Central-Composite Design 響應(yīng)面實驗設(shè)計用于金盞菊提取工藝的研究

時 宇，成永燕，劉芷萱，劉睿姿，孫 政，遲夢辰

（山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），齊魯制藥集團(tuán)有限公司，山東濟(jì)南 250000）

金盞菊為來源于菊科盞菊屬植物金盞菊的干燥全草，具有清熱解毒、涼血調(diào)經(jīng)之功效[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金盞菊具有良好的抗炎、抗菌及抗氧化作用，被廣泛用于食品、化妝品及醫(yī)療領(lǐng)域。金盞菊中主要包含黃酮類、皂苷類及揮發(fā)油等多種化學(xué)成分[3]。有效成分作為中藥發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，如何最大限度地提取藥材中的有效成分是充分利用中藥的首要前提。因而，其提取工藝的研究成為中藥制劑研究的重要內(nèi)容之一。

在提取工藝的優(yōu)化過程中，需要考察不同因素、不同水平對有效成分提取效率的影響，該過程往往是涉及多因素、多水平、多目標(biāo)的復(fù)雜過程，而目前應(yīng)用較多的優(yōu)化方法大多采用單因素實驗設(shè)計或正交實驗設(shè)計，不能全面、綜合地反映提取工藝的優(yōu)劣。中心組合設(shè)計（Central Composite Design，CCD）作為效響應(yīng)面實驗設(shè)計的一種，通過建立因素與響應(yīng)值之間的數(shù)學(xué)擬合方程，能夠結(jié)合統(tǒng)計學(xué)分析尋求最佳工藝參數(shù)。近年來，該方法被廣泛用于藥材的提取工藝及處方設(shè)計的優(yōu)化研究中[4-5]。

本實驗擬采用中心組合設(shè)計，以金盞菊中有效成分總黃酮及浸出物為考察指標(biāo)，對其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期確定金盞花的最佳提取工藝，為金盞菊開發(fā)和利用提供實驗方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

電子天平[BT25S，賽多利斯儀器（北京）有限公司]；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；紫外可見光分光度計（UV-8000A，上海元析儀器有限公司）。

金盞菊藥材購于漱玉平民大藥房，經(jīng)鑒定為菊科植物金盞菊的全草；蘆丁對照品，購于中國食品藥品檢定研究院（批號100080-202012）；無水乙醇、三氯化鋁等所用試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 金盞菊提取工藝條件CCD 實驗設(shè)計

根據(jù)中心組合響應(yīng)面實驗設(shè)計的原理，利用Design-Expert?軟件以總黃酮得率及浸膏得率為響應(yīng)值，以藥材與提取溶劑的比例（料液比）、乙醇濃度、提取溫度為自變量，設(shè)計3 因素3 水平的響應(yīng)面試驗，對金盞菊的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。金盞菊提取工藝條件CCD 實驗設(shè)計的因素水平見表1。

表1 CCD 實驗設(shè)計因素水平表

1.2.2 供試品溶液配制

精密稱取金盞菊藥材粉末5.0 g，按照表2 中實驗設(shè)計安排分別加入不同濃度的乙醇溶液，回流提取2 次，濾過后合并兩次濾液定容至250 mL 容量瓶中，作為供試品溶液備用。

1.2.3 浸膏得率的測定

精密量取1.2.2 項下供試品溶液10.0 mL 置于已知質(zhì)量（M1）的蒸發(fā)皿中，水浴加熱蒸干，105 ℃烘箱中干燥4 h 直至恒重（M2），則浸出物的質(zhì)量為M2-M1。因此，

1.2.4 總黃酮含量的測定

（1）對照品溶液的制備。精密稱取蘆丁對照品4.04 mg 置于10 mL 容量瓶中，乙醇溶解并稀釋至刻度，制備成濃度為0.404 mg/mL 的蘆丁對照品溶液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。分別精密量?。?）項中蘆丁對照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 和1.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，加入1%三氯化鋁乙醇溶液5.0 mL，乙醇定容至刻度。隨后置于50 ℃水浴中顯色10 min[6]。以乙醇作為空白，在200 ～800 nm波長下進(jìn)行光譜掃描，確定最大吸收波長為418 nm。在418 nm 波長下測定吸光度，以吸光度值為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）供試品溶液的測定。精密量取1.2.2 項下供試品溶液5.0 mL，加入1%三氯化鋁乙醇溶液5.0 mL，50 ℃水浴中顯色10 min。以乙醇作為空白，于418 nm 波長下測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)紫外分光光度計測定蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=23.418C+0.017 6(R=0.999 7)。結(jié)果表明，蘆丁在8.08 ～40.40 μg/mL 線性關(guān)系良好。

