殼聚糖-核桃多肽脂質(zhì)體的制備及表征

郝靜，涂心怡，曹詩諾，汪濤，王豐俊

(北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100083)

我國核桃(JuglansregiaL.)資源豐富，2018年核桃干果產(chǎn)量達(dá)382萬t[1]。榨油后的核桃粕中含有大量蛋白質(zhì)，可用于制備核桃多肽，減少核桃蛋白資源的浪費(fèi)，提高核桃粕的利用價(jià)值。核桃多肽具有多種生理活性，如抗氧化[2]、抗疲勞[3]、降血壓[4-5]等，但核桃多肽消化穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性較差。脂質(zhì)體主要是由卵磷脂制備的具有磷脂雙分子層的囊泡狀結(jié)構(gòu)載體，具有無毒性、生物相容性等優(yōu)良特性，脂質(zhì)體包封生理活性物質(zhì)的研究引起了諸多研究者的興趣[6-7]。將生理活性物質(zhì)如多肽類包封于脂質(zhì)體可以起到緩釋、提高其穩(wěn)定性和生物利用度的作用[8]，但常規(guī)脂質(zhì)體在貯存過程中易被氧化，而對(duì)其進(jìn)行表面修飾可以減少環(huán)境降解和磷脂雙層滲透，并能保護(hù)脂質(zhì)體系統(tǒng)中的負(fù)載物[9]。殼聚糖作為一種天然陽離子多糖，具有生物相容性，可用于修飾脂質(zhì)體，提高其穩(wěn)定性[10-12]。

本研究采用薄膜分散-水化法將核桃多肽包埋于脂質(zhì)體(peptide liposome，P-L)中，再利用殼聚糖對(duì)其進(jìn)行修飾，以提高其穩(wěn)定性。通過研究多肽與卵磷脂、膽固醇與卵磷脂、吐溫-80與卵磷脂的質(zhì)量比，以及殼聚糖濃度、超聲波處理時(shí)間對(duì)殼聚糖-脂質(zhì)體包封效果的影響，得到殼聚糖-核桃多肽脂質(zhì)體(peptide chitosan-coated liposome，P-CHL)制備的最佳工藝，并通過馬爾文粒度儀、透射電鏡對(duì)其進(jìn)行表征。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃多肽，實(shí)驗(yàn)室前期制備；NaOH、Na2CO3、酒石酸鉀、CuSO4·5H2O均為分析純，北京化工廠；CHCl3為分析純，北京藍(lán)弋科技有限公司；殼聚糖(脫乙酰度≥90%)、卵磷脂(90%)、膽固醇(95%)，上海源葉生物科技有限公司；吐溫-80(500 mL)，廣東光華科技股份有限公司。

核桃多肽的制備：由核桃脫脂粉經(jīng)非蛋白復(fù)合酶(纖維素酶、果膠酶和淀粉酶質(zhì)量比為5∶2∶3)于35 ℃酶解3 h，制得核桃粕破壁的懸浮液，再經(jīng)3 g/L堿性蛋白酶于50 ℃酶解3 h，90 ℃滅酶8 min后，離心取上清液，凍干即得核桃多肽，用凱氏定氮法測得樣品中的多肽含量為(52.36±0.34)%。

堿性銅試劑的配制：稱取Na2CO350 g，NaOH 10 g溶解于400 mL蒸餾水中，作為甲液；稱取CuSO40.25 g溶解于30 mL蒸餾水中，稱取酒石酸鈉0.5 g溶解于50 mL蒸餾水中，二者攪拌混勻，作為乙液。臨用前，甲乙混勻并定容至500 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

Millipore 15 mL/30 kDa超濾離心管，北京索萊寶科技有限公司；H/T16MM型臺(tái)式離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；HC-2518R型高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；R-210型旋蒸儀，步琦實(shí)驗(yàn)設(shè)備貿(mào)易(上海)有限公司；Biosafer 650-92型超聲細(xì)胞破碎儀，賽飛(中國)有限公司；H-7650型透射電鏡，日本HITACHI有限公司；ZC90型激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司。

