衛(wèi)鈺成,楊敏敏,施琳,3,4*,劉天啟,嚴(yán)淘,張妍,梁伊帆,周蘭薺,鄒家樂,張華峰,,3
1(陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西 西安,710119)2(陜西師范大學(xué) 西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安,710119)3(陜西師范大學(xué) 中俄食品與健康科學(xué)國際聯(lián)合研究中心,陜西 西安,710119)4(陜西師范大學(xué) 西安市特色水果貯藏與保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安,710119)
國際頂級期刊《柳葉刀》調(diào)查顯示,我國有9 000萬肥胖人群,其中1 200萬屬于重度肥胖,嚴(yán)重威脅健康?,F(xiàn)代社會(huì)精細(xì)加工的高脂高糖飲食替代粗糧和粗加工食品是肥胖井噴式增長的主要誘因。高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖常伴有血脂血糖異常、肝臟脂質(zhì)堆積和氧化應(yīng)激,顯著增加2型糖尿病、心血管病以及多種癌癥的患病率和死亡率[1]。如何有效預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖及相關(guān)代謝紊亂問題是亟待解決的,關(guān)系民生的重要研究問題。
近年來,研究者針對多種食藥同源植物開展了大量研究,發(fā)現(xiàn)一些可以通過其抗氧化、抗炎特性來降低高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖及糖脂代謝紊亂等問題的天然資源[2]。黃精(Polygonatumsibiricum)被譽(yù)有“仙人余糧”、“救窮草”、“米脯”等美名,始載于《名醫(yī)別錄》,使用歷史已有2 000多年,在古代被視為“長生不老和延年益壽”的植物資源,言其“久服輕身延年不饑”[3],具有抗氧化、降血脂血糖、調(diào)節(jié)免疫等多種有益作用[4]。滇黃精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl, PK)是我國著名的“氣血雙補(bǔ)之王”,產(chǎn)量大,經(jīng)濟(jì)價(jià)值高,富含多糖和皂苷,市場發(fā)展前景廣闊。
古人在辟谷過程中通常服用黃精,但目前其健康養(yǎng)生功效機(jī)制未明。間歇性禁食是一種通過控制熱量攝入或限制膳食攝入時(shí)間的斷食模式,與辟谷理念不謀而合,可顯著改善高血壓[5]、糖尿病[6]、心血管疾病[7]和多種癌癥等多種疾病,有益機(jī)體代謝健康,延緩衰老。研究證實(shí)了間歇性禁食對高脂誘導(dǎo)肥胖及肝臟脂質(zhì)代謝異常[8-9],以及腸道菌群的有益調(diào)控作用[10-11]。飲食及其對腸道微生物群的影響與肥胖和代謝性疾病密切相關(guān)[12-13]。腸道微生物影響機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)的獲取、能量的調(diào)節(jié)以及脂肪的儲(chǔ)存、生成和氧化,直接或間接地參與肥胖的發(fā)生,對維持人體健康至關(guān)重要。盡管已有研究表明黃精的有益作用,但其對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和重要代謝器官/肝臟的損傷預(yù)防作用以及與腸道微生物關(guān)系鮮有報(bào)道,更缺乏對禁食期間服用黃精是否能夠協(xié)同增效的探討。
本研究首先采用植物廣靶代謝組學(xué)技術(shù)分析滇黃精水提物化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ),繼而預(yù)防性給小鼠灌胃滇黃精水提物,創(chuàng)新協(xié)同間歇性禁食飲食模式,研究其對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和肝臟損傷的改善作用以及對腸道菌群構(gòu)成的影響,構(gòu)建肥胖和肝臟損傷指標(biāo)與腸道微生物構(gòu)成改變的融合分析模型,篩選關(guān)鍵優(yōu)勢菌屬作為調(diào)控靶點(diǎn)。對科學(xué)認(rèn)知以黃精為代表的“食藥同源”天然資源及間歇性禁食預(yù)防肥胖及其相關(guān)代謝問題的有益健康作用和機(jī)制提供理論依據(jù)。
60只8周齡健康雄性C57BL/6 J小鼠,體重18~25 g,購自西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。
