降解草酸鹽益生菌的篩選及其體內(nèi)功效評價

紀(jì)媛媛，馬欣瑩，步雨珊，劉奧，劉同杰，公丕民，張?zhí)m威，易華西

(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島，266000)

腎結(jié)石是晶體物質(zhì)在腎臟異常聚集所引發(fā)的疾病[1]，在人群中發(fā)病率較高，可達(dá)到12%[2]，為泌尿系統(tǒng)的第三大疾病[3]。目前最常用的腎結(jié)石治療方法為手術(shù)療法，具有見效快、周期短的優(yōu)點，但極易復(fù)發(fā)，副作用嚴(yán)重，5～10年內(nèi)，患者復(fù)發(fā)率可達(dá)50%，20年內(nèi)的復(fù)發(fā)率甚至可達(dá)75%[2]。此外，藥物治療也是比較常用的方法，但治療周期長、見效較慢。因此，需要尋找一種更為有效的預(yù)防和控制腎結(jié)石的療法。

90%的結(jié)石晶體含有鈣，其中以草酸鈣結(jié)石最為常見[4]，因此高草酸尿癥也就成為引發(fā)腎結(jié)石的第一危險因子[5]。這些進(jìn)入尿液的草酸絕大部分來自外源攝入，小部分來自肝臟內(nèi)源合成[6]。人體自身無法消化分解草酸鹽，所以外源攝入的草酸在腸道內(nèi)被吸收，隨血液循環(huán)進(jìn)入尿液。過量的草酸在尿液蓄積，就會引發(fā)高草酸尿癥，并伴有草酸鈣晶體形成[7]。如果能夠通過某種手段控制腎臟及尿液中草酸的濃度，減少草酸在腎臟中的蓄積，便可以起到預(yù)防腎結(jié)石形成的作用。

前期研究發(fā)現(xiàn)，某些分離自發(fā)酵乳制品、糞便中的乳酸菌具有一定的降解草酸鹽活性[8-10]；進(jìn)一步動物實驗表明，乳桿菌、雙歧桿菌菌株灌胃后鼠尿草酸含量顯著降低[11-13]。任志華[14]研究發(fā)現(xiàn)1株乳酸乳球菌可以降低犬尿鈣和尿草酸的分泌，說明具有降解草酸活性的乳酸菌在動物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。與手術(shù)和藥物治療相比，利用乳酸菌等微生態(tài)制劑降解草酸鹽來預(yù)防腎結(jié)石具有獨特的優(yōu)勢，目前國內(nèi)外對該方面的研究報道不多。本研究旨在篩選具有高效降解草酸活性的菌株，進(jìn)一步評估其在小鼠體內(nèi)的作用功效，探究其基于降解草酸預(yù)防腎結(jié)石的潛力，為利用益生菌預(yù)防或緩解腎結(jié)石提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

36株乳酸菌：分離自人體腸道及乳制品，保存于中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院功能性乳制品與益生菌工程研究室。對照菌株加氏乳桿菌ATCC 33323，中國普通微生物菌種保藏中心。

1.1.2 實驗動物及飼料

6周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠，山東濟南朋悅實驗動物繁育有限公司；動物飼料，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要試劑

MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、NaCl、草酸、草酸鈉，青島海博生物技術(shù)有限公司；TiCl3，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；PBS緩沖液、草酸試劑盒，北京索萊寶試劑有限公司；肌酸酐(serum creatinine，SCr)試劑盒、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)試劑盒、檸檬酸ELISA試劑盒、鎂離子試劑盒，上海泛音生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutas，SOD)試劑盒、過氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、鈣離子試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1D潔凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；TG20KR-D高速冷凍離心機，長沙東旺實驗儀器有限公司；LDZX-75KBS全自動滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SpectraMax190多功能酶標(biāo)儀，上海美谷分子儀器有限公司；高溫低速組織研磨儀，武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 降解草酸鹽益生菌的篩選