1.3 包封率的測定

1.3.1 核桃多肽含量的測定

采用福林酚法。稱取標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白0.002 4 g，配成質(zhì)量濃度為0.24 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。取牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL，分別用蒸餾水補(bǔ)足至1.0 mL后，加入1.0 mL堿性銅試劑混勻，快速加入4.0 mL福林酚試劑混勻后于55 ℃水浴5 min，冷水浴5 min后于650 nm下測吸光值。以牛血清白蛋白的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取1.0 mL多肽溶液代替牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，其余步驟同以上操作，測得的吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到多肽樣品的濃度。

1.3.2 游離肽的分離

參照文獻(xiàn)[11]的方法稍作改動(dòng)。取樣品3.0 mL于截留分子質(zhì)量為30 kDa的超濾離心管，4 000 r/min離心30 min，記錄濾液體積V1。殼聚糖-空脂質(zhì)體操作同上述步驟，濾液(V0)作為空白。測得多肽質(zhì)量濃度分別記為ρ1、ρ2。

1.3.3 包封率的計(jì)算

取2.0 mL的曲拉通100(0.06%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))于1.0 mL樣品中，渦旋混勻，取混合液1.0 mL代替牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，后續(xù)步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線，總肽質(zhì)量濃度為ρ2，包封率按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.4 殼聚糖-核桃多肽脂質(zhì)體的制備

參照文獻(xiàn)[13]的方法稍作改動(dòng)。取一定量的大豆卵磷脂、膽固醇溶于10 mL CHCl3后，于55 ℃旋蒸30 min成膜，然后將旋蒸瓶置于通風(fēng)櫥干燥至無CHCl3后，加入10 mL pH 7.4、含有一定量核桃多肽和吐溫-80的PBS(0.01 mol/L)于相轉(zhuǎn)變溫度(60 ℃)振蕩混勻，水浴1 h，得到的粗脂質(zhì)體混懸液于4 ℃下超聲波處理，得到納米脂質(zhì)體。

取一定量的殼聚糖溶于體積分?jǐn)?shù)1%的乙酸溶液，磁力攪拌3 h，得到殼聚糖乙酸溶液。將殼聚糖乙酸溶液緩慢滴加到等量的脂質(zhì)體溶液中，邊滴加邊攪拌，之后磁力攪拌1 h，將上述混懸液于4 ℃過夜，得到殼聚糖-核桃多肽脂質(zhì)體，并于4 ℃保存。

其他因素不變，固定卵磷脂為0.09 g，超聲波功率500 W，分別探究多肽質(zhì)量濃度(2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL)、膽固醇與卵磷脂的質(zhì)量比(1∶4、1∶6、1∶9、1∶10)、吐溫-80與卵磷脂的質(zhì)量比(1∶9、2∶9、3∶9、4∶9)、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%)、超聲波處理時(shí)間(2、4、6、8、10 min)對(duì)殼聚糖修飾脂質(zhì)體包封效果的影響。

1.5 Zeta電位及粒徑分析

樣品的Zeta電位與粒徑采用動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering，DLS)技術(shù)測定。將樣品用pH 7.0的PBS(0.01 mmol/L)稀釋50倍作為樣液備用。設(shè)置激光粒度儀溫度為(25±0.1) ℃。測3組平行，結(jié)果取平均值。

1.6 微觀形貌

采用透射電鏡分析樣品微觀形貌。吸取等量樣品用磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染，隨后將負(fù)染后的樣品滴加到覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，自然晾干后上樣，在80 kV加速電壓下觀察。

1.7 數(shù)據(jù)分析及處理

所有實(shí)驗(yàn)至少平行測定3次，采用Excel 2010、SPSS Statistics 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用Duncan進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 多肽與卵磷脂的比例對(duì)殼聚糖修飾脂質(zhì)體的影響

多肽與卵磷脂的比例是影響包封率的重要因素，直接反映脂質(zhì)體的載藥能力[14]。如圖1所示，在一定范圍內(nèi)，隨著多肽濃度的增加，包封率增大。當(dāng)多肽質(zhì)量濃度超過4.0 mg/mL時(shí)，包封率出現(xiàn)下降趨勢，可能是由于脂質(zhì)體內(nèi)空間有限，對(duì)核桃多肽的包埋具有飽和性。故選擇多肽質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL，此時(shí)包封率最大為76.13%，Zeta電位為(+5.92±0.43)mV，具有較強(qiáng)的靜電斥力，能夠防止脂質(zhì)體的聚集或絮凝，粒徑(80.30±0.35)nm，多分散系數(shù)(polydispersity index，PDI)為0.25，呈現(xiàn)均勻的分散性。

