基于宏基因測(cè)序及分箱技術(shù)的復(fù)合乳酸菌發(fā)酵乳菌種鑒定及定量

程坤，趙婷，劉蕊，周立光，馮會(huì)粉，于學(xué)健，李宏，姚粟*

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015) 2(中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可中心，北京，100062)

發(fā)酵乳是以生牛(羊)乳或乳粉為原料，經(jīng)殺菌、發(fā)酵后制成的pH值降低的產(chǎn)品(GB 19302—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》)。發(fā)酵乳行業(yè)的規(guī)模和質(zhì)量飛速發(fā)展，符合“健康中國(guó)”、“國(guó)民營(yíng)養(yǎng)計(jì)劃”等國(guó)家戰(zhàn)略，是關(guān)系國(guó)計(jì)民生的重要產(chǎn)業(yè)。嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)和德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)是發(fā)酵乳常用發(fā)酵劑菌種，二者之間存在共生關(guān)系，德氏乳桿菌保加利亞亞種代謝生成的氨基酸可刺激嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)，而嗜熱鏈球菌在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的甲酸可以促進(jìn)德氏乳桿菌保加利亞亞種的生長(zhǎng)[1]。發(fā)酵乳通常添加對(duì)人體有益的益生菌，如：動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)和干酪乳酪桿菌(Lacticaseibacilluscasei)，有助于促進(jìn)腸道微生物的定殖，治療和預(yù)防腹瀉、緩解便秘、增強(qiáng)人體免疫力等[2]，某一株益生菌在產(chǎn)品中需要達(dá)到一定數(shù)量才能起到保健作用，因此發(fā)酵乳中菌種的鑒定和定量尤其重要。

目前我國(guó)對(duì)于發(fā)酵乳中乳酸菌的使用和監(jiān)管，標(biāo)準(zhǔn)主要為GB 4789.34—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 雙歧桿菌檢驗(yàn)》和GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和生理生化鑒定方法進(jìn)行發(fā)酵乳中乳酸菌的鑒定和定量，具有成本低，易于操作等優(yōu)點(diǎn)，但需要獲得菌種純培養(yǎng)物，且存在檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確等問(wèn)題。建立快速、準(zhǔn)確的復(fù)合乳酸菌發(fā)酵乳菌種鑒定和定量檢測(cè)方法，成為發(fā)酵乳行業(yè)亟待解決的熱點(diǎn)、難點(diǎn)問(wèn)題之一[3]。近幾年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)迅速發(fā)展，采用宏基因組測(cè)序分箱分析可將包含不同生物體的序列進(jìn)行組裝，重現(xiàn)復(fù)合樣品中的微生物種類(lèi)，解析產(chǎn)品組成。該方法以復(fù)合樣品總基因組DNA為分析對(duì)象，有效避免了菌種分離培養(yǎng)步驟，目前已被應(yīng)用于復(fù)合益生菌產(chǎn)品的物種組成分析[4]。平均核苷酸一致性(average nucleotide identity，ANI)是通過(guò)全基因組序列鑒定細(xì)菌物種的常用方法之一，其域值95%～96%與DNA-DNA雜交值70%相對(duì)應(yīng)，可作為細(xì)菌種水平界定的標(biāo)準(zhǔn)[5]。ANI分析具有方便、快捷、分辨率高的優(yōu)點(diǎn)[5]，其與宏基因組分箱分析相結(jié)合，為復(fù)合乳酸菌發(fā)酵乳菌種的種水平精準(zhǔn)鑒定提供了一種可靠方法。

復(fù)合乳酸菌發(fā)酵乳產(chǎn)品的菌種組成與定量分析是產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵。本文以3款市售復(fù)合乳酸菌發(fā)酵乳產(chǎn)品為研究對(duì)象，利用宏基因組測(cè)序和分箱技術(shù)、ANI分析等技術(shù)，研究復(fù)合乳酸菌發(fā)酵乳產(chǎn)品中菌種種水平鑒定及相對(duì)定量。對(duì)復(fù)合菌發(fā)酵乳產(chǎn)品的質(zhì)量控制和行業(yè)監(jiān)管具有重要參考意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 復(fù)合乳酸菌發(fā)酵乳產(chǎn)品

本研究選取3款不同品牌的復(fù)合乳酸菌發(fā)酵乳產(chǎn)品A、B、C，均購(gòu)自北京大型超市。產(chǎn)品標(biāo)簽標(biāo)識(shí)菌株類(lèi)別及活菌數(shù)如下：