乳酸菌按照2%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃?zhèn)鞔罨?～3次，活化好的菌液按5%的接種量接種至含有5 mmol/ L草酸鈉的MRS培養(yǎng)液(MRS-Ox培養(yǎng)液)中，37 ℃培養(yǎng)5 d，以不接菌的MRS-Ox培養(yǎng)液作為對照組。采用草酸-TiCl3反應(yīng)法測定培養(yǎng)基中的草酸濃度[15]：取10 mL培養(yǎng)5 d后的MRS-Ox培養(yǎng)液，8 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL，再加入1 mL 0.5 mol/L CaCl2溶液靜置沉淀，12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，烘干離心管中的水分。加入5 mL 0.2 mol/L HCl溶液振蕩混勻，溶解沉淀。再加入新配制的0.25 mL 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))TiCl3溶液，振蕩混勻，測定405 nm波長下的吸光度。根據(jù)草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算草酸濃度，根據(jù)公式(1)計算草酸降解率：

(1)

式中：c空白和c接菌分別為空白組和接菌組培養(yǎng)后草酸濃度。

目的菌株培養(yǎng)期間草酸濃度變化的測定：篩選到的菌株傳代活化3次，接入含有5 mmol/ L草酸鈉的MRS培養(yǎng)基，每隔6 h測定培養(yǎng)基中剩余草酸濃度，測定方法同上述草酸-TiCl3反應(yīng)法[14]，根據(jù)測定結(jié)果做出草酸濃度隨時間變化規(guī)律曲線。

1.3.2 小鼠預(yù)灌胃造模實驗及28 d急性毒性實驗

小鼠預(yù)灌胃實驗：28只小鼠分成4組，每組7只，其中，對照組、模型組每天灌胃10 mL/kg PBS緩沖液，低劑量組每天灌胃10 mL/kg低濃度(5×107CFU/mL)菌液；高劑量組每天灌胃10 mL/kg 高濃度(5×109CFU/mL)菌液，預(yù)灌胃周期為14 d。

小鼠造模實驗：預(yù)灌胃結(jié)束后，對照組每天灌胃兩次10 mL/kg PBS緩沖液；模型組每天灌胃上午9時灌胃10 mL/kg PBS緩沖液，下午3時灌胃10 mL/kg 3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)草酸鈉溶液；低劑量組每天上午9時灌胃3%草酸鈉溶液，下午3時灌胃10 mL/kg 低濃度(5×107CFU/mL)菌液；高劑量組每天上午9時灌胃3%草酸鈉溶液，下午3時灌胃10 mL/kg 高濃度(5×109CFU/mL)菌液，周期為28 d。

28 d急性毒性實驗：14只小鼠分為2組，對照組每天灌胃10 mL/kg PBS緩沖液，灌菌組每天灌胃10 mL/kg，5×107CFU/mL菌液，每天記錄小鼠體重，處死后稱取小鼠腎臟、肝臟質(zhì)量，計算臟器指數(shù)。

1.3.3 小鼠尿草酸含量的測定

收集各組小鼠的尿液，按照試劑盒說明書的方法檢測尿液草酸濃度。

1.3.4 小鼠尿液Mg2+、Ca2+、檸檬酸濃度的測定

收集各組小鼠的尿液，按照試劑盒說明書的方法檢測尿Mg2+、Ca2+、檸檬酸濃度。

1.3.5 小鼠腎臟SOD活性、CAT活性及MDA水平的測定

小鼠處死后取腎臟，按1∶9(g∶mL)的比例加入生理鹽水，冰水浴條件下，制成10%的組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明測定SOD、CAT活性、MDA水平。

1.3.6 小鼠血液肌酸酐、尿素氮濃度的測定

小鼠眼球取血，4 ℃條件下，4 000 r/min離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書測定肌酸酐、尿素氮的濃度。

