一種新型檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7的免疫磁珠-量子點(diǎn)納米顆粒的制備和應(yīng)用

文湘郡，滕鑫，丁星宇，佘竹欣，李壹，熊曉輝

(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京，211800)

食品安全在全世界引起了越來(lái)越多的關(guān)注[1]。食源性疾病大多由食用了被15種致病菌污染的食物引起的[2]。其中，EscherichiacoliO157∶H7是一種主要的食源性致病菌，常導(dǎo)致溶血性尿毒癥綜合征、血性腹瀉等嚴(yán)重疾病，甚至導(dǎo)致死亡[3]，特別是在不發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)[4]。感染極低劑量的活E.coliO157∶H7即可引起疾病并進(jìn)一步引發(fā)疫情[5-7]，對(duì)其快速、靈敏的檢測(cè)方法有助于臨床管理和預(yù)防傳播。

現(xiàn)已發(fā)展了多種檢測(cè)E.coliO157∶H7的方法，經(jīng)典標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法是瓊脂平板培養(yǎng)法[8-9]，該法簡(jiǎn)單可靠，但耗時(shí)長(zhǎng)，可能延誤患者治療的時(shí)機(jī)和疫情的控制[10]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)因時(shí)間短、靈敏度高而被國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)推薦，但往往需要訓(xùn)練有素的技術(shù)人員和復(fù)雜的DNA提取程序[11]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)具有快速檢測(cè)和高通量的特點(diǎn)，但缺乏足夠的靈敏度，檢測(cè)限為104CFU/mL[11-12]。電化學(xué)發(fā)光和表面等離子體共振也被用于病原體檢測(cè)[13-14]。YU等[15]提出了一種檢測(cè)E.coliO157∶H7的石英晶體微天平傳感器，在50 min內(nèi)可檢測(cè)到低至1.46×103CFU/mL的E.coliO157∶H7，靈敏度高，但整個(gè)過(guò)程步驟繁多。上述方法均難以滿足E.coliO157∶H7現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求。因此，開發(fā)一種簡(jiǎn)單、靈敏、快速的細(xì)菌檢測(cè)方法對(duì)保證食品安全有著至關(guān)重要的作用。

量子點(diǎn)又稱納米晶體，是粒子尺寸小于或接近激子玻爾半徑的納米晶體粒子，在被激發(fā)時(shí)能產(chǎn)生熒光發(fā)射。它們通常由第II-VI組、第III-V組或第IV-VI組元素組成。量子點(diǎn)具有斯托克斯位移大、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、光學(xué)穩(wěn)定性好、量子產(chǎn)率高、發(fā)射波長(zhǎng)可調(diào)等獨(dú)特的光學(xué)特性[16-17]，在食源性致病菌檢測(cè)中具有很大的應(yīng)用潛力[18]。免疫磁分離技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[19]。

本研究建立了一種基于免疫磁珠富集和量子點(diǎn)發(fā)光的便捷、靈敏檢測(cè)樣品中E.coliO157∶H7的熒光免疫分析法。首先使用SiO2、羧基和E.coliO157∶H7抗體依次包覆Fe3O4納米顆粒制得的免疫磁珠對(duì)樣品中的E.coliO157∶H7進(jìn)行富集，然后使用由量子點(diǎn)標(biāo)記過(guò)的抗體，即熒光探針與E.coliO157∶H7結(jié)合，磁分離后，使用熒光光譜儀測(cè)定其發(fā)光強(qiáng)度，從而得到樣品中E.coliO157∶H7的濃度。將SiO2包覆在磁珠表面，可以減少其非特異性吸附，從而提高對(duì)目標(biāo)菌的選擇性并且有效的阻止了三明治結(jié)構(gòu)中量子點(diǎn)因電子轉(zhuǎn)移至Fe3O4而引起的熒光猝滅，為分析方法的可行性提供了保證。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Pure掃描電子顯微鏡，荷蘭Phenom公司；透射電子顯微鏡，荷蘭Philips公司；Nicolet IS5傅立葉紅外光譜儀，美國(guó)Thermo Fisher公司；熒光光譜光度計(jì)，日本Hitachi High-Tech公司。