樣品1：產(chǎn)品A(菌種名稱(chēng)：動(dòng)物雙歧桿菌BB-12、嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種；保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌總數(shù)1×106CFU/g，雙歧桿菌1×107CFU/g)；

樣品2：產(chǎn)品B(菌種名稱(chēng)：保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌，乳酸菌活菌數(shù)≥1×106CFU/g)；

樣品3：產(chǎn)品C(菌種名稱(chēng)：乳雙歧桿菌BL-99、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌；乳雙歧桿菌總數(shù)≥1×106CFU/g)。

1.1.2 試劑與儀器

DNA提取試劑盒：E.Z.N.A.?Bacterial DNA Kit，美國(guó)OMEGA公司；文庫(kù)構(gòu)建試劑盒NEXTflex Rapid DNA-Seq Kit，美國(guó)Bioo Scientific公司。

Eppendorf微量可調(diào)節(jié)移液器、5424R小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；HG-50高壓滅菌鍋，日本HIRAYAMA公司；AC2-4S1生物安全柜，新加坡Esco公司；BioDrop核酸蛋白分析儀，豪沃生物科技(上海)有限公司；Qubit 3.0 核酸熒光定量?jī)x，美國(guó)ThermoFisher Scientific公司；Illumina HiSeq 3000基因測(cè)序平臺(tái)，美國(guó)Illumina公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取

取20 mL發(fā)酵乳樣品，4 000 r/min離心5 min，吸取上清液，12 000 r/min離心10 min，取沉淀按照試劑盒E.Z.N.A.?Bacterial DNA Kit的說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA。使用Qubit 3.0核酸熒光定量?jī)x、BioDrop核酸蛋白分析儀分別檢測(cè)基因組DNA的濃度和純度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的完整度。

1.2.2 宏基因組文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

通過(guò)物理方法將質(zhì)檢合格的基因組DNA隨機(jī)打斷成300～400 bp的片段，使用NEXTflex Rapid DNA-SeqKit按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行文庫(kù)制備。使用Illumina HiSeq 3000測(cè)序平臺(tái)(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)進(jìn)行宏基因組測(cè)序，宏基因組序列NCBI登錄號(hào)分別為：SAMN22013808，SAMN22013809，SAMN22013810。

1.2.3 下機(jī)數(shù)據(jù)質(zhì)控與組裝

采用MetaWRAP流程[6]對(duì)宏基因組下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和組裝，采用Trim Galore(http://www.bioinformat- ics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)去除reads 的adapter、過(guò)濾質(zhì)量值低于20的reads，參數(shù)采用默認(rèn)設(shè)置。使用Megahit[7]軟件進(jìn)行序列組裝，采用succinct de Bruijn graph方法進(jìn)行拼接，k-mer參數(shù)從小至大迭代，選擇長(zhǎng)度≥1 000 bp的contigs用于后續(xù)分析。

1.2.4 分箱分析

采用MetaWRAP流程對(duì)拼接后的contig開(kāi)展分箱分析，獲得各樣品的分箱結(jié)果(bin)。利用checkM[8]評(píng)估各bin的完整度和污染度，選取完整度>70%和污染度<10%的bin[9]，利用blobology模塊繪制各樣品中bin的豐度散點(diǎn)圖。通過(guò)Circos[10](版本0.69-8)軟件對(duì)各樣品bins 進(jìn)行可視化分析，每個(gè)bin的contigs重新基于模式菌株有參組裝，展示最終的基因組圈圖。

1.2.5 ANI分析

從NCBI genome 數(shù)據(jù)庫(kù)下載相關(guān)種模式菌株的基因組序列，使用fastANI[11](版本：1.32)計(jì)算各bin與相關(guān)物種模式株基因組序列之間的ANI值。以ANI值為95%～96%作為細(xì)菌物種界定的標(biāo)準(zhǔn)[5]，對(duì)各樣品的分箱結(jié)果進(jìn)行物種鑒定。

1.2.6 物種定量分析

采用Quant_bins模塊分析各bin的相對(duì)豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控和組裝

針對(duì)樣品的宏基因組測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)，采用Fastp[12]軟件，堿基質(zhì)量值≥20，對(duì)raw data進(jìn)行質(zhì)控。質(zhì)控后A、B、C 3個(gè)產(chǎn)品的clean data數(shù)分別為13 667 335 968、12 529 436 956和12 225 941 409 bp，堿基質(zhì)量值Q30均大于90%，測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量能夠滿(mǎn)足后續(xù)分析(表1)。

表1 樣品宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Data statistics for metagenomic sequencing data

對(duì)clean data進(jìn)行組裝，各產(chǎn)品獲得的contigs數(shù)目及相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 樣品宏基因組數(shù)據(jù)組裝結(jié)果Table 2 Assembly result of the metagenomic sequencing data