1.3.7 小鼠腎臟組織病理學(xué)檢查

小鼠處死后取腎臟，置于10%多聚甲醛固定液中固定組織48 h以上，進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色法和Von Kossa染色，觀察小鼠腎臟中晶體聚集情況、腎臟病理學(xué)變化。

1.3.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 26.0進(jìn)行顯著性差異分析(P<0.05)，不同字母表示具有顯著性差異，采用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解草酸鹽益生菌的篩選

以草酸降解率為指標(biāo)，評估了36株乳酸菌降解草酸的能力，結(jié)果如表1所示。不同菌株降解草酸的能力存在明顯差異，乳桿菌1F-6的草酸降解率為83.6%，顯著高于對照菌株加氏乳桿菌(43.9%)，菌株Q7、MN11、YZX21、FN3的降解率均在10%～15%，其余31株菌的草酸降解率均在10%以下。鑒定結(jié)果表明，乳桿菌1F-6為Lactobacillusvaginals。

表1 乳酸菌在培養(yǎng)基中的草酸降解率Table 1 Oxalate degrading ability of LAB strains in culture medium

進(jìn)一步探究了乳桿菌1F-6的草酸降解率隨時間的變化規(guī)律，結(jié)果如圖1所示。自2.5 d起，培養(yǎng)基內(nèi)的草酸濃度開始急劇下降，到第5.5天，草酸基本被完全降解，這與KULLIN等[16]報道的Lactobacillusreuteri100-23C從培養(yǎng)初始就降解草酸的變化規(guī)律不同，表明不同菌株降解草酸的機制存在差異。乳桿菌1F-6降解草酸可能是其維持生命活動的補救代謝途徑。當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖等碳源消耗完畢，乳桿菌1F-6開始利用草酸作為碳源，從而達(dá)到降解草酸的目的。以乳桿菌1F-6為候選菌株，開展下一步動物實驗研究。

圖1 1F-6培養(yǎng)過程中草酸濃度的變化Fig.1 Change of oxalic acid concentration during 1F-6 culture

2.2 L.vaginals 1F-6的急性毒性評價

利用小鼠動物模型對乳桿菌1F-6的毒性進(jìn)行了評價。結(jié)果表明，灌胃期間小鼠活動情況、毛色、精神狀態(tài)正常，飲水量和攝食量無異常。體重是判定小鼠是否健康的重要指標(biāo)[17]，體重變化如圖2-a所示。灌胃期間對照組和實驗組小鼠體重均正常增長，無顯著性差異；小鼠肝臟、腎臟等器官也無異常，肝臟、腎臟指數(shù)對照與實驗組沒有顯著性差異(圖2-b)。上述結(jié)果表明L.vaginals1F-6對小鼠無急性毒性作用。

a-體重;b-臟器指數(shù)圖2 灌胃L.vaginals 1F-6對小鼠體重及臟器指數(shù)的影響Fig.2 The effects of L.vaginals 1F-6 on body weight and organ index of the mice

2.3 L.vaginals 1F-6降草酸活性體內(nèi)驗證

2.3.1L.vaginals1F-6對小鼠尿草酸含量的影響

利用動物模型對乳桿菌1F-6的降草酸活性進(jìn)行了評價研究，結(jié)果如表2所示。在整個灌胃期間，對照組小鼠的尿草酸含量基本保持穩(wěn)定，自第21天起，模型組、低劑量組、高劑量組中的尿草酸含量開始顯著高于對照組(P<0.05)，說明造模成功，且模型組的尿草酸含量增長更快；從28天開始，高劑量組尿草酸含量開始回落，模型組的尿草酸含量顯著高于對照組(P<0.05)，低劑量組、高劑量組尿草酸含量均顯著低于模型組(P<0.05)。由上述結(jié)果可知，L.vaginals1F-6可有效降低小鼠尿草酸水平，從而預(yù)防因攝入過量草酸而引起的高草酸尿癥。