云南產(chǎn)滇黃精,瀾滄澎勃生物藥業(yè)有限公司;飼養(yǎng)小鼠的高脂飼料(D12492, Research Diets, Inc.蛋白23.25%、脂肪34.55%、碳水化合物27.20%)、普通飼料(蛋白18.8%、脂肪5.2%、碳水化合物61.0%),江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司;蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染液、油紅染液、蘇木素染液、分化液、返藍(lán)液、甘油明膠封片劑,Servicebio公司;4%多聚甲醛固定液、無水乙醇、異丙醇,均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所。
JJ-12 J脫水機(jī)、JB-P5包埋機(jī)、JB-L5凍臺(tái),武漢俊杰電子有限公司;RM2016病理切片機(jī),上海徠卡儀器有限公司;CRYOSTAR NX50冰凍切片機(jī),美國Thermo公司;1290 Infinity LC,超高效液相色譜系統(tǒng)、Bioanalyzer 2100,安捷倫科技(中國)有限公司產(chǎn)品;Qubitt@ 2.0熒光儀,賽默飛世爾科技生命科學(xué)產(chǎn)品公司產(chǎn)品;KD-P組織攤片機(jī),浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司;GFL-230烤箱,天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司;防脫載玻片,Servicebio公司;Nikon Eclipse E100正置光學(xué)顯微鏡、Nikon DS-U3成像系統(tǒng),日本尼康公司;586型血糖儀,魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司;MLX-208離心機(jī),Eppendorf公司。
1.4.1 小鼠分組及飼養(yǎng)
小鼠飼養(yǎng)在西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級鼠房[溫度(22±2) ℃,相對濕度60%],12 h明暗交替周期標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng),均自由飲用純凈水,且具有良好的通風(fēng)和衛(wèi)生條件。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案及操作均經(jīng)陜西師范大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2021-013)。
對所有小鼠先進(jìn)行1周的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室環(huán)境適應(yīng)性喂養(yǎng),隨后將60只小鼠隨機(jī)分為6組,3組以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),另外3組以高脂飼料喂養(yǎng)2周后進(jìn)行干預(yù),連續(xù)干預(yù)8周。分組包括:正常對照組(normal-how, NC)、正常飲食+滇黃精干預(yù)組(NC+PK)、正常飲食+滇黃精聯(lián)合間歇性禁食干預(yù)組(NC+PK+IF)、高脂對照組(HF)、高脂飲食+滇黃精干預(yù)組(HF+PK)、高脂飲食+滇黃精聯(lián)合間歇性禁食干預(yù)組(HF+PK+IF)。每日進(jìn)行灌胃干預(yù),其中NC組、HF組使用0.1 mL生理鹽水,其余組均使用0.1 mL風(fēng)干滇黃精水提液(如1.4.2所示)。此外,NC+PK+IF組及HF+PK+IF組采用隔日禁食法。期間保持小鼠生活環(huán)境干凈,并保證在非禁食期內(nèi)各框飼料充足。
1.4.2 滇黃精水提液制備
將5 g風(fēng)干滇黃精粉碎過篩,置于100 mL圓底燒瓶中,加入蒸餾水50 mL,浸泡1 h,回流水提3 h。水提液冷卻后進(jìn)行抽濾,濾液保存于凍存管中,置于-20 ℃冷凍備用。
1.4.3 滇黃精水提物多糖和總酚含量測定
配制0.1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。精密移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至10 mL容量瓶中,補(bǔ)加蒸餾水至1 mL,再加入5%苯酚溶液1 mL,搖勻,再迅速加入5 mL濃硫酸,搖勻,于室溫下靜置5 min后于沸水浴中加熱15 min,取出用自來水快速?zèng)_洗至冷卻。以蒸餾水1 mL同法制備空白對照組,在490 nm處測定吸光度。以質(zhì)量濃度(mg/L)和吸光度為橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程y=3.312 8x+0.064 2,R2=0.994 8,同法測定供試品中多糖含量。
