γ-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)及其產(chǎn)物特異性

陶志杰，楊靜文，王清晨，吳元元，胡雪芹，張洪斌*

1(蚌埠學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，安徽 蚌埠，233030)2(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥，230009)

環(huán)糊精(cyclodextrin，CD)在自然界中主要由芽孢桿菌屬細(xì)菌利用環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase，EC2.4.1.19)催化淀粉而得到的不同聚合度的環(huán)狀低聚葡萄糖[1-2]。CGTase屬于糖基水解酶家族13，是一種具有4種催化反應(yīng)的多功能酶，其中包含歧化、環(huán)化和偶聯(lián)3個(gè)轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)和水解反應(yīng)[3]。由于其轉(zhuǎn)糖基活性遠(yuǎn)大于水解活性，被歸屬于轉(zhuǎn)移酶類。該酶催化常見產(chǎn)物有6、7、8個(gè)葡萄糖基組成的α-、β-和γ-CD[4]，以及更高聚合度的大環(huán)糊精[5-6]。環(huán)糊精結(jié)構(gòu)呈“甜甜圈”狀，具有內(nèi)部疏水空腔和親水表面，可以與客體分子形成包合物，由于這一獨(dú)特的性質(zhì)，CDs可以與廣泛的固體、液體和氣體化合物形成分子包合物(主客體復(fù)合物)，提高了分子的穩(wěn)定性、溶解性、反應(yīng)性和生物利用度[7]，在食品、醫(yī)藥、分析化學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[8]。

β-CD產(chǎn)量高價(jià)格便宜，但溶解性差。γ-CD是一種備受關(guān)注的CD，因?yàn)樗哂懈笾睆降目涨?，這使得它可以與更大分子形成包合物。同時(shí)，它在25 ℃水中的溶解度是α-CD的1.6倍，更是β-CD的12.54倍，這有利于制備更高濃度的活性溶劑[9]。但由于其產(chǎn)量低、價(jià)格高，應(yīng)用受到極大的限制。因此，獲得新的CGTase對(duì)γ-CD的生產(chǎn)具有重要的科學(xué)意義和實(shí)用價(jià)值。

目前，用于合成γ-CD的主要微生物有Bacillussp.G-825-6[5]、Bacillusmacorous[10]、Bacillusthuringiensis[11]和Bacillusclarkii7364[12]等。由于野生菌種遺傳背景復(fù)雜，不易調(diào)控且CGTase酶表達(dá)量低等缺陷，研究者們正通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建高表達(dá)、高產(chǎn)物特異性的工程菌種。用于表達(dá)的系統(tǒng)主要有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌[13]和畢赤酵母[14]表達(dá)系統(tǒng)，其中大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的CGTase表達(dá)系統(tǒng)[15]。已報(bào)道的γ-CGTase共有8種[16]，來(lái)源不同的γ-CGTase存在產(chǎn)物特異性差異大、淀粉轉(zhuǎn)化率低、產(chǎn)物中γ-CD占比低等不足，為后續(xù)γ-CD純化帶來(lái)不便。因此，γ-CGTase的自然篩選、分子改造以及催化工藝條件優(yōu)化成為研究熱點(diǎn)[17]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)克隆來(lái)源于Bacillusclarkii7364的γ-CGTase基因，將其與pET28a(+)質(zhì)粒連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coliBL21)中進(jìn)行表達(dá)。研究該酶的酶學(xué)性質(zhì)和產(chǎn)物特異性，為獲得γ-CGTase的工業(yè)化應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株和質(zhì)粒：E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、質(zhì)粒 pET28a(+)均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10，121 ℃滅菌20 min。

