電泳(濃縮膠100 V,分離膠150 V)。電泳結(jié)束后,將膠片用考馬斯亮藍(lán)R-250染色并過夜,放入脫色液中脫色,直至膠片背景藍(lán)色完全透明,用凝膠成像儀分析。
1.3.3 藜麥醇溶蛋白的氨基酸組成分析
取6 mol/L的鹽酸5 mL,緩慢加入裝有0.1 g藜麥醇溶蛋白的帶塞試管中,攪拌均勻,密封,置于110 ℃下放置24 h。過膜(水相、孔徑為0.45 μm)后取濾液,在氨基酸自動分析儀上分析氨基酸組成與含量[10]。
1.3.4 抗氧化性分析
將藜麥醇溶蛋白復(fù)溶于75%乙醇中,配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mg/mL的溶液,進(jìn)行抗氧化活性試驗(yàn)。
1.3.4.1 還原力的測定[9]
首先將0.5 mL藜麥醇溶蛋白溶液(0.1~0.3 mg/mL)、1.2 mL磷酸緩沖溶液(pH 6.6,0.2 mol/L)和1.25 mL鐵氰化鉀(1%,質(zhì)量分?jǐn)?shù))混合均勻,50 ℃下反應(yīng)0.5 h。然后加入1.25 mL三氯乙酸(10 mg/mL),離心(3 000×g,10 min),將1.25 mL上清液,1.25 mL蒸餾水和0.25 mL的FeCl3(1%,質(zhì)量分?jǐn)?shù))混合均勻,靜置3 min后在700 nm處比色。同時(shí)以玉米醇溶蛋白(zein)和維生素C作為參比。
1.3.4.2 Fe2+絡(luò)合能力的測定
取450 μL藜麥醇溶蛋白溶液(0.1~0.3 mg/mL),加入45 μL FeSO4(2 mmol/L),然后搖勻,再加入90 μL的Ferrozine(5 mmol/L),然后加入1 815 μL的蒸餾水,搖勻后反應(yīng)30 min,在532 nm處測其吸光度[10]。同時(shí)以玉米醇溶蛋白和維生素C作為參比。Fe2+絡(luò)合率計(jì)算如公式(1)所示:
(1)
式中:AS、AB和AC分別是樣品組、樣品空白組(以蒸餾水代替Ferrozine)和對照組(蒸餾水代替樣品)的吸光值。
1.3.4.3 清除·O2-能力
取樣品液(0.1~0.3 mg/mL)0.1 mL,加入0.2 mol/L、pH 8.0的磷酸緩沖溶液1.5 mL和3 mmol/L鄰苯三酚1.5 mL,混勻后立即在320 nm處比色,每30 s記錄1次,共檢測5 min[11]?!2-清除率計(jì)算如公式(2)所示:
(2)
式中:AS、AB和AC分別是樣品組、樣品空白組(以0.2 mol/L pH 8.0磷酸緩沖液代替鄰苯三酚)和對照組(以0.2 mol/L、pH 7.4磷酸緩沖液代替樣品)的吸光值。同時(shí)以玉米醇溶蛋白和維生素C為參比。
1.3.4.4 對·OH的清除作用
在0.1 mL藜麥醇溶蛋白溶液(0.1~0.3 mg/mL)中依次加入0.1 mL FeSO4-EDTA(10 mmol/L)、0.1 mL 2-D脫氧核糖(10 mmol/L)和1.4 mL磷酸緩沖溶液(0.1 mol/L pH 7.4),混勻,以0.1 mL雙氧水(20 mmol/L)啟動反應(yīng)[12]。水浴反應(yīng)(37 ℃)1 h后,將反應(yīng)液與1 mL三氯乙酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)28%)和10 mg/mL的硫代巴比妥酸混合,在沸水浴中繼續(xù)反應(yīng)20 min,冷卻至室溫,于532 nm處比色。同時(shí)設(shè)置樣品空白組(以蒸餾水代替2-D脫氧核糖)和對照組(以蒸餾水代替樣品)。同時(shí)以玉米醇溶蛋白和維生素C為參比?!H清除能力按公式(3)計(jì)算:
(3)
式中:AS、AB和AC分別是樣品組、樣品空白組和對照組的吸光值。
1.3.4.5 對ABTS陽離子自由基的清除能力
配制7 mmol/L的ABTS(溶于0.1 mol/L pH 7.4磷酸緩沖液)溶液,與3 mmol/L的過硫酸鉀按1∶1(體積比)混勻,暗反應(yīng)12~16 h[10]。然后用0.1 mol/L、pH 7.4磷酸緩沖液稀釋原液至溶液在734 nm處的吸光值為(0.7±0.01),并記錄稀釋倍數(shù)。取稀釋液2 mL,加入樣品溶液(0.1~0.3 mg/mL)0.02 mL,30 ℃下避光反應(yīng)6 min后,測定其在734 nm處的吸光值。同時(shí)以玉米醇溶蛋白和維生素C為參比。按公式(4)計(jì)算ABTS陽離子自由基清除率。
(4)
式中:AS、AB和AC分別是樣品組、樣品空白組(以0.1 mol/L、pH 7.4的磷酸緩沖液代替ABTS溶液)和對照組(以0.1 mol/L、pH 7.4磷酸緩沖液代替樣品)的吸光值。