乙酸鈉、乙二醇、FeCl3·6H2O(生化試劑)，上海生工有限公司；聚乙二醇2000(氣相色譜)、正硅酸乙酯(分析純)、異丙醇、油酸(分析純)，麥克林有限公司；二乙二醇(氣相色譜)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide，EDC]，阿拉丁有限公司；氨水(分析純)、無(wú)水乙醇(>99.5%)，西隴科學(xué)股份有限公司；N-羥基丁二酰亞胺(N-hydroxy succinimide，NHS)，美國(guó)Aldrich公司；LB肉湯(生物試劑)，海博生物計(jì)數(shù)有限公司；量子點(diǎn)，蘇州星爍納米科技有限公司；大腸桿菌O157∶H7 CICC 21530，廣東省微生物菌種保藏中心；大腸桿菌O157∶H7抗體，武漢華美生物工程有限公司。

1.2 E.coli O157∶H7的培養(yǎng)

將細(xì)菌培養(yǎng)物儲(chǔ)存在-20 ℃的甘油中，然后在LB肉湯中37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)進(jìn)行激活。取上述菌液100 μL加入到40 mL LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃，160 r/min，搖勻2.5 h，去除培養(yǎng)基后，用無(wú)菌PBS連續(xù)10倍稀釋使最終濃度為1.0×101～1.0×108CFU/mL。將100 μL的稀釋液涂布于LB瓊脂平板表面上，37 ℃培養(yǎng)22～24 h，計(jì)數(shù)可見(jiàn)菌落。

1.3 免疫磁珠Fe3O4@SiO2@Ab1的制備

以FeCl3·6H2O為鐵源，無(wú)水乙酸鈉為沉淀劑，聚乙二醇2000為表面活性劑，在還原劑乙二醇和二乙二醇的混合溶液中，200 ℃反應(yīng)12 h，制備了單分散性良好、粒徑均一的Fe3O4納米粒子。

將1.0 g粒徑200 nm的Fe3O4分散在20 mL去離子水中，分散均勻后加入4 mL氨水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32%)和120 mL異丙醇溶液。超聲混勻25 min后，用分液漏斗將20 mL異丙醇和4 mL正硅酸乙酯的混合溶液逐滴加入到混合物中，調(diào)整水浴鍋溫度為35 ℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)下連續(xù)攪拌20 h。待結(jié)束反應(yīng)后，磁分離回收Fe3O4@SiO2，經(jīng)過(guò)多次去離子水和乙醇洗滌后，真空干燥，儲(chǔ)存?zhèn)溆肹20]。

將100 mg的Fe3O4@SiO2分散在4 mL去離子水中，分散均勻后加入12 mL氨水和4 mL油酸。70 ℃反應(yīng)1 h，使用無(wú)水乙醇清洗3次后，磁分離回收，隨后加入30 mL 0.02 mol/L的KMnO4，快速機(jī)械攪拌8 h，磁分離，經(jīng)過(guò)多次去離子水和乙醇洗滌后，真空干燥，儲(chǔ)存?zhèn)溆肹21]。

隨后使用EDC和NHS對(duì)Fe3O4@SiO2上的羧基進(jìn)行活化，加入E.coliO157∶H7的抗體，37 ℃空氣浴振蕩5 h制得免疫磁珠Fe3O4@SiO2@Ab1，合成路線如圖1-a所示。

a-Fe3O4@SiO2@Ab1；b-Qds@Ab2圖1 Fe3O4@SiO2@Ab1和Qds@Ab2的合成路徑圖Fig.1 Synthetic route of Fe3O4@SiO2@Ab1 and Qds@Ab2

