HPLC-DAD 波長切換同時測定雞精中兩種合成著色劑

唐 莉，許艷萍

（鎮(zhèn)江市食品藥品監(jiān)督檢驗中心，江蘇鎮(zhèn)江 212000）

食物色澤豐富，會增加人的食欲，使人心情愉悅。適量加入符合標準規(guī)定的食用著色劑，可以滿足各類消費者對色澤的不同要求，從而使得食物的特征風味直觀鮮明，讓人充滿對食物味道的想象，從視覺、嗅覺、味覺上充分吸引顧客。黃色能產(chǎn)生令人振奮的效果，刺激大腦活動情況，讓人感受到溫暖與舒適，結(jié)合雞精配料表中的雞肉粉，讓人聯(lián)想到那一碗冒著熱氣的黃澄澄的雞湯，因此雞精生產(chǎn)企業(yè)會在雞精的配料中添加食用色素。食用色素可分為食用天然色素與食用合成色素。部分合成色素可能具有毒性，但由于多數(shù)合成色素成本低廉、色澤鮮艷、著色力強以及色調(diào)多樣，仍被廣泛應(yīng)用。據(jù)報道，合成色素有致瀉、致癌性，可誘發(fā)支氣管哮喘、蕁麻疹及血管性浮腫等變態(tài)反應(yīng)。為了防止其危害，我國在其使用上都作了嚴格的限制?！妒称钒踩珖覙藴?食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）[1]規(guī)定，固體調(diào)味料中檸檬黃、日落黃限量值均≤0.2 g/kg。

在雞精中涉及的人工合成色素主要是檸檬黃和日落黃兩種，相關(guān)現(xiàn)行的國家標準方法主要為《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》（GB 5009.35—2016）[2]，該標準的適用范圍為飲料、配制酒、硬糖、蜜餞、淀粉軟糖、巧克力豆及著色糖衣制品中合成著色劑的測定，并未包含雞精調(diào)味料。本文在GB 5009.35—2016 的基礎(chǔ)上，經(jīng)參考《水果罐頭中中合成著色劑的測定 高效液相色譜法》（GB/T 21916—2008）[3]（適用于水果罐頭）、《食品中的誘惑紅、酸性紅、亮藍、日落黃的含量檢測 高效液相色譜法》（SN/T 1743—2006）[4]（適用于糖果、飲料）等國家和行業(yè)標準，經(jīng)過大量的實踐，結(jié)合雞精調(diào)味料的特性，建立了一種同時測定雞精調(diào)味料中檸檬黃、日落黃的高效液相色譜法，取得了滿意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，安捷倫1260 Infinity 帶DAD（二極管陣列）檢測器；色譜柱，C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）島津；電子天平，梅特勒，XSE205DU；超聲波清洗器，科導(dǎo)；離心機，賽默飛，ST16；Tube Mill control 研磨機，艾卡；渦旋振蕩器，海門其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 材料與試劑

市場銷售的5 種普通雞精調(diào)味料；甲醇（色譜純）、乙酸銨（色譜純），國藥集團化學試劑有限公司；檸檬黃標準品（CAS：1934-21-0、250 mg/瓶），北京譜析標準技術(shù)有限公司；日落黃標準品（CAS：2783-94-0、250 mg/瓶），北京譜析標準技術(shù)有限公司；聚酰胺粉（過200 目），上海麥克林生化科技有限公司；檸檬酸（分析純）、氨水（分析純）、乙酸（分析純）、鎢酸鈉（分析純）、無水乙醇（分析純）、甲酸（分析純），均為國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 高效液相色譜分析條件

柱溫：30 ℃；檢測波長：0 ～6 min ，428 nm ；6 ～25 min，484 nm。流動相流速和梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相流速和梯度洗脫程序

1.3.2 樣品提取

稱取5 g 左右粉碎均勻的雞精樣品于50 mL 離心試管中，加入30 mL 水，渦旋振蕩2 min，置于60 ℃水浴中超聲20 min，冷卻后定容到50 mL，6 000 r/min離心3 min（對于蛋白含量高的樣品，在定容前加入1 mL10%鎢酸鈉溶液沉淀蛋白），取上清液過0.45 μm濾膜過濾，供液相色譜測定[5]。

1.3.3 標準曲線制作

準確稱取100 mg 檸檬黃、日落黃標準品用水定容至100 mL，配成1 mg/mL 的標準儲備液。逐級稀釋標準儲備液為1.00 μg/mL、3.00 μg/mL、5.00 μg/mL、10.00 μg/mL、20.00 μg/mL 和50.00 μg/mL 6 個濃度，按照上述色譜條件進樣，以各色素峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標作標準曲線。

1.4 結(jié)果計算

試樣中各著色劑含量按如下公式計算：

式中：X為試樣中各著色劑的含量，g/kg；c為從標準曲線上查得進樣液中各著色劑的濃度，μg/mL；V為試樣稀釋總體積，mL；m為試樣質(zhì)量，g；1 000為換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理的選擇與優(yōu)化