1.3.5 藜麥醇溶蛋白乳化性測定
試驗(yàn)共分為5組,各組稱取0.2 g藜麥醇溶蛋白于離心管中,將15 mL蒸餾水與5 mL大豆油混合。分別調(diào)節(jié)pH為2.0、4.0、6.0、8.0和10.0,然后在均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)2 min(10 000 r/min)。從形成的乳濁液底部迅速吸出50 μL加入比色皿中,用十二烷基硫酸鈉(1 g/L)稀釋至2.5 mL,立即測定其在500 nm處的吸光值(A0)以及放置30 min的吸光值(At)[13]。乳化指數(shù)(emulsify ability index,EAI)和乳化穩(wěn)定性(emulsion stability,ES)按公式(5)(6)計(jì)算:
(5)
式中:V,油相體積,L;c,藜麥醇溶蛋白溶液濃度,mol/L;n,稀釋倍數(shù)。
(6)
為觀察藜麥醇溶蛋白形成乳化液的微觀形態(tài),取少量新形成的乳狀液轉(zhuǎn)移到載玻片上,立即在BA210型生物顯微鏡下觀察并拍照,放置30 min后再次拍照。放大倍數(shù)40倍,觀察比例為1 μm。
1.3.6 數(shù)據(jù)處理
試驗(yàn)至少重復(fù)3次,取平均值,方差分析采用SPSS 16.0軟件。
采用SDS-PAGE電泳方法對藜麥醇溶蛋白的亞基組成和分子質(zhì)量進(jìn)行分析,分析結(jié)果見圖1,本試驗(yàn)中藜麥醇溶蛋白只得到1個(gè)亞基,分子質(zhì)量為9.74 kDa,這與前人的研究報(bào)道一致[4]。與大分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)相比,小分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)在溶解性、乳化性和消化吸收方面具有一定優(yōu)勢。同時(shí),小分子質(zhì)量的醇溶蛋白具有較好的抗氧化性[11]。例如,將小米、玉米醇溶蛋白酶解后生成的小分子水解肽,其抗氧化性要顯著高于未水解的小米和玉米醇溶蛋白[15-16]。
M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白;1-清蛋白;2-球蛋白;3-醇溶蛋白圖1 藜麥醇溶蛋白的 SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE profiles of quinoa prolamine
從表1可知,本試驗(yàn)從藜麥醇溶蛋白中共檢測出14種氨基酸,其中必需氨基酸在總氨基酸的比例達(dá)到20.36 g/100 g蛋白質(zhì);世界衛(wèi)生組織與聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO/WHO)[14]曾指出優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)中必需氨基酸在總氨基酸的比例應(yīng)大于12.7 g/100 g,這表明藜麥醇溶蛋白的營養(yǎng)價(jià)值較高。此外,藜麥醇溶蛋白中色氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、谷氨酸和組氨酸的含量較高,均高于小米與玉米醇溶蛋白[15-16]。
表1 藜麥醇溶蛋白的氨基酸組成 單位:g/100 g(蛋白質(zhì))Table 1 Amino acid composition of quinoa prolamine
研究表明,苯丙氨酸與色氨酸側(cè)鏈上的酚羥基、精氨酸的胍基和組氨酸的咪唑基,都是性能優(yōu)良的質(zhì)子提供體或電子淬滅基團(tuán),抗氧化性很高[10,16];而谷氨酸上的羧基可以很好地絡(luò)合過渡態(tài)金屬離子(主要是Fe2+和Cu2+),清除氧化反應(yīng)的催化劑,抑制油脂自氧化的發(fā)生[17]。此外,藜麥醇溶蛋白中非極性氨基酸的含量為21.68 g/100 g,其含量決定了氨基酸的疏水性,而表面疏水性又是影響蛋白質(zhì)乳化性能的重要內(nèi)在因素[10]。
2.3.1 藜麥醇溶蛋白的還原力