參照國標(biāo)GB/T 8313—2018測定總酚含量。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度為1.760~7.040 μg/mL時(shí)線性關(guān)系良好,回歸方程為:y=0.258 7x+0.061 6,R2=0.996 6。
1.4.4 滇黃精水提物代謝輪廓分析
用超高效液相串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(ultra performance liquid phase tandem quadrupole time of flight mass spectrometry,UHPLC-Q-TOFMS)技術(shù),結(jié)合數(shù)據(jù)依賴采集方式對樣本進(jìn)行分析,獲得一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù),采用XCMS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取和代謝物鑒定。
取水提物凍干粉0.1 g溶于1 mL純水中,加入1 mLV(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=2∶2∶1溶液,渦旋60 s,低溫超聲30 min,重復(fù)2次,-20 ℃放置1 h沉淀蛋白,在14 000×g,4 ℃條件下離心20 min,取上清液分析。
具體儀器分析參數(shù)見表1。樣品采用1 290 Infinity LC,超高效液相色譜系統(tǒng)HILIC色譜柱進(jìn)行分離。梯度洗脫程序如下:0~0.5 min,95%B;0.5~7 min,B從95%線性變化至65%;7~8 min,B從65%線性變化至40%;8~9 min,B維持在40%;9~9.1 min,B從40%線性變化至95%;9.1~12 min,B維持在95%。分析時(shí)采用隨機(jī)順序進(jìn)行樣本的連續(xù)分析以避免儀器檢測信號波動(dòng)而造成的影響,并在檢測隊(duì)列中插入質(zhì)控樣品監(jiān)測和評價(jià)系統(tǒng)的穩(wěn)定性及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。
表1 代謝組學(xué)儀器分析參數(shù)Table 1 Instrument analysis parameters
分別采用電噴霧電離(ESI)正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行檢測。樣品經(jīng)超高效液相色譜儀分離后用Agilent 6550質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。樣本檢測完畢后,采用AB Triple TOF 6600質(zhì)譜儀對代謝物進(jìn)行鑒定,采集樣品的一級、二級譜圖。二級質(zhì)譜采用信息依賴獲取獲得,并且采用高靈敏度模式。IDA設(shè)置為排除4 Da之內(nèi)的同位素,每個(gè)周期監(jiān)測10個(gè)候選離子。為擴(kuò)大二級譜圖的采集率,數(shù)據(jù)采集按質(zhì)量范圍進(jìn)行分段,50~300,290~600,590~900,890~1 200,每個(gè)方法每段采集4個(gè)重復(fù)。分別使用自建MetDDA和LipDDA方法對采集獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定。
1.4.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣品采集
實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠每周固定時(shí)間記錄其體重、飲食和飲水量,干預(yù)后觀察小鼠精神活動(dòng)狀態(tài),每14 d固定時(shí)間測量1次空腹血糖、收集1次小鼠糞便。干預(yù)8周后進(jìn)行眼內(nèi)眥空腹采血,立即離心(4 ℃、4 000 r/min,離心15 min)分離血清,保存于-80 ℃冰箱中待測。取肝臟、小腸組織置于4%多聚甲醛組織固定液中進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。將采集保存的糞便送至上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測序和生物信息學(xué)分析。
1.4.6 腸道微生物16S rDNA測序