主要試劑：質(zhì)粒提取試劑盒、Fast Mutagenesis System試劑盒、膠回收試劑盒、蛋白定量試劑盒、蛋白純化Ni-IDA Resin、FastPfu DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ，北京全式金生物技術(shù)有限公司；胰蛋白胨、酵母抽提物，英國(guó)Oxoid公司；異丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)，美國(guó)Sigma公司；硫酸卡納霉素，上海雅吉生物科技有限公司；α-CD、β-CD、γ-CD標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)，上海生工生物工程有限公司；可溶性淀粉等均為國(guó)產(chǎn)分析純或生化試劑，其他淀粉為食品級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；DYY-5電泳儀，北京市六一儀器廠；TC-96/G/H(b)C PCR儀，杭州博日科技有限公司；Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng)，安徽省鑫源祥生物技術(shù)有限公司；KS-150超聲波細(xì)胞破碎儀，大慶儀器公司；Avanti J-E高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；D-37520 1-14k小型離心機(jī)，德國(guó)Sigma離心機(jī)公司；Master touch-DUF超純水制備儀，上海和泰儀器有限公司；示差折射率檢測(cè)器，Shodexl永城儀器公司；X-Amide高效液相色譜柱，華譜科儀(北京)科技有限公司等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 重組菌構(gòu)建

通過(guò)NCBI查詢獲得來(lái)自于Bacillusclarkii7364的γ-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因(NCBI登錄號(hào)為BAH14968.1)，由蘇州金唯智生物科技有限公司完成基因合成。以合成的目的酶基因序列為模板設(shè)計(jì)引物，正向引物序列′-GAAACACGGATCCGCGACCCATTTGC-3′和反向引物序列5′-TTCGCCGCCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTG

CTAACAAA-3′，以pET-28a(+)為載體，得到連接產(chǎn)物pET-28a(+)-γ-CGTase轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)中，提取質(zhì)粒酶切和測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒通過(guò)熱轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)內(nèi)，最終獲得E.coliBL21/pET28a(+)-γ-CGTase重組基因工程表達(dá)菌株。

1.3.2 酶蛋白表達(dá)

將構(gòu)建好的重組菌株E.coliBL21/pET28a(+)-γ-CGTase和對(duì)照菌株E.coliBL21/pET28a(+)分別以2%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種于100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)至OD600達(dá)到1.8～2.0后，加入終濃度為0.3 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，于25 ℃、200 r/min環(huán)境中表達(dá)培養(yǎng)8 h。在4 ℃、8 000 r/min的條件下離心15 min獲得菌體，用0.05 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉(pH 10)洗滌細(xì)胞。將重懸菌液于冰浴中超聲波破碎15 min，于4 ℃、6 000 r/min離心15 min獲得粗酶液，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 酶蛋白分離純化

將粗酶液用鎳親和凝膠柱純化，分別收集80～200 mmol/L咪唑洗脫液。選擇最佳咪唑洗脫濃度洗脫，洗脫液用5 000 Da透析袋透析24 h去除咪唑等雜質(zhì)，收集透析酶液。隨后用聚乙二醇進(jìn)行酶液濃縮，得到純化酶液。采用SDS-PAGE和Bradford法進(jìn)行酶分子質(zhì)量、酶蛋白濃度測(cè)定，計(jì)算每步純化后比活力和活力回收率。

1.3.4 酶活力測(cè)定方法

該酶有環(huán)化、耦合、歧化、水解反應(yīng)，而環(huán)化能力是該酶的主要特性，為了分析酶催化機(jī)制，因此測(cè)定該酶的γ-環(huán)化活力和水解活力。

1.3.4.1 酶水解活力測(cè)定

參照花敬涵[18]藍(lán)值法略有改動(dòng)。取稀釋酶液10 μL加入200 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的可溶性淀粉溶液，在40 ℃，pH 10.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中反應(yīng)10 min后，加入0.5 mol/L的冰乙酸500 μL結(jié)束反應(yīng)，最后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005%的碘液3 mL顯色，樣品在700 nm下測(cè)定吸光度(以等量緩沖液代替淀粉溶液為空白對(duì)照)，酶活力計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：ODA，未加酶液吸光度；ODB，加入酶液吸光度;n，稀釋倍數(shù)。