2.2 復(fù)合乳酸菌產(chǎn)品中物種基因組重建

使用MetaWRAP宏基因組分析流程對(duì)組裝后的contigs進(jìn)行分箱分析，獲得分箱結(jié)果(bin)，即重建的基因組。產(chǎn)品A、B、C的contigs 均分別分箱成3個(gè)bin(表3)，與各產(chǎn)品標(biāo)識(shí)所聲稱(chēng)添加的菌種數(shù)量一致。通過(guò)checkM來(lái)評(píng)估分箱后bin的完整度和污染度，結(jié)果表明，各樣品分箱產(chǎn)生的bin的完整度均高于85%，污染度均低于5%(表3)。各Bin豐度散點(diǎn)圖見(jiàn)圖1。

表3 宏基因組分箱后各bin的參數(shù)Table 3 The results of metagenomics binning

a-產(chǎn)品A；b-產(chǎn)品B；c-產(chǎn)品C圖1 Bin豐度散點(diǎn)圖Fig.1 Scatter plots of bins abundance注：一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)contig，相同顏色的contig來(lái)自同一個(gè)bin

2.3 復(fù)合乳酸菌產(chǎn)品中物種的鑒定

將分箱獲得的各bin通過(guò)NCBI-Blast進(jìn)行初步比對(duì)，確定其近緣物種，利用fastANI軟件計(jì)算各bin與近緣物種模式株之間的ANI值(表4)。每個(gè)樣品中的bin與最近緣物種模式菌株基因組ANI分析的值均>95%，表明每個(gè)bin 代表的菌種與模式菌株為同一個(gè)種(表4)。

表4 分箱結(jié)果與參考模式菌基因組ANI 分析Table 4 The analysis results of ANI between bins and genomes of type strains

產(chǎn)品A和產(chǎn)品C中3個(gè)bin通過(guò)ANI分析鑒定為嗜熱鏈球菌、動(dòng)物雙歧桿菌和德氏乳桿菌，與該產(chǎn)品聲稱(chēng)添加的菌種一致。產(chǎn)品B中3個(gè)bin通過(guò)ANI分析鑒定為嗜熱鏈球菌、干酪乳酪桿菌和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，其中，嗜熱鏈球菌和干酪乳酪桿菌與該產(chǎn)品聲稱(chēng)添加的菌種一致，未檢測(cè)到該產(chǎn)品聲稱(chēng)添加的德氏乳桿菌，檢測(cè)到的乳酸乳球菌未出現(xiàn)在該產(chǎn)品聲稱(chēng)中。

Contig利用模式基因組進(jìn)行有參組裝后，通過(guò)Circos v 0.69-8軟件對(duì)各樣品bin進(jìn)行可視化，基因組圈圖見(jiàn)圖2。

圖2 產(chǎn)品宏基因組菌種基因組重建Fig.2 Re-constructed genomes from samples by means of the metagenomics binning注：每一個(gè)產(chǎn)品的bins 都由橫向排列的遺傳圖譜來(lái)表示，相同物種用同一種顏色顯示，綠色“√”表示分箱得到的物種與產(chǎn)品聲稱(chēng)菌種一致

動(dòng)物雙歧桿菌和干酪乳桿菌在我國(guó)《可用于食品的菌種名單(衛(wèi)辦監(jiān)督發(fā)〔2010〕65號(hào))》之列，是

發(fā)酵乳常用的益生菌，在A、B和C 3個(gè)產(chǎn)品中也均有添加。其中，動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種曾用名為乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)[13]；德氏乳桿菌保加利亞亞種的曾用名為保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)[14]。干酪乳桿菌(Lactobacillucasei)在2020年其分類(lèi)學(xué)地位變更為干酪乳酪桿菌[15]。

德氏乳桿菌在產(chǎn)品B中未被檢測(cè)到，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在利用完整度>70%、污染度<10%參數(shù)對(duì)產(chǎn)品B宏基因組分箱初步結(jié)果的過(guò)濾前，檢測(cè)到1個(gè)完整度僅為6.61%的bin，通過(guò)ANI分析顯示為德氏乳桿菌，定量結(jié)果顯示相對(duì)豐度為0.09%，由于bin完整度較低，可能會(huì)引起該定量檢測(cè)結(jié)果的偏差，該菌種按照宏基因組數(shù)據(jù)過(guò)濾參數(shù)未形成完整bin，說(shuō)明產(chǎn)品中菌種的相對(duì)豐度較低時(shí)，可能引起分箱bin的完整度不夠而沒(méi)有被檢測(cè)到。產(chǎn)品B中檢測(cè)到的乳酸乳球菌，推測(cè)可能為原料、環(huán)境、生產(chǎn)過(guò)程等環(huán)節(jié)引入，或未經(jīng)菌種鑒定誤按嗜熱鏈球菌添加進(jìn)產(chǎn)品，尚需進(jìn)一步的驗(yàn)證確認(rèn)。