使用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)觀察免疫磁珠形貌；采用溴化鉀顆粒技術(shù)，在傅里葉光譜儀上獲得免疫磁珠表面官能團(tuán)性質(zhì)；采用SEM對(duì)樣品在10 kV加速電壓下的形貌進(jìn)行了表征；利用透射電鏡(transmission electron microscopy, TEM)獲得了納米粒子的尺寸和結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，將納米粒子懸浮液滴在碳涂層銅網(wǎng)格上，制得透射電鏡樣品。

1.4 熒光探針Qds@Ab2的制備

將量子點(diǎn)與E.coliO157∶H7的抗體置于室溫下空氣浴振蕩30 min得到熒光探針Qds@Ab2，合成路線圖如圖1-b所示。

1.5 E.coli O157∶H7免疫捕獲條件的優(yōu)化

應(yīng)用Miscellaneous設(shè)計(jì)和響應(yīng)面方法，研究在105CFU/mL的菌液濃度中免疫磁珠添加量、熒光探針添加量、孵育時(shí)間和磁分離時(shí)間4個(gè)自變量對(duì)E.coliO157∶H7的影響，因素和水平如表1所示。使用Design-Expert V8.0.6.1軟件設(shè)計(jì)方案，建立回歸模型，通過(guò)計(jì)算得到應(yīng)用于實(shí)際樣品時(shí)滿足檢測(cè)要求的最優(yōu)組合。

表1 免疫磁分離體系檢測(cè)E.coli O157∶H7熒光強(qiáng)度的試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels for fluorescence intensity of E.coli O157∶H7 by immunomagnetic separation system

1.6 E.coli O157∶H7的檢測(cè)

在優(yōu)化條件下，在離心管中分別加入40 μL免疫磁珠、100 μL菌液，37 ℃下孵育45 min，磁分離，使用PBS清洗3次后定容到100 μL；隨后添加20 μL抗體-量子點(diǎn)復(fù)合物，室溫下?lián)u床反應(yīng)30 min，反應(yīng)完畢后，磁分離，并用100 μL PBS定容。如圖2所示，游離的E.coliO157∶H7首先與免疫磁珠結(jié)合，然后由量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體與E.coliO157∶H7結(jié)合，形成一個(gè)三明治結(jié)構(gòu)最后將“免疫納米磁珠-菌-免疫量子點(diǎn)”復(fù)合物進(jìn)行熒光檢測(cè)。

圖2 反應(yīng)原理圖Fig.2 Overall working principle of the approach

選擇與E.coliO157∶H7相近的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、阪崎腸桿菌和痢疾志賀氏菌等食源性致病菌對(duì)模型的特異性進(jìn)行檢測(cè)。

在1 g牛肉樣品中加入1 mL一定濃度的菌液，等其自然風(fēng)干后，在其中加入2 mL體積分?jǐn)?shù)為3%三氯乙酸、7 mL PBS，渦旋后8 000 r/min離心10 min；取1 mL含有一定濃度菌液的牛奶、蜂蜜，在其中加入2 mL體積分?jǐn)?shù)為3%三氯乙酸、7 mL PBS，混合均勻后在5 000 r/min離心10 min。將沉淀?xiàng)壢ィ謩e在上清液中加入1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，定容后用pH為7.4的PBS稀釋上清液5～10倍，制備菌液終濃度為0～108CFU/mL的加標(biāo)牛肉、牛奶、蜂蜜樣品。最后根據(jù)上述所提出的免疫磁分離體系對(duì)添加的樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫磁珠的表征

2.1.1 紅外光譜表征

圖3 Fe3O4、Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2@Ab1的紅外光譜Fig.3 FT-IR spectrogram of Fe3O4 particles, Fe3O4@SiO2and Fe3O4@SiO2@Ab1