2.2 精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性實驗

精密移取蘆丁對照品溶液0.5 mL 于容量瓶中，按1.2.3（2）項下方法進(jìn)行操作，測定其吸光度值，連續(xù)測定6 次，計算RSD 值為0.82%，表明儀器精密度良好。將上述溶液每隔15 min 測定其吸光度考察穩(wěn)定性，計算RSD 值為1.79%，表明該顯色反應(yīng)在2 h 內(nèi)穩(wěn)定。取同一批次樣品6 份，按上述方法進(jìn)行重復(fù)性實驗，計算RSD 值為1.31%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3 加樣回收率實驗

取已知黃酮含量的金盞菊粉末6 份，每份0.5 g，精密稱定，加入蘆丁對照品2.5 mg，按照供試品溶液制備方法及顯色方法操作，測定總黃酮含量，計算加樣回收率，結(jié)果表明平均回收率為96.5%，RSD為2.35%。

2.4 最佳提取工藝條件的確定

根據(jù)Design expert 軟件所安排的實驗，測定每個實驗組的總黃酮含量及浸膏得率，結(jié)果見表2。

表2 CCD 實驗設(shè)計方案及結(jié)果安排表

將所得的實驗結(jié)果進(jìn)行方差分析并擬合數(shù)學(xué)模型，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)值模型方程擬合結(jié)果

由回歸方程模型的R2值及P值可知，二項式方程模型的擬合度和可信度良好，實驗誤差小。以總黃酮含量為考察指標(biāo)時，其方程為：Y1=0.672 1+0.038 0X1+0.18 10X2+0.052 0X3+0.010 0X1X2+0.007 5X1X3+0.042 5X2X3-0.026 2X12-0.051 2X22+0.003 8X32（R2=0.882 1）。以浸出物得率為考察指標(biāo)時，其回歸方程為：Y2=4.52+0.363 0X1+0.181 0X2+0.101 0X3+0.240 0X1X2+0.012 5X1X3-0.087 5X2X3+故可用上述模型方程分析和預(yù)測金盞菊的提取工藝。

根據(jù)所擬合的二項式方程，繪制各考察因素對總黃酮和浸膏得率的三維效應(yīng)曲面圖，結(jié)果見圖1、圖2。由圖1 可知，隨乙醇濃度的增加，總黃酮含量呈顯著增加趨勢，而料液比及提取時間對其影響不大，曲面上升趨勢較為平緩，這可能與黃酮在高濃度乙醇中溶解度較大有關(guān)，同時因為金盞花質(zhì)地較為疏松，提取溶劑容易滲透到藥材內(nèi)部，會更快達(dá)到動態(tài)平衡，故料液比及提取時間對總黃酮的提取影響不大。

圖1 料液比、乙醇濃度及提取時間對金盞菊總黃酮提取率影響的三維效應(yīng)曲面圖

圖2 料液比、乙醇濃度及提取時間對金盞菊浸膏得率影響的三維效應(yīng)曲面圖

由圖2 可知，乙醇濃度及料液比對浸膏得率的影響呈現(xiàn)馬鞍狀分布，呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。

由預(yù)先設(shè)定的限定條件，即希望總黃酮含量及浸膏得率保持最大浸出量，分析料液比、乙醇濃度及提取時間對金盞菊提取工藝的影響。由Design expert軟件確定金盞菊的最優(yōu)提取工藝條件為藥材與溶劑的比例為1 ∶12，乙醇濃度為68%，提取時間為1.8 h，共提取兩次。在此條件下，總黃酮含量和浸膏得率的預(yù)測值分別為0.86%和5.16%。

2.5 驗證實驗

在最優(yōu)條件下進(jìn)行3 次平行實驗以檢驗CCD 實驗設(shè)計的可靠性，所得到的金盞菊總黃酮含量和浸膏得率分別為0.83%和5.12%，與預(yù)測值接近，說明預(yù)測模型具有良好的可靠性。

3 結(jié)論

中心組合響應(yīng)面實驗設(shè)計能夠更全面地表征各工藝參數(shù)對實驗結(jié)果的影響，尤其是適合于多因素連續(xù)變量對響應(yīng)值的影響[7]。在本實驗中，利用CCD響應(yīng)面實驗設(shè)計，將總黃酮含量及浸膏得率作為響應(yīng)值，將其限定為“最大值”進(jìn)行優(yōu)化，通過數(shù)學(xué)模型擬合獲得最優(yōu)提取工藝條件，能夠克服正交實驗及均勻?qū)嶒炘O(shè)計單一線性模型的不足。實驗結(jié)果表明，金盞花最佳提取工藝條件為藥材∶溶劑（1∶12），乙醇濃度68%，提取時間1.8 h，提取兩次，此條件下總黃酮含量和浸膏得率的預(yù)測值分別為0.86%和5.16%。該最佳工藝能夠較大程度提高金盞菊中指標(biāo)成分的提取效率，為其進(jìn)一步開發(fā)利用及產(chǎn)品深加工提供理論基礎(chǔ)及實踐依據(jù)。