2.4 復(fù)合乳酸菌產(chǎn)品中各物種的定量分析

利用Quant_bins模塊計(jì)算各樣品中bin的相對(duì)豐度，結(jié)果如表5所示。

表5 各分箱結(jié)果的定量分析Table 5 Quantitative analysis of bins

對(duì)于產(chǎn)品A，其分箱分析所檢測(cè)到的嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌和動(dòng)物雙歧桿菌3個(gè)物種的相對(duì)豐度分別為96.85%、0.12%和3.02%，嗜熱鏈球菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)物種。該產(chǎn)品標(biāo)識(shí)聲稱(chēng)嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌總量為1×106CFU/g，定量結(jié)果表明，產(chǎn)品中二者的相對(duì)比例約為807∶1。產(chǎn)品B標(biāo)識(shí)聲稱(chēng)活菌總數(shù)為1×106CFU/g，通過(guò)定量分析顯示，分箱分析所檢測(cè)到的嗜熱鏈球菌、干酪乳酪桿菌和乳酸乳球菌3個(gè)物種的相對(duì)豐度分別為99.43%、0.27%和0.21%，嗜熱鏈球菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)物種。產(chǎn)品C聲稱(chēng)添加的物種類(lèi)別與產(chǎn)品A相同，且其中動(dòng)物雙歧桿菌的添加量為1×106CFU/g。定量結(jié)果表明，嗜熱鏈球菌的相對(duì)豐度為99.55%，德氏乳桿菌和動(dòng)物雙歧桿菌的相對(duì)豐度分別為0.18%和0.14%。復(fù)合乳酸菌發(fā)酵乳產(chǎn)品中對(duì)所添加各菌種定量主要是以乳酸菌活菌數(shù)或某一種/株益生菌活菌數(shù)為指標(biāo)，本研究中基于宏基因組的定量分析為相對(duì)定量，以活菌數(shù)和死菌數(shù)總和的百分比表示，隨著后生元(postbiotics)[16]概念逐漸被大眾所熟悉及相應(yīng)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，相較于傳統(tǒng)定量檢測(cè)方法，本文提供了新的思路。

3 結(jié)論

本研究以3款市售復(fù)合乳酸菌發(fā)酵乳產(chǎn)品為研究對(duì)象，利用宏基因組測(cè)序和分箱分析、ANI分析等技術(shù)，研究復(fù)合乳酸菌發(fā)酵乳產(chǎn)品中菌種種水平鑒定及相對(duì)定量。產(chǎn)品A和產(chǎn)品C分箱獲得的3個(gè)bin通過(guò)ANI分析鑒定為嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌和動(dòng)物雙歧桿菌，與產(chǎn)品聲稱(chēng)添加菌種一致，產(chǎn)品A 3個(gè)物種的相對(duì)豐度分別為96.85%、0.12%和3.02%，產(chǎn)品C 3個(gè)物種的相對(duì)豐度分別為99.55%、0.18%和0.14%。產(chǎn)品B分箱獲得的3個(gè)bin通過(guò)ANI分析鑒定為嗜熱鏈球菌、干酪乳酪桿菌和乳酸乳球菌，與產(chǎn)品聲稱(chēng)添加菌種部分一致，3個(gè)物種的相對(duì)豐度分別為99.43%、0.27%和0.21%。本研究為復(fù)合乳酸菌發(fā)酵乳產(chǎn)品的菌種鑒定與定量提供了一種可行的分析方法，與傳統(tǒng)基于可培養(yǎng)的分析方法相比，具有準(zhǔn)確、可靠等優(yōu)點(diǎn)，且不受菌種死活狀態(tài)的影響。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷革新，高通量測(cè)序在成本與周期方面必將進(jìn)一步下降和縮短，宏基因測(cè)序及分箱作為一項(xiàng)新興技術(shù)在食品檢測(cè)領(lǐng)域?qū)⑦M(jìn)一步推廣應(yīng)用，有望發(fā)展成為一種常規(guī)分析方法。本研究對(duì)復(fù)合乳酸菌發(fā)酵乳產(chǎn)品的質(zhì)量控制和行業(yè)監(jiān)管具有重要參考意義。