2.1.2 SEM表征

如圖4所示，對(duì)比Fe3O4和Fe3O4@SiO2的SEM圖像，F(xiàn)e3O4尺寸較小，表面粗糙(圖4-a)。從圖4-b可知，SiO2包覆Fe3O4后，顆粒團(tuán)聚減少，表面光滑。結(jié)果表明，SiO2幾乎均勻的分布在Fe3O4表面上。

a-Fe3O4；b-Fe3O4@SiO2圖4 Fe3O4和 Fe3O4@SiO2的SEM表征圖Fig.4 SEM graphs of Fe3O4 and Fe3O4@SiO2

2.1.3 TEM表征

如圖5所示，F(xiàn)e3O4納米顆粒由許多納米晶簇形成[24]，形狀為球形，表面粗糙，粒徑約為200 nm，分散性均一性較好(圖5-a)。SiO2包覆在Fe3O4顆粒表面之后，F(xiàn)e3O4@SiO2的粒徑增加至576 nm，SiO2的殼層厚度在376 nm左右(圖5-b)，與Fe3O4納米粒子相比，F(xiàn)e3O4@SiO2表面變?yōu)楣饣那蛐谓Y(jié)構(gòu)，可有效防止Fe3O4在空氣中氧化。其次，SiO2層的引入增加了材料的生物相容性[25]，同時(shí)也可以阻斷Fe3O4上的電子轉(zhuǎn)移，減少由于電子轉(zhuǎn)移造成的量子點(diǎn)熒光猝滅。

a-Fe3O4；b-Fe3O4@SiO2圖5 Fe3O4和Fe3O4@SiO2的TEM表征圖Fig.5 TEM images Fe3O4, Fe3O4@SiO2

2.2 E.coli O157∶H7免疫捕獲條件的優(yōu)化

按照1.6節(jié)的實(shí)驗(yàn)方法，依照實(shí)驗(yàn)因素水平表1進(jìn)行27次試驗(yàn)，以回收率為指標(biāo)，各因素組合下E.coliO157∶H7回收率的結(jié)果如表2所示。

表2 E.coli O157∶H7試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Miscellaneous test design scheme and results of E.coli O157∶H7

(1)回歸方程及方差分析

以回收率為響應(yīng)值，各因素之間的關(guān)系建立的二次回歸方程如下:

Y=102.06+21.19A+19.32B+1.27C+0.98D+9.09AB-2.75AC-5.45AD-3.15BC+2.77BD-3.28CD-29.58A2- 27.99B2-9.42C2-1.24D2

式中：Y，回收率；A，免疫磁珠添加量；B，熒光探針添加量；C，孵育時(shí)間；D，磁分離時(shí)間。

方差分析(表3)表明得到的回歸方程極顯著，模型的F值為8.06，模型P<0.05，表明模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Y的相關(guān)系數(shù)R2=0.903 8，表明實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值吻合較好。擬合損失值為0.373 2，>0.05，不存在擬合損失因子。因此，該模型可用于分析各種因素對(duì)免疫磁分離體系檢測(cè)細(xì)菌的影響，優(yōu)化和預(yù)測(cè)滿足檢測(cè)條件的最佳條件。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiments results

注:*，對(duì)結(jié)果影響顯著(P<0.05)；**，對(duì)結(jié)果極顯著影響(P<0.01)

(2)各因素交互作用分析

回歸方程模擬了4個(gè)因素對(duì)免疫磁分離體系檢測(cè)E.coliO157∶H7回收率的影響，如圖6所示，通過(guò)三維響應(yīng)面圖的分析，可以更直觀地發(fā)現(xiàn)不同變量對(duì)免疫磁分離體系檢測(cè)到的回收率的影響，表面高度越高、顏色越深，回收率越好。故免疫磁分離體系的最優(yōu)條件為免疫磁珠添加量40 mg、熒光探針添加量20 μL、孵育時(shí)間45 min、磁分離時(shí)間1.5 min。

圖6 免疫磁分離體系檢測(cè)細(xì)菌響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagram of bacteria detected by immunomagnetic separation system