圖1 多肽與卵磷脂的比例對(duì)殼聚糖修飾脂質(zhì)體的影響Fig.1 Effect of the ratio of peptide to lecithin on chitosan-coated liposomes

2.2 膽固醇與卵磷脂的比例對(duì)殼聚糖修飾脂質(zhì)體的影響

膽固醇可提高脂質(zhì)體膜的致密度和柔韌性[15]，常用作脂質(zhì)體的穩(wěn)定劑。不同濃度的膽固醇對(duì)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和載藥能力影響不同。在適宜濃度的膽固醇存在下，多肽可以更有效地嵌入脂質(zhì)體的磷脂雙分子層中，提高脂質(zhì)體包封率。較高水平的膽固醇會(huì)擾亂磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，還可能降低脂質(zhì)體電荷之間的靜電排斥[16]，使囊泡不能承載其內(nèi)核的所有肽，導(dǎo)致脂質(zhì)體聚集絮凝。

如圖2所示，隨著膽固醇添加量的增加，包封率先增大后減小。當(dāng)膽固醇與卵磷脂質(zhì)量比達(dá)到1∶9時(shí)，包封率達(dá)到最高值為75.25%，Zeta電位為(+5.70±0.28)mV，此時(shí)粒徑(80.30±0.35)nm，PDI為0.25±0.01，粒徑分布均勻，脂質(zhì)體溶液處于穩(wěn)定狀態(tài)。故選擇膽固醇與卵磷脂的質(zhì)量比為1∶9，制備脂質(zhì)體。

a-包封率；b-Zeta電位；c-粒徑、PDI圖2 膽固醇與卵磷脂的比例對(duì)殼聚糖修飾脂質(zhì)體的影響Fig.2 Effect of the ratio of cholesterol to lecithin on chitosan-coated liposomes

2.3 吐溫-80與卵磷脂的比例對(duì)殼聚糖修飾脂質(zhì)體的影響

吐溫-80是一種聚氧乙烯衍生物[17]，可通過物理吸附于脂雙層表面，聚氧乙烯基結(jié)合磷脂膽堿基團(tuán)，在脂質(zhì)體表面形成具有一定厚度的親水層，維持脂質(zhì)體內(nèi)核微環(huán)境穩(wěn)定[18]。

如圖3所示，隨著吐溫-80添加量的增加，脂質(zhì)體尺寸逐漸減小。當(dāng)吐溫-80與卵磷脂的質(zhì)量比超過2∶9時(shí)，包封率由74.1%逐漸下降，這可歸因于乳化劑添加過量導(dǎo)致乳化程度過大，脂質(zhì)體體積過小，脂質(zhì)體內(nèi)空間受限，不能對(duì)核桃多肽進(jìn)行有效地包埋。因此，選擇吐溫-80的添加量為2 mg/mL時(shí)制備脂質(zhì)體，此時(shí)電位為(+4.83±0.21)mV，粒徑(80.30±0.01)nm，PDI為0.25±0.01，呈現(xiàn)良好的分散性。

a-包封率；b-Zeta電位；c-粒徑、PDI圖3 吐溫-80與卵磷脂的比例對(duì)殼聚糖修飾脂質(zhì)體的影響Fig.3 Effect of the ratio of Tween-80 to lecithin on chitosan-coated liposomes

2.4 殼聚糖含量對(duì)殼聚糖修飾脂質(zhì)體的影響

適量的殼聚糖包覆在納米脂質(zhì)體表面，可提高納米脂質(zhì)體的物理穩(wěn)定性，抵抗機(jī)械應(yīng)力，降低負(fù)載物的釋放速率[11]。當(dāng)過量的殼聚糖存在時(shí)，脂質(zhì)體表面長鏈的殼聚糖片段之間相互作用而發(fā)生橋聯(lián)絮凝，導(dǎo)致多肽泄露；含量過低，殼聚糖不能對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行良好地包覆，導(dǎo)致脂質(zhì)體發(fā)生聚集，粒子與液體介質(zhì)間發(fā)生明顯的相分離[12]。殼聚糖還可以防止脂質(zhì)體在加工和儲(chǔ)存過程中被氧化[11]。