試驗(yàn)?zāi)o菌采集小鼠糞便,于-80 ℃保存。采集的樣品委托上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行糞便微生物16s rDNA測序。測序采用SDS法提取樣本的基因組DNA,根據(jù)樣品濃度,用無菌水將樣品稀釋至1 ng/μL,并在1%瓊脂糖凝膠上對其DNA純度和濃度進(jìn)行檢測。然后使用帶有條形碼的16S rRNA特定引物進(jìn)行擴(kuò)增,覆蓋16S V3~V4區(qū)域:341F(5′-ACTCCTACGGGRSGCAGCAG-3′)-806R(5′-GGACTACVV GGGTATCTAATC-3′)。PCR擴(kuò)增條件為 98 ℃初始變性1 min,30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(98 ℃變性10 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s),72 ℃最終延伸5 min,反應(yīng)在熱循環(huán)PCR系統(tǒng)中進(jìn)行。所有PCR產(chǎn)物均用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒純化以及使用QuantiFluorTM-S進(jìn)行定量。使用 NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit 建庫試劑盒構(gòu)建文庫,并通過Qubitt@ 2.0熒光儀和Bioanalyzer 2100進(jìn)行評估,純化和匯集擴(kuò)增子文庫在Illumina MiSeg平臺(tái)上配對測序(2x300)。使用 UCHIME 軟件去除嵌合體序列,抽平后運(yùn)用UPARSE 軟件RDP classifier 貝葉斯算法對97%相似水平的分類單元(operational taxonomic units,OTU)代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析,并在各個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。
1.4.7 口服葡萄糖耐量測定
參照KO等[14]的方法進(jìn)行口服葡萄糖耐量測定,即實(shí)驗(yàn)干預(yù)8周后,在小鼠禁食12 h后,口服葡萄糖(2 g/kg體重)。在葡萄糖負(fù)荷后0、30、60、90和120 min從小鼠尾部采集血樣,并使用血糖儀測量血糖水平。計(jì)算隨時(shí)間變化的曲線下面積(area under curve, AUC)。
1.4.8 血清生化指標(biāo)的測定
采用高效液相色譜法測定血清中總膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)含量。色譜條件及實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[15]。
1.4.9 肝臟功能指標(biāo)的測定
準(zhǔn)確稱取凍存的肝臟組織質(zhì)量,加入9倍體積的生理鹽水于冰水浴條件下勻漿機(jī)研磨,制成10%的肝臟勻漿,4 ℃、2 500 r/min離心10 min,取得的上清液再用生理鹽水稀釋成1%的肝臟勻漿。取上清液,嚴(yán)格按照試劑盒說明書分別測定SOD活力及MDA含量。
1.4.10 肝臟、小腸組織的HE染色
參考楊興鑫等[16]的方法,分別取新鮮小鼠肝臟組織放入裝有4%多聚甲醛的離心管中,充分固定24 h,用水沖洗后梯度乙醇脫水,二甲苯透明,進(jìn)行石蠟包埋后,切成4 μm厚的薄片,HE染色。
1.4.11 肝臟組織的油紅染色
參考文獻(xiàn)[17],分別取小鼠肝臟組織的一小部分新鮮組織放入裝有4%多聚甲醛的離心管中,新鮮冰凍切片充分固定后用自來水洗,切片入油紅染液浸染8~10 min,60%異丙醇分化,浸入蘇木素復(fù)染3~5 min,純水浸洗,分化液分化2~8 s,返藍(lán)液返藍(lán)1 s,自來水中浸洗,甘油明膠封片劑封片,顯微鏡鏡檢。
各組數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用R(V4.0.4)軟件進(jìn)行單因素方差分析,通過最小顯著性差異事后檢驗(yàn)比較樣本差異,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。對腸道菌群16S rRNA擴(kuò)增原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去冗余處理,以97%相似度劃分操作分類單元,并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行物種組成及多樣性分析。采用正則化典型相關(guān)分析方法分析高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠體重、葡萄糖耐受量、血脂和氧化應(yīng)激水平改善作用與腸道微生物改變之間的關(guān)聯(lián)(運(yùn)用R包“mixOmics”)。采用表達(dá)趨勢聚類分析方法分析層次聚類PK和PK+IF干預(yù)方式對高脂飲食改變腸道菌群構(gòu)成的不同變化趨勢(運(yùn)用R包“Mfuzz”)。