市售的5 種雞精，先按照GB 5009.35—2016 中固體的色素提取方法，發(fā)現(xiàn)在聚酰胺吸附過程中呈糊狀，抽濾困難，導(dǎo)致試驗難以進行。后改進方法用提取出色素的溶液吸附[6]，相對國家標準取得了較好的操作效果。但缺點是前處理耗時較長，步驟多，損耗大，高中低3 種濃度下兩種色素回收率在83.2%～91.5%，回收率偏低。

筆者查閱雞精產(chǎn)品的標準[7]和生產(chǎn)工藝，結(jié)合實物配料表，發(fā)現(xiàn)雞精的配料并不復(fù)雜，基質(zhì)對檢測目標物的干擾非常小。另外，雞精顆粒干燥，易溶于水，檸檬黃和日落黃水溶性也較強，根據(jù)這些特性，筆者決定采用直接用高純水在一定溫度下超聲提取的方法，再通過高速離心機離心，沉淀淀粉等物質(zhì)得到較純凈的分析溶液。試驗證明該提取方法對市售的5 種雞精都能比較充分地提取出目標物質(zhì)，色譜峰分離度較好，噪聲和干擾較小，對2 種色素都有較好的回收率，且操作快速簡便。

2.2 色譜條件的選擇

根據(jù)現(xiàn)行國家和行業(yè)標準，流動相均采用甲醇-乙酸銨溶液（0.02 mol/L）。按照GB 5009.35—2016 設(shè)置流動相的梯度洗脫程序，0 ～3 min，甲醇5%～35%；3 ～7 min,甲醇35%～100%；100%繼續(xù)3 min；回到5%，試驗發(fā)現(xiàn)由于流動相的變化速率大，帶來基線的平穩(wěn)度減小，而梯度洗脫程序參照GB/T 21916—2008，流動相的變化速率平緩，和GB 5009.35—2016 的梯度程序相比，基線噪聲和漂移小，在得到較好的峰型和分離的同時，檸檬黃和日落黃的信噪比提高，檢測靈敏度增加。

2.3 檢測波長的選擇和優(yōu)化

在400 ～700 nm 用DAD 檢測器對標準溶液進行光譜全掃描，檸檬黃、日落黃紫外可見光譜圖見圖1。

圖1 檸檬黃（上圖428 nm）、日落黃（下圖484 nm）紫外可見光譜圖

選擇各自最大的吸收波長，檸檬黃波長選擇428 nm，日落黃波長選擇484 nm。根據(jù)此二波長通道的重疊色譜圖，如圖2、圖3 所示，檸檬黃和日落黃在各自的波長內(nèi)響應(yīng)值較大(粗線峰為428 nm，細線峰為484 nm)，提高了檢測的靈敏度，且出峰處基線較平穩(wěn)，有利于定性和定量。

圖2 標準溶液檸檬黃、日落黃各10 μg/mL 色譜圖（二波長重疊）

圖3 樣品溶液加標檸檬黃、日落黃各10 μg/mL 色譜圖（二波長重疊）

根據(jù)峰分離情況設(shè)置波長切換時間程序，在0 ～6 min 為428 nm，檸檬黃出峰后切換波長為484 nm，得到較好的色譜圖和基線，見圖4。最終確定使用該波長程序方法進行標準溶液和樣品的分析。

圖4 波長切換程序下樣品溶液加標檸檬黃、日落黃各10 μg/mL 色譜圖

2.4 標準曲線和檢出限

根據(jù)1.3.3 中的6 個標準溶液繪制標準曲線。以S/N=3，即以3 倍信噪比計算檢測限，以S/N=10，即以10 倍信噪比計算定量限。線性范圍、回歸方程、檢測限、定量限見表2。由表2 可知，檸檬黃和日落黃在1 ～50 μg/mL 的濃度下，相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.999 89 和0.999 99，線性關(guān)系良好，檢出限均為0.15 mg/kg，小于國家標準GB 5009.35—2016 和GB/T 21916—2008 的 檢 出 限，滿 足 檢 測需求。

表2 標準曲線、線性范圍和檢出限

2.5 精密度

按照上述色譜條件對同一雞精樣品平行測定6次，結(jié)果見表3。由表3 可知，RSD 值在1.5%～2.3%，符合實驗室質(zhì)量控制規(guī)范要求，表明該方法具有良好的精密度。市售5 種雞精有2 種配料添加檸檬黃，均未添加日落黃，日落黃均未檢出。

表3 精密度試驗結(jié)果

2.6 回收率

對不含有色素的雞精樣品進行加標，稱取9 份陰性樣品，每份5.0 g，分為3 組，每組添加濃度分別為1.0 μg/mL、10.0 μg/mL、50.0 μg/mL，每個加標水平重復(fù)3 次，計算回收率，見表4。在添加高中低3 種濃度下，樣品加標回收率在93.0%～100.1%，滿足定量分析需求。

表4 回收率試驗結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立了雞精中檸檬黃、日落黃含量測定的高效液相色譜方法，結(jié)果表明該方法測定結(jié)果準確度較高，且前處理簡便迅速，為雞精調(diào)味料、雞粉調(diào)味料及其他類型的復(fù)合調(diào)味料的食品安全監(jiān)督抽檢及其他類型檢驗工作提供了參考。