表2 實驗期間小鼠尿草酸含量的變化Table 2 Change of urine oxalate concentration in mice during the experiment

2.3.2L.vaginals1F-6對小鼠尿液Ca2+、Mg2+、檸檬酸水平的影響

尿液中草酸濃度的變化，會破壞離子平衡，進(jìn)一步引起尿液中其他離子的濃度變化。對乳桿菌1F-6對小鼠尿液中Ca2+、Mg2+和檸檬酸水平的影響進(jìn)行研究，結(jié)果如圖3所示。模型組Ca2+、檸檬酸水平顯著低于對照組(P<0.05)；與模型組相比，L.vaginals1F-6各劑量組的Ca2+、檸檬酸水平顯著升高(P<0.05)，各組Mg2+濃度無顯著性差異。L.vaginals1F-6干預(yù)小鼠后，小鼠尿液中的Ca2+、檸檬酸濃度有所回升，且高劑量組和對照組沒有顯著性差異。這可能是由于L.vaginals1F-6降解了進(jìn)入腸道的草酸，使得尿液排泄出的草酸濃度減小，尿液草酸濃度的降低又進(jìn)一步影響了尿液中其他離子間的平衡。檸檬酸濃度升高，可與Ca2+結(jié)合形成可溶性鹽，從而抑制草酸鈣結(jié)石晶體形成[18]。上述結(jié)果表明L.vaginals1F-6有助于調(diào)控修復(fù)草酸引起的尿液離子濃度紊亂。

a-Ca2+濃度;b-Mg2+濃度;c-檸檬酸濃度圖3 L.vaginals 1F-6對小鼠尿液Ca2+、Mg2+、檸檬酸水平的影響Fig.3 Effects of L.vaginals 1F-6 on urine calcium, magnesium, citric acid concentrations in mice

2.3.3L.vaginals1F-6對小鼠血清尿素氮、肌酸酐濃度的影響

草酸是二元羧酸，屬于強氧化物，具有氧化毒性[17]，過量的草酸極易引發(fā)腎臟損傷,影響腎小球的濾過功能，當(dāng)腎臟嚴(yán)重受損時，肌酸酐、尿素氮的濃度也會發(fā)生相應(yīng)的變化[19]，因此肌酸酐、尿素氮是反映小鼠腎功能的重要指標(biāo)[20]。研究L.vaginals1F-6對小鼠血清尿素氮、肌酸酐濃度的影響，結(jié)果如表3所示。與對照組相比，模型組小鼠血清中尿素氮、肌酸酐含量顯著升高(P<0.05)，說明草酸的連續(xù)干預(yù)使得小鼠的腎臟濾過功能受到嚴(yán)重?fù)p傷；與模型組相比，L.vaginals1F-6低劑量組、高劑量組小鼠尿素氮、肌酸酐水平顯著降低(P<0.05)。L.vaginals1F-6可顯著降低小鼠血清中的肌酸酐、尿素氮濃度，小鼠腎臟的濾過功能得到了有效改善，這與GOMATHI等[21]的實驗結(jié)果一致。

表3 L.vaginals 1F-6對小鼠血清尿素氮、肌酸酐濃度的影響Table 3 Effects of L.vaginals 1F-6 on blood urea nitrogen, creatinine concentrations in mice

2.3.4L.vaginals1F-6對小鼠腎組織MDA水平及SOD、CAT活性的影響

MDA濃度，SOD、CAT活性是衡量組織氧化損傷情況的指標(biāo)[20]。對L.vaginals1F-6對小鼠腎組織MDA水平及SOD、CAT活性的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果如圖4所示。

a-MDA含量;b-SOD活性;c-CAT活性圖4 L.vaginals 1F-6對小鼠腎組織MDA水平及SOD、CAT活性的影響Fig.4 Effects of L.vaginals 1F-6 on renal MDA level and SOD, CAT activities in mice