一個(gè)酶活力單位定義為使吸光度下降10%的酶量。

1.3.4.2 γ-環(huán)化活力測(cè)定

反應(yīng)條件：1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%淀粉，10 μL酶液，pH 10，40 ℃，催化30 min。反應(yīng)結(jié)束，沸水熱燙5 min，12 000 r/min離心10 min后去除沉淀，吸取上清液過(guò)0.22 μm濾膜，HPLC法檢測(cè)并用外標(biāo)法計(jì)算產(chǎn)量。

色譜條件：液相檢測(cè)器為示差折射率檢測(cè)器，X-Amide 酰胺色譜柱(4.6 mm×250 mm)；色譜柱溫度為25 ℃，流動(dòng)相是體積分?jǐn)?shù)為65%乙腈/蒸餾水，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

酶活力單位定義：1 min生成1 mg γ-CD所需加酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。參照鄭丹妮等[16]的方法。

標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定：精密稱取0.50 g γ-CD標(biāo)準(zhǔn)品，以蒸餾水將其定容于25 mL容量瓶中，配制成20 mg/mL的母液。分別用蒸餾水稀釋至γ-CD終質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 mg/mL的梯度溶液，使用上述HPLC條件檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，HPLC得到的γ-CD峰面積為縱坐標(biāo)，通過(guò)Origin軟件線性分析得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。得回歸線性方程Y=244 890X+40 766(R2=0.999 2)，線性范圍為2～20 mg/mL。在此范圍內(nèi)，γ-CD含量與峰面積呈正相關(guān)。

1.3.5 γ-CGTase最適溫度及溫度穩(wěn)定性測(cè)定

最適溫度：將酶反應(yīng)溫度設(shè)置在35～80 ℃，按1.3.4的方法操作，測(cè)定酶的最適溫度。將最大相應(yīng)酶活力定為100%，分別計(jì)算相對(duì)酶活力。

溫度穩(wěn)定性：將酶置于不同溫度下孵育，隔不同時(shí)間測(cè)定相應(yīng)酶活力。將初始酶活力定為100%，分別計(jì)算相對(duì)酶活力，考察該酶γ-環(huán)化與水解活力的溫度穩(wěn)定性。

1.3.6 γ-CGTase最適pH及pH穩(wěn)定性測(cè)定

最適pH：該酶來(lái)自于堿性芽孢桿菌，因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察pH為7～13。配制0.05 mol/L 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液，利用pH計(jì)調(diào)節(jié)各個(gè)緩沖液。用不同pH緩沖液配制2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)可溶性淀粉為底物溶液，測(cè)定酶活力。將最大酶活力定為100%，分別計(jì)算相對(duì)酶活力。

pH穩(wěn)定性：配制0.05 mol/L pH 4～13的緩沖溶液(pH 4～7乙酸-乙酸鈉緩沖液，7～13甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液)，純化酶用不同pH緩沖液稀釋，于4 ℃冰箱保存1、24 h，測(cè)定酶活力，24 h與1 h酶活力之比，計(jì)算保留酶活力，考察該酶γ-環(huán)化與水解活力的pH穩(wěn)定性。

1.3.7 金屬離子對(duì)γ-CGTase酶活力影響

用超純水分別配制50 mmol/L的NH4Cl、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、NiCl2、CuSO4、BaCl2、MnSO4、ZnCl2、FeCl3、Al2(SO4)3和EDTA溶液，稀釋至使其在酶促反應(yīng)中終濃度為1 mmol/L，測(cè)定酶活力，以等量超純水代替金屬離子液為對(duì)照100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，比較上述金屬離子對(duì)酶活力的影響。