以玉米醇溶蛋白與維生素C為對照,藜麥醇溶蛋白的還原力見圖2。相同質(zhì)量濃度(>0.25 mg/mL)時(shí),藜麥醇溶蛋白的還原力與玉米醇溶蛋白接近,但顯著低于維生素C的還原力(P<0.05)。玉米醇溶蛋白是良好的抗氧化劑,具有較高的還原力;而維生素C是功能強(qiáng)大的抗氧化劑,被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[16, 18]。本試驗(yàn)結(jié)果與前人的報(bào)道一致。同時(shí)也表明,藜麥醇溶蛋白的還原力較強(qiáng)。此外,藜麥醇溶蛋白的質(zhì)量濃度從0.1 mg/mL逐漸增大到 0.3 mg/mL時(shí),其還原力也越來越大。這可能與其獨(dú)特的溶解性及氨基酸組成有關(guān)。表1結(jié)果表明藜麥醇溶蛋白中組氨酸和精氨酸以及芳香族氨基酸的含量較高,這幾種氨基酸具有較強(qiáng)的給出質(zhì)子能力,因此還原力較強(qiáng)。隨著濃度的增大,這些氨基酸的濃度也變大,因此藜麥醇溶蛋白表現(xiàn)出較高的還原力。
圖2 藜麥醇溶蛋白的還原力Fig.2 Reducing power of quinoa prolamine注:圖中不同小寫字母表示顯著性差異(P < 0.05)(下同)
2.3.2 藜麥醇溶蛋白對Fe2+的絡(luò)合能力
由圖3可知,隨著濃度的增加,藜麥醇溶蛋白對Fe2+的絡(luò)合能力逐漸增大。當(dāng)藜麥醇溶蛋白質(zhì)量濃度達(dá)到0.25 mg/mL時(shí),對Fe2+的絡(luò)合趨于飽和,因此絡(luò)合率隨濃度的增大變化并不明顯。此外,相同濃度時(shí),藜麥醇溶蛋白對Fe2+的絡(luò)合能力顯著高于玉米醇溶蛋白;但顯著低于維生素C對Fe2+的絡(luò)合能力(P<0.05)。金屬離子螯合劑可通過絡(luò)合金屬離子來阻斷或抑制油脂的自氧化反應(yīng)鏈或食品中酚類物質(zhì)的酶促褐變[18]。玉米醇溶蛋白因?yàn)榻饘匐x子絡(luò)合能力較強(qiáng)、成膜性能好,是目前被廣泛應(yīng)用的可食性保鮮膜[19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,藜麥醇溶蛋白的Fe2+絡(luò)合能力顯著高于玉米醇溶蛋白,具有開發(fā)為天然金屬離子螯合劑的潛力。
圖3 藜麥醇溶蛋白對Fe2+的絡(luò)合能力Fig.3 Ferrous ion chelating capacity of quinoa prolamine
2.3.3 藜麥醇溶蛋白對·O2-的清除能力
從圖4可以看出,藜麥醇溶蛋白、玉米醇溶蛋白和維生素C均表現(xiàn)出較好的·O2-清除能力。其中,維生素C對·O2-的清除能力最強(qiáng),玉米醇溶蛋白次之,這與前人的報(bào)道一致[19]。圖4結(jié)果也證實(shí)了藜麥醇溶蛋白的·O2-清除能力較強(qiáng),且清除能力與濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)關(guān)系。這表明藜麥醇溶蛋白可以通過提供質(zhì)子或清除電子而使·O2-淬滅,表現(xiàn)出超氧化物歧化酶活性。在0.2~0.3 mg/mL范圍內(nèi),藜麥醇溶蛋白對·O2-的清除能力與小米醇溶蛋白的清除能力接近[10]。
圖4 藜麥醇溶蛋白對·O2-的清除能力Fig.4 Superoxide radical scavenging activity of quinoa prolamine
2.3.4 藜麥醇溶蛋白對·OH的清除能力
·OH是一種重要的活性氧,氧化反應(yīng)中生成的·OH可以攻擊核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子,產(chǎn)生更多種類和數(shù)量的自由基,加速油脂自氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的速度[5]。藜麥醇溶蛋白對·OH的清除能力見圖5??梢钥闯觯见湸既艿鞍讓ΑH的清除率會隨濃度增大而呈上升趨勢。整體來看,藜麥醇溶蛋白的·OH清除能力顯著低于維生素C;但在相同濃度下,藜麥醇溶蛋白對·OH的清除能力顯著高于玉米醇溶蛋白,而小米醇溶蛋白在0.3 mg/mL時(shí),對·OH的清除能力為37.89%,這表明藜麥醇溶蛋白的·OH清除能力較強(qiáng)[14]。
圖5 藜麥醇溶蛋白對·OH的清除能力Fig.5 Hydroxyl radical scavenging activity of quinoa prolamine
2.3.5 藜麥醇蛋白對ABTS陽離子自由基的清除能力
在抗氧化體系中,ABTS陽離子自由基清除能力被認(rèn)為是物質(zhì)總抗氧化能力的評價(jià)指標(biāo)[12]。藜麥醇溶蛋白、玉米醇溶蛋白與維生素C對ABTS陽離子自由基的清除能力見圖6。
圖6 藜麥醇溶蛋白對ABTS陽離子自由基的清除能力Fig.6 ABTS cation free radical scavenging activity of quinoa prolamine