滇黃精水提物多糖含量為69.71%,總酚含量為5.4%?;贚C-MS技術(shù)的代謝組學(xué)方法對樣本進(jìn)行了代謝輪廓變化分析,得到的典型總離子流色譜圖(圖1-a)。正離子模式下檢測并鑒定出177種代謝物,負(fù)離子模式下鑒定出148種代謝物,主要包括糖類、酚類、脂肪酸類、氨基酸及其衍生物和有機(jī)酸類化合物。按照代謝物相對含量排序分別展示正負(fù)離子模式下含量較高的30種代謝物,結(jié)果如圖1-b和圖1-c所示。滇黃精水提物中富含半乳糖類非還原性功能性低聚糖,如棉子糖,水蘇糖和異麥芽糖,是腸道雙歧因子和多種益生菌的食物來源,有效促進(jìn)乳酸桿菌和雙歧桿菌增殖,抑制大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌等有害菌的生長繁殖,改善腸道微生態(tài)平衡[18]。水蘇糖通過調(diào)節(jié)腸道菌群改善腸道屏障完整性以及2型糖尿病糖代謝紊亂和肝臟炎癥水平,具有益生元功能[19]。
滇黃精水提物中還富含氨基酸,如γ-氨基丁酸、蘇氨酸、精氨酸、色氨酸、絲氨酸等。其中,γ-氨基丁酸在正離子檢測模式中相對含量最高。γ-氨基丁酸是谷氨酸代謝的重要產(chǎn)物,廣泛分布于如豆屬、參屬、中草藥等的種子和根莖中,具有改善炎癥、降血壓、提高免疫力、增加腦部蛋白分泌等多種生理功能[20],機(jī)體內(nèi)水平與宿主腸道內(nèi)擬桿菌屬豐度水平正相關(guān)。2009年我國批準(zhǔn)γ-氨基丁酸為新資源食品。最新研究發(fā)現(xiàn)γ-氨基丁酸可通過刺激脂肪干細(xì)胞抑制肥胖者皮下脂肪炎癥水平[21]。水提物中還富含具有多種生理功能且與腸道菌群關(guān)系密切的支鏈氨基酸[22]。盡管攝入的大部分蛋白質(zhì)在小腸中被消化和吸收,根
a-總離子流圖;b-正離子模式代謝物豐度;c-負(fù)離子模式代謝物豐度圖1 滇黃精水提物總離子流圖及正負(fù)離子模式檢測豐度含量較高的30種代謝物Fig.1 TIC of Polygonatum kingianum water extract and top 30 metabolites identified with ESI+ and ESI- mode, respectively.Ranking was based on their relative intensities
據(jù)攝入量高低會(huì)有大量蛋白質(zhì)和氨基酸(6~18 g/d)到達(dá)結(jié)腸部,并由一系列共生菌群降解。其中,色氨酸是人體必需氨基酸,其微生物代謝近年來受到廣泛關(guān)注。腸道菌群代謝色氨酸產(chǎn)生一系列吲哚類代謝產(chǎn)物,可作為細(xì)胞間信號分子和芳烴受體配體,具有改善腸道免疫和代謝紊亂, 預(yù)防慢性代謝疾病等多種有益健康生物活性功能[23-25]。此外,滇黃精水提物中甜菜堿含量較高。最新研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)充甜菜堿可以改善高脂飲食誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào),促進(jìn)艾克曼菌等具有益生活性的菌屬增值,促產(chǎn)乙酸和丁酸通過調(diào)節(jié)宿主miR-378a-YY1通路,改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和代謝綜合征[26]。綜上,滇黃精水提物富含具有調(diào)節(jié)腸道菌群功效的益生活性物質(zhì),是滇黃精改善代謝有益健康的功效物質(zhì)基礎(chǔ)。
如圖2-a所示,IF與PK+IF對高脂飲食小鼠具有明顯減重作用,且PK+IF更加顯著。高脂飲食組小鼠空腹血糖普遍高于正常組(圖2-c),但PK和PK+IF均未能顯著降低空腹血糖水平。HF+PK組OGTT實(shí)驗(yàn)曲線下面積顯著低于HF和HF+PK+IF組,表明PK與IF可顯著增強(qiáng)高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠葡萄糖耐受能力。
a-體重變化曲線;b-OGTT試驗(yàn)血糖變化曲線;c-干預(yù)后空腹血糖;d-OGTT試驗(yàn)曲線下面積圖2 小鼠體重、葡萄糖耐量、空腹血糖值及曲線下面積變化Fig.2 Weight change、blood glucose change assessed by OGTT test、fasting blood glucose value after intervention area under OGTT test curve注:不同小寫字母表示差異顯著(下同)