與對照組相比，模型組SOD、CAT活性顯著降低(P<0.05)、MDA濃度顯著升高(P<0.05)，表明高濃度草酸的攝入使得小鼠腎組織受到嚴(yán)重的氧化損傷；與模型組相比，L.vaginals1F-6各劑量組的SOD、CAT活性均顯著增加(P<0.05)，且高劑量組SOD、CAT活性與對照組無顯著性差異(P>0.05)，各劑量組MDA濃度相比于模型組也得到顯著降低(P<0.05)。L.vaginals1F-6通過降低進(jìn)入腎臟中的草酸濃度，減弱了草酸對腎臟的氧化損傷作用，并使小鼠腎臟功能恢復(fù)到原有水平，表明L.vaginals1F-6可有效緩解由草酸過量積累導(dǎo)致的腎功能氧化損傷。

2.3.5L.vaginals1F-6對小鼠腎臟組織形態(tài)的影響

利用HE染色法研究了L.vaginals1F-6對小鼠腎臟組織形態(tài)的影響，結(jié)果如圖5-a所示。對照組小鼠腎臟未觀察到草酸鈣沉積、腎小管擴張的現(xiàn)象；模型組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)紊亂，管腔擴張嚴(yán)重，管腔內(nèi)可明顯觀察到草酸鈣晶體的聚集；相比于模型組，L.vaginals1F-6低、高劑量組的腎臟損傷有所緩解，低劑量組晶體沉積明顯減少，高劑量組在視野內(nèi)幾乎無草酸鈣晶體出現(xiàn)。

a-HE,400×;b-Von Kossa，200×圖5 不同染色法各組小鼠腎臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果Fig.5 Renal histopathological examination of mice in different groups under different stainings

Von Kossa染色法是對鈣結(jié)晶的特異性染色[22]，可以更直觀地觀察到腎組織中草酸鈣的聚集情況。Von Kossa染色結(jié)果如圖5-b所示，對照組未觀察到鈣結(jié)晶的形成，模型組、低劑量組、高劑量組均可觀察到腎小管管腔中的黑色染色結(jié)晶，且模型組結(jié)晶數(shù)量明顯高于L.vaginals各劑量組，高劑量組效果最好，僅有少量草酸鈣結(jié)晶分布于管腔。上述結(jié)果表明，L.vaginals1F-6可有效緩解由草酸過量積累導(dǎo)致的腎組織損傷。

3 結(jié)論

隨著中國經(jīng)濟的發(fā)展，人們膳食結(jié)構(gòu)的改變，動物蛋白和脂肪攝入量的增多，我國高草酸尿癥的發(fā)病率逐漸增加。草酸的過飽和是高草酸尿癥乃至腎結(jié)石等形成的重要因素。目前針對高草酸尿癥的治療主要為利尿劑、鎂劑等方法，但改善作用均為暫時性緩解，不能有效防止或預(yù)防高草酸尿癥的形成。膳食補充劑干預(yù)是最簡單有效的措施。本研究以草酸降解率為指標(biāo)，篩選出1株草酸降解率為83.6%的乳桿菌L.vaginals1F-6，其草酸降解率顯著高于現(xiàn)有報道，利用高草酸尿癥小鼠模型進(jìn)一步系統(tǒng)評估了L.vaginals1F-6體內(nèi)降解草酸的作用功效，L.vaginals1F-6可顯著降低小鼠尿草酸含量、減少小鼠腎臟內(nèi)的草酸鈣晶體積累，調(diào)控草酸引起的尿液離子濃度失衡，緩解草酸濃度導(dǎo)致的腎氧化等功能損傷，表明L.vaginals1F-6可以在腸道內(nèi)定植，對攝入小鼠體內(nèi)的草酸起到了降解作用，從而使進(jìn)入尿液和腎臟的草酸有所減少，減少腎臟草酸鈣晶體聚集，有效緩解小鼠腎功能損傷，起到保護腎臟的作用。