從圖6可以看出,藜麥醇溶蛋白對ABTS陽離子自由基的清除能力顯著高于玉米醇溶蛋白,但低于維生素C(P<0.05),這表明藜麥醇溶蛋白對ABTS陽離子自由基的清除能力較高,且清除能力隨濃度的增大而顯著升高。在質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL時(shí),藜麥醇溶蛋白對ABTS陽離子自由基的清除率達(dá)到98.21%。綜合分析圖2~圖5,藜麥醇溶蛋白既有較強(qiáng)的提供質(zhì)子能力(還原力),又具有快速淬滅自由基的能力(清除·OH和·O2-),還能夠通過絡(luò)合金屬離子(氧化反應(yīng)的催化劑)而阻斷氧化反應(yīng),因此表現(xiàn)出很強(qiáng)的總抗氧化能力。
圖7和圖8分別顯示了藜麥醇溶蛋白在不同pH下的乳化性和乳化穩(wěn)定性。在pH 4.0時(shí),藜麥醇溶蛋白的乳化能力最差。這主要是因?yàn)檗见湸既艿鞍椎牡入婞c(diǎn)在pH 4.0附近,由于其溶解度最低而使得吸附在油-水界面的蛋白質(zhì)少,所形成的乳狀液界面也相對較小[19]。當(dāng)遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí),隨著pH的不斷增加,溶解度也不斷增加,更多的蛋白質(zhì)可以參與乳化液的形成,也有利于蛋白質(zhì)分子的移動,因此提高了藜麥醇溶蛋白的乳化性[20],使其在pH 10.0時(shí)表現(xiàn)出最高的乳化性(943.32 m2/g)和乳化穩(wěn)定性(54.68%)。相同pH下,藜麥醇溶蛋白的乳化性高于紫蘇球蛋白與玉米醇溶蛋白[20, 22],而其乳化穩(wěn)定性高于豌豆蛋白[21],這表明藜麥醇溶蛋白的乳化性能較好。
圖7 pH對藜麥醇溶蛋白乳化性的影響Fig.7 Effect of pH on emulsifying activity of quinoa prolamine
圖8 pH對藜麥醇溶蛋白乳化穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of pH on emulsion stability of quinoa prolamine
藜麥醇溶蛋白形成乳化液的微觀結(jié)構(gòu)見圖9。在pH 10.0時(shí),較多的藜麥醇溶蛋白參與形成乳化液分布在水中,為典型的O/W型乳化液。乳滴數(shù)量較多且分布相對均勻,與圖7中所示藜麥醇溶蛋白較高的乳化活性一致。該乳濁液在放置30 min后,乳滴的數(shù)量減少,但乳滴的分布相對均勻,沒有發(fā)生明顯的油水分離的現(xiàn)象,這表明藜麥醇溶蛋白具有較好的乳化穩(wěn)定性。因此,圖9中的結(jié)果直觀地驗(yàn)證了藜麥醇溶蛋白有較高的乳化性和乳化穩(wěn)定性。此結(jié)果意味著藜麥醇溶蛋白可以作為天然乳化劑應(yīng)用于食品工業(yè)中[22]。
a-乳化液形成0 min時(shí);b-乳化液形成30 min時(shí)圖9 pH 10.0時(shí)藜麥醇溶蛋白形成乳液的微觀結(jié)構(gòu)Fig.9 Micro structures of quinoa prolamine emulsion formation at pH 10.0
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,藜麥醇溶蛋白中富含谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、色氨酸和苯丙氨酸;其必需氨基酸總和為20.36 g/100 g,營養(yǎng)價(jià)值較高。SDS-PAGE分析表明,藜麥醇溶蛋白為小分子質(zhì)量蛋白??寡趸钚苑治霰砻?,藜麥醇溶蛋白具有較高的ABTS陽離子自由基清除能力、·OH清除力、較強(qiáng)的Fe2+絡(luò)合能力和還原力,均優(yōu)于玉米醇溶蛋白。同時(shí),藜麥醇溶蛋白也具有較好的·O2-清除能力,表現(xiàn)出一定的超氧化物歧化酶活性。與玉米醇溶蛋白和豌豆蛋白相比,藜麥醇溶蛋白具有較高的乳化性(943.32 m2/g)和乳化穩(wěn)定性(54.68%)。由于藜麥的產(chǎn)量較大,藜麥醇溶蛋白的制備工藝相對比較簡單,且安全性高,因此藜麥醇溶蛋白具有開發(fā)為天然營養(yǎng)強(qiáng)化劑、乳化劑和抗氧化劑的潛力。然而,藜麥醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)和體內(nèi)抗氧化效果還需進(jìn)一步的研究。