各組小鼠TC、TG、MDA及SOD水平如圖3所示。各組間血清TC含量無顯著性差異(圖3-a)。PK+IF與PK可降低高脂飲食帶來的高血脂水平。與對照組相比,HF飲食顯著升高肝臟MDA含量,說明體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生的自由基引起了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。盡管PK和PK+IF未能顯著降低HF引起的MDA升高(圖3-c),但顯著提升了肝臟中超氧歧化酶水平。
a-TC含量;b-TG含量;c-MDA含量;d-SOD含量圖3 不同組別小鼠血清中TC、TG含量;肝臟中MDA及SOD含量Fig.3 Differences in serum levels of TC and TG, as well as MDA and SOD in livers between groups
2.3.1 肝臟HE染色、油紅O染色結(jié)果
如圖4-a所示,NC組肝細(xì)胞排列有序,大小相似,有少許空泡化,匯管區(qū)無變性或病變;NC+PK組與NC+PK+IF組相較于NC組肝臟病理形態(tài)接近正常組,無明顯變化。HF組肝細(xì)胞變性,空泡化嚴(yán)重,肝細(xì)胞細(xì)胞核固縮變小且大量聚集,排列無序,有炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象;滇黃精水提物干預(yù)后,肝細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)明顯有所改善,但肝細(xì)胞大小不一,且仍有部分炎癥細(xì)胞浸潤;HF+PK+IF組肝細(xì)胞雖有部分炎癥細(xì)胞浸潤,但組織結(jié)構(gòu)清晰,并且排列有序,改善效果最佳。由圖4-b所示,NC 3組間脂滴未見明顯變化。HF組脂滴大量堆積,出現(xiàn)微泡脂肪變性現(xiàn)象,飲食干預(yù)和聯(lián)合干預(yù)后,脂滴均明顯縮小和減少。以上結(jié)果表明,滇黃精水提物干預(yù)與其聯(lián)合禁食干預(yù)對肝臟損傷具有修護(hù)作用,且滇黃精水提物聯(lián)合禁食干預(yù)效果更好。
a-肝臟組織HE染色;b-肝臟組織油紅O染色圖4 小鼠肝臟組織HE染色及油紅O染色結(jié)果Fig.4 HE staining and oil red O staining of liver tissues of mice
2.4.1 各組間腸道微生物多樣性及組成分析
腸道菌群是居住在腸道中的微生物,與機(jī)體健康息息相關(guān),不平衡的能量攝入如高脂肪攝入會(huì)導(dǎo)致腸道營養(yǎng)不良,從而引起胰島素抵抗、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝炎、肥胖和代謝紊亂等[27-28]。通過對糞便腸道菌群16S rRNA的V3~V4可變區(qū)進(jìn)行雙端測序,經(jīng)DADA2方法去燥質(zhì)控后,使用QIIME(version
1.8.0)軟件中的UCLUST對Clean reads進(jìn)行去嵌合體處理,再對去重復(fù)序列以97%的一致性將序列聚類成為OTUs,運(yùn)用數(shù)據(jù)庫Greengenes或SILVA對OTUs的代表序列進(jìn)行物種注釋,對所得OTUs進(jìn)行生境多樣性分析。結(jié)果表明,PK顯著升高腸道菌群α多樣性Shannon指數(shù)(圖5-a,P<0.05),表明PK增加高脂喂養(yǎng)小鼠糞便微生物豐富度。
高脂飲食顯著改變小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)(圖5)。在門水平上,與NC組相比,高脂飲食攝入增加小鼠腸道菌群中厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度,降低擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度,PK攝入顯著升高高脂小鼠擬桿菌門和變形菌門(Proteobacteria),降低厚壁菌門與擬桿菌門豐度比值。厚壁菌門和擬桿菌門占據(jù)了整個(gè)腸道菌群的80%~90%,厚壁菌門和擬桿菌門的比值是反映腸菌紊亂的重要參數(shù)[29-30]。前期研究發(fā)現(xiàn),與正常人群相比,肥胖患者腸道中厚壁菌門與擬桿菌門比值較高。在屬水平上,與對照組相比,高脂飲食顯著上調(diào)73個(gè)菌屬,包括梭狀芽胞桿菌