如圖4所示，當(dāng)殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過0.4%時(shí)，包封率降低，這可能與殼聚糖的電荷作用有關(guān)，過量的殼聚糖可能與多肽競爭脂質(zhì)體中相同的結(jié)合位點(diǎn)，從而取代多肽[19]。隨著殼聚糖含量的增加，殼聚糖-核桃多肽脂質(zhì)體的平均粒徑增大，這可能是由于殼聚糖含量較高，在脂質(zhì)體表面形成的殼聚糖層較厚。Zeta電位也與殼聚糖濃度呈正相關(guān)，隨殼聚糖層的增厚而增大。綜合考慮殼聚糖濃度對(duì)脂質(zhì)體的影響，選擇殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%，此時(shí)包封率最高為68.67%，電位(+6.05±0.31)mV，粒徑(80.30±0.35)nm，PDI為0.27±0.03，呈現(xiàn)均勻的分散性，溶液處于穩(wěn)定狀態(tài)。

a-包封率；b-Zeta電位；c-粒徑、PDI圖4 殼聚糖含量對(duì)脂質(zhì)體的影響Fig.4 Effect of the concentration of chitosan on liposomes

2.5 超聲波處理時(shí)間對(duì)殼聚糖修飾脂質(zhì)體的影響

未經(jīng)超聲波處理的脂質(zhì)體為乳白色乳狀液，粒徑較大，且粒度分布不均；處理后，粒徑減小，因而具有減少沉淀的傾向。如圖5所示，超聲波處理時(shí)間短，脂質(zhì)體數(shù)量多且分子質(zhì)量大，容易絮凝；處理時(shí)間長則會(huì)對(duì)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)造成損害，導(dǎo)致多肽不能全部包埋于脂質(zhì)體中。故選擇超聲波處理時(shí)間6 min，此時(shí)包封率最大為63.44%，粒徑(83.30±0.35)nm，PDI為0.25±0.01，粒度分布均勻，Zeta電位為(+5.67±0.21)mV。

a-包封率；b-Zeta電位；c-粒徑、PDI圖5 超聲波處理時(shí)間對(duì)殼聚糖修飾脂質(zhì)體的影響Fig.5 Effect of the ultrasonic time on chitosan-coated liposomes

通過單因素試驗(yàn)，以包封率為指標(biāo)，綜合考慮粒徑、PDI與Zeta電位，確定了制備殼聚糖修飾脂質(zhì)體的最佳工藝：m(多肽)∶m(膽固醇) ∶m(吐溫-80) ∶m(卵磷脂)=4∶1∶2∶9，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%，超聲波處理時(shí)間6 min。

2.6 脂質(zhì)體的表征

以最佳工藝參數(shù)制備的脂質(zhì)體的粒徑、Zeta電位及包封率的測定結(jié)果如表1所示。粒徑和PDI是衡量脂質(zhì)體體系穩(wěn)定性、均勻性[6]和生物利用度[20]的重要物理參數(shù)。PDI在0.4以下是粒徑分布均勻的標(biāo)志[21]。DLS結(jié)果表明，0.4%殼聚糖修飾后納米脂質(zhì)體的尺寸有所增加，粒徑由(70.67±0.17)nm增大至(80.30±0.35)nm，這可歸因于殼聚糖與磷脂雙分子層的相互作用。此外，多肽分解得到的一些疏水性氨基酸與脂質(zhì)體脂雙層的?；溞纬墒杷饔茫瑥亩鴮?dǎo)致脂質(zhì)體的柔韌性和粒徑增大，提高載藥能力[22]。脂質(zhì)體體系的PDI也由0.20增大至0.25，保持在0.4以下，可看作為一個(gè)單分散的均勻體系。PDI的增加受脂質(zhì)體中多肽的調(diào)控。多肽的電荷和各氨基酸殘基之間的相互作用對(duì)脂質(zhì)體的分散有一定的影響[16]。結(jié)果與RAMEZANZADE等[13]制備的虹鱒魚皮抗氧化肽脂質(zhì)體相似，添加0.4%殼聚糖修飾后，粒徑由(163.4±5.9)nm增大至(197.0±2.1)nm，PDI由(0.33±0.1)增大至(0.43±0.01)。

表1 P-L、P-CHL的包封率、粒徑、PDI、電位Table 1 Encapsulation efficiency, size, PDI, Zeta potential of P-L and P-CHL