1.3.8 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

以可溶性淀粉為底物，利用雙倒數(shù)法Lineweaver-Burk測(cè)定γ-CGTase反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。測(cè)量0.4%～2%不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)溶液下γ-CGTase的γ-環(huán)化活力。酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線用縱坐標(biāo)(1/υ)橫坐標(biāo)(1/[S])作圖，即可得到酶反應(yīng)動(dòng)為學(xué)參數(shù)。

1.3.9 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)γ-CD產(chǎn)量的影響

以2%可溶性淀粉為底物，酶添加量為3.35 U/g(環(huán)化酶活力/干淀粉)，終體積分?jǐn)?shù)為0、5%、10%、15%、20%、25%的乙醇，在50 ℃、pH 10的條件下催化6 h，HPLC法測(cè)定產(chǎn)物。

1.3.10 底物種類對(duì)產(chǎn)物特異性影響

分別配制2%葛根淀粉、木薯淀粉、小麥淀粉、豌豆淀粉、玉米淀粉和可溶性淀粉為考察對(duì)象。

反應(yīng)體系：1 mL 2%不同種類的糊化淀粉為底物，酶添加量為3.35 U/g(環(huán)化酶活力/干淀粉)，50 ℃，pH 10，反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束，沸水熱燙5 min，12 000 r/min 離心5 min，過(guò)膜，檢測(cè)γ-CD。

1.3.11 數(shù)據(jù)分析及處理

每組平行測(cè)定3次，標(biāo)準(zhǔn)偏差以誤差線的形式表示，利用Origin軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 E.coli BL21/pET28a(+)-γ-CGTase重組菌株構(gòu)建與表達(dá)

2.1.1 重組菌株構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增的γ-CGTase基因與載體pET28a(+)片段用無(wú)縫克隆技術(shù)與相同酶切位點(diǎn)的載體pET28a(+) 相連接，通過(guò)42 ℃熱擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α細(xì)胞。經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證并提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。結(jié)果與理論片段大小相符，表明重組菌株E.coliBL21/pET28a(+)-γ-CGTase構(gòu)建成功。

2.1.2 γ-CGTase的表達(dá)與純化

重組菌株在25 ℃、200 r/min、終濃度為0.3 mmol/L的IPTG條件下誘導(dǎo)8 h，可達(dá)到蛋白可溶性表達(dá)。圖1-a中，在加0.3 mmol/L IPTG誘導(dǎo)劑重組菌株破碎細(xì)胞上清液中明顯可以看到70 kDa處有目的蛋白表達(dá)，與預(yù)測(cè)蛋白大小(78 kDa)一致。

M-蛋白質(zhì)Marker，1～4-80、120、160和200 mmol/L咪唑洗脫液a-重組菌蛋白表達(dá);b-重組菌γ-CGTase純化圖1 重組菌產(chǎn)酶SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant becteria production

由圖1-b可知，在70 kDa Marker附近處有唯一條帶，γ-CGTase由702個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量約為78 kDa，與理論值一致。200 mmol/L咪唑?yàn)樽罴严疵摑舛?，通過(guò)逐步純化得到純化酶，測(cè)定結(jié)果見表1(水解活力)。細(xì)胞破碎離心得到的上清液為粗酶液，由于是細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，會(huì)含有較多的宿主蛋白。通過(guò)Ni-NTA親和層析純化，γ-CGTase蛋白上含有6×His標(biāo)簽，可以有效去除雜蛋白，但由于親和結(jié)合達(dá)飽和，也會(huì)使γ-CGTase蛋白未能充分結(jié)合而丟失，導(dǎo)致純化后活力回收率低。透析可以有效去除咪唑等小分子物質(zhì)，再通過(guò)聚乙二醇脫水濃縮，使得酶活力回收率基本保持無(wú)損失。

表1 γ-CGTase蛋白純化Table 1 The purification of the γ-CGTase

2.2 γ-CGTase的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 溫度對(duì)酶活力的影響