a-α多樣性;b-Firmicutes豐度;c-Bacteroidates豐度;d-HF vs NC 差異腸道微生物火山圖;e-典型相關(guān)分析熱圖圖5 腸道菌群多樣性,微生物相對豐度組間差異及其與生理指標(biāo)典型相關(guān)關(guān)系Fig.5 Alpha diversity of gut microbiota community, differences in relative abundance of microorganisms between groups and their relationships with high-fat diet induced changes in biochemistry indexes
屬(Clostridium_sensu_stricto_11, fold change=75.8),大腸桿菌志賀菌(Escherichia-Shigella, fold change=10.6),不動(dòng)桿菌(Acinetobacter, fold change=8.4)和胃瘤球菌屬(RuminococcaceaeUCG-004, fold change=5.4)等。已有研究發(fā)現(xiàn),這些菌屬與肥胖、炎癥水平、糖脂代謝異常以及肝臟脂質(zhì)異常積累和損傷正相關(guān)[29, 31];下調(diào)36個(gè)菌屬的相對豐度,包括常見益生菌雙歧桿菌屬(Bifidobacterium, fold change=0.01),與宿主體內(nèi)短鏈脂肪酸水平相關(guān)的擬普雷沃菌屬(Alloprevotella, fold change=0.04)和普雷沃菌屬(Prevotella, fold change=0.19)等[32-33]。
采用典型相關(guān)分析方法進(jìn)一步建立高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠體重、葡萄糖耐受量、血脂和氧化應(yīng)激水平改善作用,與腸道微生物之間的緊密關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示,高脂飲食誘導(dǎo)的體重、TG、TC上調(diào)和SOD下調(diào),與Escherichia-shigella、Acinetobacter、Clostridium_sensu_stricto_11、杜氏乳桿菌(Dubosiella)和Lachnoclostridium相對豐度的升高;Alloprevotella、Bifidobacterium、Ileibacterium、毛螺旋菌屬(Parasutterella)、鹽單胞菌屬(Halomonas)和副擬桿菌屬(Parabacteroides)的降低有關(guān)。這些結(jié)果進(jìn)一步說明了滇黃精水提物聯(lián)合間歇性禁食對高脂飲食引起的小鼠肥胖、糖脂代謝異常以及肝臟組織形態(tài)和功能的改善作用或可通過調(diào)控腸道菌群結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)。
采用模糊c均值聚類分析高脂喂養(yǎng)的3組小鼠糞便腸道菌屬相對豐度,可得到3種不同趨勢(圖6)。
a-Cluster 1;b-Cluster 2;c-Cluster 3;d-g_Alloprevotella;e-g_Bifidobacterium;f-g_Ileibacterium;g-g_Parabacteroides;h-OTU_2;i-g_Acinetobacter;j-g _Clostridium.seneu.stricto.1;k-g_Dubosiella;l-g_Escherichia.Shigella;m-OTU_18;n-g_Butyricimonas;o-g_Desulfovibrio;p-OTU_51圖6 高脂喂養(yǎng)小鼠腸道菌群豐度表達(dá)趨勢聚類分析及屬水平組間差異柱狀圖Fig.6 Clusters of gut microbiota compositions derived from the fuzzy c-means algorithm and histogram of differences between groups at the genus level
聚類1(cluster 1)包括相比于NC組,被HF顯著降低豐度,卻被PK+IF干預(yù)顯著升高的菌屬,例如Alloprevotella,Bifidobacterium,Ileibacterium和Parabacteroides。有趣的是,新近研究發(fā)現(xiàn)間歇性禁食模式顯著改變小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu),促進(jìn)了腸內(nèi)有益菌(如Alloprevotella,Bifidobacterium,和Parabacteroides)以及多種菌群代謝產(chǎn)物的生成,有效改善2型糖尿病小鼠的認(rèn)知功能和糖脂代謝紊亂,首次揭示了腸道菌群及代謝產(chǎn)物在間歇性禁食模式改善糖尿病及認(rèn)知損傷中的重要參與機(jī)制[34]。