(3)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

為使E.coliO157∶H7的回收率在80%～120%，目標(biāo)值接近100%，利用本模型得出免疫磁珠最佳添加量為40 mg、熒光探針最佳添加量為20 μL。為了驗(yàn)證本模型預(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確性，進(jìn)行回歸模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。實(shí)際測(cè)得E.coliO157∶H7的回收率為97%，與預(yù)測(cè)結(jié)果接近，說(shuō)明優(yōu)化結(jié)果可信，有實(shí)際指導(dǎo)作用。

2.3 E.coli O157∶H7的檢測(cè)

細(xì)菌樣品中472 nm處的熒光強(qiáng)度(fluorescence intensity，F(xiàn)I)與E.coli細(xì)胞數(shù)(N)的關(guān)系如圖7所示。

a-不同菌液濃度的熒光強(qiáng)度；b-標(biāo)準(zhǔn)曲線圖7 E.coli O157∶H7在472 nm處的熒光檢測(cè)Fig.7 The intensities of fluorescence peaks at 472 nm as functions of the concentrations of E.coli O157∶H7

細(xì)胞數(shù)在10～108CFU/mL范圍內(nèi)時(shí)，E.coliO157∶H7的回歸模型為：FI=34.32e(lgN/2.03)+24.20e(lgN/4.11)-1.81，R2=0.989 45。這些結(jié)果表明，通過(guò)測(cè)量472 nm處的熒光強(qiáng)度可以確定E.coliO157∶H7的細(xì)菌數(shù)量，檢測(cè)可在2 h內(nèi)完成且檢測(cè)范圍為10～108CFU/mL，檢出限為10 CFU/mL。

將免疫磁珠分別加入104CFU/mL的E.coliO157∶H7、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、阪崎腸桿菌和痢疾志賀氏菌中，在優(yōu)化條件下根據(jù)1.6所提出的模型對(duì)添加的樣品進(jìn)行檢測(cè)?；厥章嗜鐖D8所示，該免疫磁分離體系對(duì)E.coliO157∶H7有很好的選擇性。

圖8 免疫磁分離體系對(duì)E.coli O157∶H7的特異性Fig.8 Specificity of immunomagnetic separation system for E.coli O157∶H7

實(shí)際樣品中，該免疫磁分離體系對(duì)E.coliO157∶H7的回收率見(jiàn)表4，分別為80%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(relative standard deviation，RSD)值均不高于7.8%。

表4 Fe3O4@SiO2@Ab1對(duì)食品樣品中添加的E.coli O157∶H7的回收率Table 4 Recovery efficiency of E.coli O157∶H7 spiked in food samples by the Fe3O4@SiO2@Ab1

3 結(jié)論

本文建立了免疫磁珠和熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體檢測(cè)E.coliO157∶H7的方法。采用溶劑熱法制備了Fe3O4納米顆粒，并用SiO2、羧基和E.coliO157∶H7抗體依次包覆制得免疫磁珠。游離的E.coliO157∶H7首先與免疫磁珠結(jié)合，然后由量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體與E.coliO157∶H7結(jié)合，形成一個(gè)三明治結(jié)構(gòu)；隨后分析磁分離采集的磁珠的熒光強(qiáng)度(激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為370 nm/472 nm)。在引入SiO2殼層后，能減少傳統(tǒng)免疫磁珠的非特異性吸附，從而提高對(duì)目標(biāo)菌的選擇性，SiO2的殼結(jié)構(gòu)能有效地阻止量子點(diǎn)因電子轉(zhuǎn)移至Fe3O4而引起的熒光猝滅。動(dòng)態(tài)范圍為10～108CFU/mL，檢出限為10 CFU/mL。牛肉、牛奶和蜂蜜樣品中E.coliO157∶H7的平均加樣回收率分別為95%～104%、90%～94%、90%～110%；RSD分別為2.1%～3.8%、3.2%～7.8%、5.8%～6.3%。該方法縮短了傳統(tǒng)方法的檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。