2.2.1.1 γ-CGTase的最適溫度

γ-CGTase具有環(huán)化、耦合、歧化、水解4種催化功能，環(huán)化功能是其主要功能。從圖2可知，γ-CGTase的水解最適溫度比γ-環(huán)化最適溫度范圍窄。隨溫度升高酶水解活力增強(qiáng)，當(dāng)65 ℃時(shí)達(dá)到最大活力，隨著溫度上升酶活力急劇下降。而γ-CGTase的γ-環(huán)化活力的最適溫度范圍較寬，60 ℃為最適溫度，40～65 ℃均有較高的酶活力，相對(duì)酶活力保持在近90%或以上。

圖2 γ-CGTase的最適溫度Fig.2 The optimal temperature of the γ-CGTase

2.2.1.2 γ-CGTase的溫度穩(wěn)定性

由圖3可知，γ-CGTase的水解熱穩(wěn)定性比γ-環(huán)化穩(wěn)定性弱。40 ℃時(shí)，該酶的水解活力在8 h為63%，而γ-環(huán)化活力仍保持在95%以上。50 ℃時(shí)，水解活力8 h已達(dá)半衰期，而γ-環(huán)化活力仍保持在60%左右。隨著溫度再次升高，兩種活力均出現(xiàn)下降，但在高溫條件下γ-環(huán)化活力的衰退速度比水解活力衰退得慢。由此可得出，γ-CGTase的γ-環(huán)化活力熱穩(wěn)定性比水解活力強(qiáng)。

a-水解熱穩(wěn)定性;b-γ-環(huán)化熱穩(wěn)定性圖3 γ-CGTase的水解和γ-環(huán)化熱穩(wěn)定性Fig.3 The temperature stability of the hydrolysis and cyclization activity of the γ-CGTase

2.2.2 pH對(duì)酶活力的影響

2.2.2.1 γ-CGTase的最適pH

pH對(duì)酶的催化活性有較強(qiáng)影響。由圖4可知，γ-CGTase的水解最適pH比γ-環(huán)化最適pH偏堿。γ-CGTase的水解最適pH為12，在pH 11～13有較穩(wěn)定的水解活力，而γ-CGTase的γ-環(huán)化最適pH為10，pH對(duì)γ-環(huán)化活力的影響比水解活力大。

圖4 γ-CGTase的最適pHFig.4 The optimal pH of the γ-CGTase

2.2.2.2 γ-CGTase的pH穩(wěn)定性

γ-CGTase屬于堿性酶。由圖5可知，在pH>6環(huán)境中有較好的穩(wěn)定性，24 h后兩種酶活力仍可保留在60%以上。當(dāng)pH低于5時(shí)，明顯可見酶蛋白出現(xiàn)沉淀，活力急劇下降，水解活力基本消失。經(jīng)軟件分析，該酶的pI為4.59，因此出現(xiàn)蛋白質(zhì)沉淀現(xiàn)象，與測(cè)算結(jié)果表現(xiàn)一致。γ-CGTase水解活力最高穩(wěn)定條件在pH 11～13，γ-環(huán)化活力最高穩(wěn)定條件在pH 9～10，兩者存在差異。因此該酶催化的最佳pH(環(huán)化活力)為9～10，符合堿性芽孢桿菌來(lái)源酶的特性。

a-水解pH穩(wěn)定性；b-γ-環(huán)化pH穩(wěn)定性圖5 γ-CGTase的水解和γ-環(huán)化pH穩(wěn)定性Fig.5 The pH stability of the hydrolysis and cyclization activity of the γ-CGTase