Zeta電位是預(yù)測和控制脂質(zhì)體穩(wěn)定性的重要指標(biāo)[23]。殼聚糖修飾后，Zeta電位由(-6.17±0.34)mV增加到(+6.33±0.23)mV，這種電勢的轉(zhuǎn)變很可能是由于帶正電荷的殼聚糖氨基與帶負(fù)電荷的磷脂基團(tuán)表面之間的離子吸引，表明殼聚糖成功地包覆在核桃多肽脂質(zhì)體表面[24]。電勢的增大也可以增強(qiáng)脂質(zhì)體間的靜電斥力，防止聚集或絮凝。PANYA等[25]指出殼聚糖通過靜電作用沉積在納米脂質(zhì)體表面，增加電荷密度并形成有一定厚度的外部層，增強(qiáng)了系統(tǒng)的物理穩(wěn)定性，從而降低了脂質(zhì)體的聚結(jié)和聚集傾向。同時(shí)，殼聚糖修飾納米脂質(zhì)體的過程使親水性增強(qiáng)，正電荷和親水性都促進(jìn)了小腸上皮細(xì)胞的更好吸收[26]。

包封率揭示了生物活性化合物在脂質(zhì)體中的保留能力。殼聚糖對(duì)核桃多肽脂質(zhì)體的包封率有明顯影響，殼聚糖修飾后，P-L的包封率由(73.32±2.85)%增大至(76.13±2.85)%。很可能是殼聚糖包覆在脂質(zhì)體表面或插入磷脂雙分子層以填補(bǔ)空白，從而防止核桃多肽從脂質(zhì)體中泄露。另外，殼聚糖帶正電荷，多肽表面帶負(fù)電荷，可能是殼聚糖與游離多肽因電荷中和而結(jié)合[10]，減少了游離肽。LIU等[27]制備的牛血清白蛋白與脂雙層表面均帶負(fù)電荷，相同電荷間產(chǎn)生斥力，故制備的脂質(zhì)體包封率僅為34%左右。這也說明P-L較P-CHL包封率低的原因之一可能是核桃多肽與脂質(zhì)體均帶有負(fù)電荷，表現(xiàn)出一定的靜電斥力。

2.7 微觀形貌

如圖6-a所示，脂質(zhì)體呈囊泡狀[28]，表面光滑；0.4%殼聚糖修飾后(圖6-b)，脂質(zhì)體分布均勻，脂質(zhì)體的大小明顯大于P-L;如圖6-b、6-c所示，包載多肽前后沒有明顯差異。透射電鏡圖像證實(shí)了DLS結(jié)果。囊泡大小不一，并且存在小囊泡向大囊泡融合的趨勢。這是由于脂質(zhì)體存在Oswald熟化行為[29]，可使脂質(zhì)體更加穩(wěn)定。

a-P-L；b-殼聚糖-空脂質(zhì)體；c-P-CHL圖6 P-L、殼聚糖-空脂質(zhì)體與P-CHL的TEM(×200 000)圖Fig.6 The TEM(×200 000) images of samples P-L,CHL and P-CHL

3 結(jié)論

采用薄膜分散-水化法將核桃多肽包封于脂質(zhì)體中，再利用殼聚糖對(duì)其進(jìn)行修飾，通過單因素試驗(yàn)得到殼聚糖-核桃多肽脂質(zhì)體制備的最佳工藝參數(shù)：m(多肽)∶m(膽固醇) ∶m(吐溫-80) ∶m(卵磷脂)=4∶1∶2∶9，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%，超聲波處理時(shí)間6 min。此時(shí)，殼聚糖-核桃多肽脂質(zhì)體的包封效果最佳，包封率為(76.13±0.84)%，粒徑為(80.30±0.35)nm，PDI為(0.25±0.01)，電位為(+6.33±0.23)mV。透射電鏡結(jié)果表明，殼聚糖-核桃多肽脂質(zhì)體呈現(xiàn)囊泡狀結(jié)構(gòu)，具備包載和控制釋放的能力。

本研究成功地將核桃多肽包封于殼聚糖-脂質(zhì)體中，可作為食品功能因子和營養(yǎng)強(qiáng)化因子，提高了核桃多肽的利用范圍，為核桃粕深加工提供了一定的技術(shù)基礎(chǔ)。