不僅如此,已有研究發(fā)現(xiàn)Alloprevotella相對豐度與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)顯著負(fù)相關(guān),在高心血管風(fēng)險(xiǎn)的患者體內(nèi)基本不存在。大量研究表明Bifidobacterium和Parabacteroides對機(jī)體和腸道微生態(tài)具有有益作用。Bifidobacterium菌屬的細(xì)菌是人和動(dòng)物腸道菌群的重要組成成員之一,許多雙歧桿菌的菌株,如青春雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌等可以作為益生菌用在食品和醫(yī)藥中,在改善代謝、減重、降脂降糖等方面有積極作用[35]。Parabacteroides等菌屬豐度增加可提高結(jié)腸C18-3OH濃度從而產(chǎn)生抗炎功效[36]。相反,聚類2(cluster 2)包括相比于NC組,豐度被HF顯著升高,卻被PK和PK+IF干預(yù)顯著降低的菌屬,例如Acinetobacter,Clostridium_sensu_stricto_11,Dubosiella和Escherichia-shigella。文獻(xiàn)研究表明,Acinetobacter菌屬豐度在多發(fā)性硬化患者中顯著增加,引發(fā)促炎癥反應(yīng)[37]。最新發(fā)表在Science Translational Medicine上的研究發(fā)現(xiàn)脂肪肝患者糞便中Clostridium_sensu_stricto_11菌屬水平顯著高于健康人群,采用甘氨酸干預(yù)可通過影響腸道微生物組成(包括顯著降低Clostridium_sensu_stricto_11水平),調(diào)節(jié)脂肪酸氧化和谷胱甘肽合成,繼而改善非酒精脂肪肝[38]。HUART等[39]在探究糞便短鏈脂肪酸水平與血壓關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn),未接受降壓藥治療的33名受試者中,Clostridium_sensu_stricto_11菌屬與血壓成正相關(guān)。Escherichia-Shigella在二型糖尿病患者體內(nèi)豐度增加[40],也是慢性腹瀉的主要致病菌之一。聚類3(cluster 3)包括相比于NC組,被HF顯著降低豐度,卻僅被PK干預(yù)顯著升高的菌屬,例如腸道內(nèi)參與丁酸產(chǎn)生的丁酸弧菌屬(Butyricimonas)。表達(dá)趨勢聚類分析結(jié)果表明,PK聯(lián)合IF對有益菌增值和有害菌抑制有協(xié)同功效。此外,PK對腸道菌屬的影響也可獨(dú)立于間歇性禁食。
本實(shí)驗(yàn)采用代謝組學(xué)技術(shù)分析滇黃精水提物化學(xué)成分,首次報(bào)道滇黃精水提物創(chuàng)新協(xié)同間歇性禁食模式通過改變腸道菌群構(gòu)成改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和肝臟損傷健康作用。結(jié)果顯示,滇黃精水提物(PK)富含棉子糖、水蘇糖、異麥芽糖等功能性低聚糖,γ-氨基丁酸、精氨酸、色氨酸等氨基酸類,以及甜菜堿等具有調(diào)節(jié)腸道菌群功效的益生活性物質(zhì),是滇黃精改善代謝有益健康的功效物質(zhì)基礎(chǔ)。PK可預(yù)防高脂誘導(dǎo)小鼠肥胖,顯著改善葡萄糖耐受力和肝臟中超氧化物歧化酶活力,降低血清甘油三酯,有效緩解由高脂誘發(fā)肝臟細(xì)胞變性和脂質(zhì)積累異常。此外,PK攝入顯著增加了高脂喂養(yǎng)小鼠腸道中的擬桿菌門,降低厚壁菌門與擬桿菌門豐度比值,同時(shí)降低梭狀芽胞桿菌屬,大腸桿菌志賀菌,不動(dòng)桿菌和胃瘤球菌屬等與肥胖、肝臟脂質(zhì)異常積累和損傷相關(guān)的菌屬;相反,升高促產(chǎn)短鏈脂肪酸的擬普雷沃菌屬、普雷沃菌屬、丁酸弧菌屬,以及雙歧桿菌,使腸道菌群結(jié)構(gòu)向益生菌增殖的方向改變。不僅如此,PK和PK+IF對高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠體重、葡萄糖耐受量、血脂和氧化應(yīng)激水平具有改善作用,與其對腸道菌群的調(diào)節(jié)緊密關(guān)聯(lián)。綜上,滇黃精水提物富含多種益生營養(yǎng)物質(zhì),聯(lián)合間歇性禁食可有效預(yù)防和改善高脂飲食引起的小鼠肥胖、糖脂代謝異常以及肝臟組織形態(tài)和功能,而這種改善效果與黃精和禁食模式對腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)控作用密切關(guān)聯(lián)。研究揭示了滇黃精水提物的食用價(jià)值,為科學(xué)認(rèn)知“辟谷養(yǎng)生”和以黃精為代表的“食藥同源”天然資源預(yù)防肥胖及其相關(guān)代謝問題的有益健康作用提供科學(xué)參考。