2.2.3 金屬離子對(duì)酶活力影響

不同金屬離子對(duì)γ-CGTase活力的影響見圖6。金屬離子Ca2+、Mg2+對(duì)該酶的兩種酶活力均有促進(jìn)作用，提高約10%的酶活力，Zn2+、Mn2+和Al3+對(duì)該酶的水解活力有明顯的抑制作用，使該酶水解活力喪失20%～40%不等，而對(duì)γ-環(huán)化活力影響較小。Ca2+激活作用主要是因?yàn)棣?CGTase也屬于α-淀粉酶家族中的成員。

a-金屬離子對(duì)γ-CGTase的水解活力影響；b-金屬離子對(duì)γ-CGTase的γ-環(huán)化活力影響圖6 金屬離子對(duì)γ-CGTase酶活力影響Fig.6 Effect of metal ions on the enzyme activity of the γ-CGTase

2.3 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

以γ-環(huán)化活力為依據(jù)，進(jìn)行測(cè)定計(jì)算。米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速率(Vmax)是酶非常重要的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。從Km可以判斷底物和酶的親和關(guān)系，Vmax可以判斷出酶的催化效率。通過(guò)計(jì)算，該酶的Km為(50.42±2.45) mg/mL，Vmax為(1.36±0.68) mg/(mL·min)。與鄭丹妮等[16]研究的來(lái)源于Bacillussp. FJAT-44876動(dòng)力學(xué)參數(shù)相比，Vmax值較高，說(shuō)明該酶催化能力較強(qiáng)。

2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)γ-CD產(chǎn)量的影響

適合的乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)環(huán)糊精葡萄糖轉(zhuǎn)移酶有促進(jìn)作用，不僅可以提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，也可以提高產(chǎn)物專一性。圖7中α-CD、β-CD和γ-CD標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度均為10 mg/mL。由圖可知，該酶產(chǎn)物中沒(méi)有α-CD，主產(chǎn)γ-CD。10%乙醇體積分?jǐn)?shù)的反應(yīng)體系，不僅γ-CD產(chǎn)量增加了89.91%，而且γ-CD/β-CD由7.70提高至13.38，增大了73.77%，使得γ-CD的合成比率達(dá)到93.05 %。因此，乙醇對(duì)該酶也具有提高產(chǎn)物產(chǎn)量和增強(qiáng)特異性效果。

圖7 乙醇對(duì)γ-CGTase催化產(chǎn)物特異性的影響Fig.7 Effect of ethanol on enzyme catalytic specificity of γ-CGTase

不同的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)要求不同，鄭丹妮等[16]研究Bacillussp.FJAT-44876來(lái)源的γ-CGTase最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%，花敬涵[18]研究的Bacilluscereus來(lái)源的β-CGTase最佳乙醇添加量為25%，換算乙醇體積分?jǐn)?shù)應(yīng)為20%。如圖8可見，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，γ-CD產(chǎn)量增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到15%時(shí)，產(chǎn)量達(dá)最大值。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，淀粉的溶解度受到影響，降低了淀粉利用度。原因如同王亮等[19]的解釋，乙醇可提高酶的催化效率，添加適量的乙醇可以增加CGT酶與淀粉的結(jié)合位點(diǎn)提高其環(huán)化作用的效率，同時(shí)減少酶表面的水分含量或受體分子的量來(lái)阻礙CGT酶對(duì)CD的降解，對(duì)于偶合反應(yīng)和水解反應(yīng)起到一定的抑制作用，最終使CD的產(chǎn)率得到提高。

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)γ-CGTase催化產(chǎn)物γ-CD產(chǎn)量影響Fig.8 Effect of ethanol concentration on the γ-CD production of the γ-CGTase

2.5 底物種類對(duì)產(chǎn)物特異性影響

由圖9可知，γ-CGTase催化不同淀粉的產(chǎn)物特異性不同。以豌豆淀粉為底物，得到的γ-CD/β-CD為12.92，且γ-CD轉(zhuǎn)化率最高19.10%。與可溶性淀粉相比，可溶性淀粉的γ-CD/β-CD是7.92，γ-CD轉(zhuǎn)化率是15.54%，分別提高了63.13%和22.90%。其次是木薯淀粉、葛根淀粉和小麥淀粉均比可溶性淀粉和玉米淀粉的γ-CD轉(zhuǎn)化率高。而γ-CD/β-CD與γ-CD轉(zhuǎn)化率并不一致，葛根淀粉≈木薯淀粉>豌豆淀粉≈玉米淀粉>小麥淀粉≈可溶性淀粉。因此，不同淀粉的組成和結(jié)構(gòu)對(duì)γ-CGTase催化產(chǎn)物特異性有較大影響。

圖9 不同淀粉催化后γ-CD轉(zhuǎn)化效果比較Fig.9 Comparison of conversion effects of γ-CD from different starches

MATIOLI等[20]以麥芽糊精、大米、馬鈴薯、木薯、玉米淀粉為底物，結(jié)果表明玉米淀粉是生產(chǎn)γ-CD的最佳底物。王磊[21]比較了玉米、馬鈴薯、木薯和可溶性淀粉，結(jié)果表明馬鈴薯淀粉與可溶性淀粉優(yōu)于其他淀粉。王金鵬等[22]同樣對(duì)比了玉米、馬鈴薯、木薯和可溶性淀粉，結(jié)果卻顯示木薯淀粉>玉米淀粉>馬鈴薯淀粉>可溶性淀粉。這些差異主要與γ-CGTase酶和不同淀粉顆粒作用方式不同有關(guān)。BENAVENT-GIL等[23]通過(guò)研究CGTase酶催化玉米和馬鈴薯淀粉作用機(jī)理，發(fā)現(xiàn)玉米淀粉和馬鈴薯淀粉水解導(dǎo)致顆粒表面不同，玉米淀粉表面有序性和結(jié)晶度低，從而更有利于CGTase酶對(duì)玉米淀粉的催化作用。關(guān)于不同淀粉與CGTase酶的催化效果尚存在爭(zhēng)議，應(yīng)從不同淀粉組成與結(jié)構(gòu)上分析酶催化機(jī)制。

3 結(jié)論

本研究克隆來(lái)源B.clarkii7364的γ-CGTase基因并構(gòu)建了1株E.coliBL21/pET28a(+)-γ-CGTase 重組菌。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)鎳柱純化，SDS-PAGE測(cè)得γ-CGTase分子質(zhì)量為78 kDa，其水解與環(huán)化活力趨勢(shì)相同，但存在差異。水解酶的活力測(cè)定方法快速簡(jiǎn)便，可以用于酶活力表達(dá)測(cè)試。γ-CGTase的環(huán)化活力比水解活力高，且溫度穩(wěn)定性強(qiáng)，而適堿性則水解活力比環(huán)化活力高，環(huán)化活力最適條件為9～10。該酶催化各種淀粉產(chǎn)物中幾乎無(wú)α-CD，主產(chǎn)物為γ-CD，屬于γ-CGTase。乙醇對(duì)該γ-CGTase具有提高催化效率、增強(qiáng)產(chǎn)物特異性作用，10%乙醇體積分?jǐn)?shù)可提高γ-CD產(chǎn)量89.91%，γ-CD/β-CD提高73.77%，使得γ-CD的合成比率達(dá)到93.05%。不同淀粉做催化底物,制備γ-CD的能力有較大差異。綜合比較，豌豆淀粉表現(xiàn)出較明顯優(yōu)勢(shì)，γ-CD純度較高且轉(zhuǎn)化率明顯高于其他淀粉。雖然通過(guò)添加有機(jī)溶劑和篩選底物可以有效提高γ-CD產(chǎn)量和質(zhì)量，但是γ-CD轉(zhuǎn)化率低仍然是實(shí)驗(yàn)中存在的主要問(wèn)題。后續(xù)可通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化催化條件，提高γ-CD轉(zhuǎn)化率，為酶法制備γ-CD提供科學(xué)的參考依據(jù)。